范斯然，范佳佳，劉 陽，張 卿，邢 宇，秦 嶺

(北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

板栗(CastaneamollissimaBl.)是殼斗科栗屬植物中四大經(jīng)濟(jì)栽培物種之一。板栗富含多種維生素和礦物質(zhì)，是典型的食藥同源植物[1]。板栗果實(shí)由栗蓬、栗殼和栗仁種子組成，栗仁僅占果實(shí)總質(zhì)量的35%～40%[2]，利用過程中產(chǎn)生大量栗蓬、栗殼等廢棄物，已成為產(chǎn)業(yè)中亟待處理和解決的難點(diǎn)。

因?yàn)閭鹘y(tǒng)化學(xué)手段僅能在栗蓬和栗殼中分離或鑒別幾種次生代謝物[3-4]，所以其中次生代謝物的種類了解的還不全面，造成了栗蓬、栗殼等廢棄物利用還僅限于粗提取或僅單一產(chǎn)物純化提取的現(xiàn)狀[5-8]。吳云龍等[9]從板栗栗蓬中分離出2種化合物。趙德義等[10]發(fā)現(xiàn)栗殼中的次生代謝物包括酚類、黃酮等6類。隨著組學(xué)技術(shù)的相繼發(fā)展，使更深入研究板栗果實(shí)次生代謝物的組成成為可能[11]。

本研究以花后成熟板栗栗蓬和栗殼2種組織為研究材料，利用次生代謝組學(xué)方法，分析板栗栗蓬和栗殼的次生代謝物種類及其差異，挖掘其有利用價(jià)值的次生代謝物，為板栗加工產(chǎn)業(yè)廢棄物資源化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和提取方法

以北京懷柔板栗站十五年生‘燕山紅栗’為試材，選取樹勢(shì)一致、無病蟲害，結(jié)果正常的果實(shí)共30個(gè)。采集花后96 d成熟的栗蓬(Bur，BU)和栗殼(Shell，SH)。每種樣品共3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。樣品經(jīng)冷凍干燥后取100 mg粉末，用70%甲醇水溶液溶解過夜，充分震蕩3次。10 000 g，10 min離心并吸取上清液，用0.22μm微孔濾膜過濾后存放于進(jìn)樣瓶中備用。

1.2 質(zhì)譜采集與分析

質(zhì)譜條件參照邁維(武漢)生物技術(shù)有限公司提供的代謝組檢測(cè)質(zhì)譜參數(shù)，并進(jìn)行優(yōu)化[12]。

1.3 質(zhì)控樣本

利用樣本提取物混合制備質(zhì)控樣本，在檢測(cè)分析的過程中每10個(gè)樣本插入一個(gè)質(zhì)控樣本用以檢測(cè)試驗(yàn)的技術(shù)重復(fù)性。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用多元統(tǒng)計(jì)分析，利用變量的重要性投影(variable importance in project，VIP)結(jié)合。并依靠KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異次生代謝物進(jìn)行注釋和通路分類。

1.5 代謝組總成分分析方法

利用軟件Analyst 1.6.3、混樣質(zhì)控QC樣本的總離子流圖本地代謝數(shù)據(jù)庫、三重四級(jí)桿和MultiaQuant軟件MRM代謝物檢測(cè)多峰圖對(duì)檢測(cè)到的次生代謝物進(jìn)行定性定量分析。

1.6 不同組織內(nèi)代謝組學(xué)差異分析方法

1.6.1 主成分分析 對(duì)2種組織的樣本進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖1。共得到5個(gè)主成分，主成分1的貢獻(xiàn)率為78.91%。2種組織樣本在主成分分析圖上分離趨勢(shì)明顯。

1.6.2 正交偏最小二乘判別分析 根據(jù)正交偏最小二乘判別分析模型分析次生代謝組數(shù)據(jù)，建立分析模型(圖2)。模型驗(yàn)證中，原始模型的R2和Q2均大于R2’和Q2’，模型有意義，根據(jù)VIP值分析篩選其差異代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗栗蓬和栗殼次生代謝物

通過對(duì)栗蓬和栗殼試驗(yàn)樣本分析，共檢測(cè)到364種次生代謝物(表1)，其中酚酸類91種、黃酮121種、木脂素和香豆素23種、鞣質(zhì)39種、生物堿24種、萜類20種、其他類的次生代謝物46種。不同質(zhì)控樣本的質(zhì)譜表現(xiàn)一致，試驗(yàn)重復(fù)性良好。

表1 栗蓬和栗殼中次生代謝物種類Tab.1 Statistical table of secondary metabolites in chestnut bur and chestnut shell

2.2 次生代謝物的差異性篩選與分析

2.2.1 次生代謝物成分篩選與分析 為了分析栗蓬與栗殼次生代謝物相對(duì)含量的差異，本研究原始數(shù)據(jù)中的差異倍數(shù)進(jìn)行以2為底的對(duì)數(shù)處理，這里僅列差異最大的10種次生代謝物(表2)。

表2 栗蓬和栗殼差異最大的前10種次生代謝物Tab.2 Ten secondary metabolites with the greatest difference in content between chestnut bur and chestnut shell

基于對(duì)檢測(cè)到的次生代謝物的定量與定性分析，根據(jù)差異倍數(shù)的Log2FC≥1或Log2FC≤-1，且VIP值≥1，初步篩選出組織間差異的次生代謝物133種。其中酚酸類34種、黃酮57種、鞣質(zhì)26種、木脂素和香豆素7種、生物堿3種、萜類1種、其他類5種，占次生代謝物的36.54%。

2.2.2 差異次生代謝物通路分析 差異次生代謝物通路分析見圖3。根據(jù)差異次生代謝物結(jié)果，利用KEGG對(duì)通路進(jìn)行富集結(jié)果分析，點(diǎn)所在的橫坐標(biāo)Rich factor值越大，則表示差異次生代謝物在對(duì)應(yīng)通路中的個(gè)數(shù)與次生代謝組中注釋到的該通路物質(zhì)的個(gè)數(shù)的比值越大。P-value值越小，則表示對(duì)應(yīng)通路富集越顯著。圖中的點(diǎn)越大，則代表富集到的差異次生代謝物個(gè)數(shù)越多。

栗蓬和栗殼差異次生代謝物通過KEGG數(shù)據(jù)庫通路富集，共查詢到26個(gè)差異次生代謝物，其中差異次生代謝物富集最多的通路是(1)黃酮類生物合成途徑：包括白楊素、柚皮素等14種成分，(2)黃酮和黃酮醇的生物合成途徑：包括金合歡素、山柰酚等14種成分，(3)花色苷生物合成途徑：包括天竺葵素 3-O-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-葡萄糖苷等4種成分。

3 討 論

本研究采用次生代謝組學(xué)技術(shù)，以成熟板栗的栗蓬、栗殼為材料，對(duì)次生代謝物進(jìn)行組學(xué)定性定量檢測(cè)與分析，從全部材料中共檢測(cè)到364種次生代謝物，差異次生代謝物133種占次生代謝物的36.54%。

栗蓬相對(duì)于栗殼的次生代謝組中，上調(diào)的成分集中在鞣質(zhì)與酚酸類，典型的如鞣花酸、沒食子酸和單寧的衍生物等。而栗殼相對(duì)于栗蓬，其上調(diào)成分則集中在黃酮類物質(zhì)與原花青素A1上。特別是原花青素A1為栗殼特有，差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)高達(dá)18.08。這些次生代謝物分類與含量上的差異是栗蓬與栗殼在次生代謝組上最根本的區(qū)別。

栗蓬和栗殼次生代謝組中，各有41種和20種特有次生代謝物，二者共占次生代謝物364種的23.10%。對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，共有14種次生代謝物有相關(guān)報(bào)道，大部分具有藥用價(jià)值[13]。其中典型的為抗氧化的山柰酚[14]和有抗癌作用的6-甲基香豆素等[15]。本研究對(duì)檢測(cè)到的板栗果實(shí)栗蓬和栗殼組織中次生代謝物進(jìn)行了初步分析比較，為下一步板栗資源的加工和利用提供了參考。