王福玲，陳麗清，肖蓉，馬慧芳

(內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

0 引言

川崎病(Kawasaki disease，KD)又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，是一種目前病因不明的以急性發(fā)熱、多形性皮疹，頸部淋巴結(jié)腫大等為臨床表現(xiàn)的全身性血管炎綜合征，亞洲地區(qū)多見，好發(fā)于5歲以下幼兒[1]。首次由日本學(xué)者川崎富作報(bào)道，以發(fā)熱、球結(jié)膜充血、口腔黏膜改變、手足硬腫、皮疹、頸部淋巴結(jié)腫大為典型臨床癥狀，此外病變易累及全身中小血管，其中較為嚴(yán)重的是累及冠脈血管，不僅可引發(fā)血管炎、冠狀動(dòng)脈損害(Coronary artery lesions，CAL)，部分嚴(yán)重病例可形成巨大冠狀動(dòng)脈瘤，甚至較少部分患兒存在冠狀動(dòng)脈狹窄與血栓形成、猝死等，且兒童時(shí)期發(fā)生的CAL可增加成年早期發(fā)生心肌缺血、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)[2]，因此KD所致CAL是目前臨床治療非常棘手的嚴(yán)重問題，尋找其病因，改善患兒預(yù)后更是刻不容緩。

近年來，根據(jù)大量KD的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，KD的發(fā)生與其遺傳性及地區(qū)特異性有著重要聯(lián)系。且經(jīng)過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)與全基因組連鎖的分析研究[3]，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因的SNP位點(diǎn)參與KD的發(fā)生發(fā)展，故推測KD的發(fā)生與遺傳性有關(guān)。髓過氧化物酶(MPO)是在中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中發(fā)現(xiàn)的氧化酶，是血紅素過氧化物酶家族成員之一，是中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)志物，大量研究證實(shí)MPO通過氧化參與血管炎癥的發(fā)生、發(fā)展[4]。臺灣學(xué)者發(fā)現(xiàn)該基因與KD易感性相關(guān)[5]，大陸僅見熊志[6]、趙宗秀[7]兩位學(xué)者報(bào)道該基因與KD易感性關(guān)系，且觀點(diǎn)不一致。由于地域及人群的差異，本研究探討內(nèi)蒙古中部地區(qū)漢族KD兒童的MPO基因rs2333227位點(diǎn)的多態(tài)性與KD易感性及其KD臨床特點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年10月至2019年1月連續(xù)在內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院住院診斷KD且規(guī)范治療的75例患兒為病例組。在相同時(shí)期選擇75例在內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院兒?？平】刁w檢兒童為對照組(均排除心、肺、肝、腎及血液系統(tǒng)疾病)。病例組根據(jù)心臟超聲有無累及冠狀動(dòng)脈，將KD患兒歸為CAL組，NCAL組。

川崎病診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：

發(fā)熱至少五天，至少五種主要臨床特征中的四種：

(1)雙眼結(jié)膜充血，非化膿性；

(2)口腔和嘴唇的變化：裂開和紅斑的嘴唇，草莓舌；

(3)多形性皮疹：斑丘疹樣、多形性紅斑或猩紅斑樣皮疹等多見，累及四肢、軀干和會陰；

(4)四肢的變化：多在第2周和第3周出現(xiàn)手足紅斑，手部和足部硬腫；

(5)常有一側(cè)的淋巴結(jié)發(fā)生腫大(直徑＞1.5厘米)，為非特異性改變。

除外其他系統(tǒng)疾病(如藥物過敏、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、葡萄球菌燙傷皮膚綜合征、猩紅熱、病毒感染等確診為KD。

冠狀動(dòng)脈損害診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]：

(1)冠脈內(nèi)徑Z值2.0-2.5是近端冠脈的臨界值，故遠(yuǎn)端冠脈及其他非冠脈血管須大于等于相鄰近血管內(nèi)徑的1.5倍被定義為冠脈異常。

(2)依據(jù)Z值對冠狀動(dòng)脈異常的分類：①無受累：Z值＜2；②僅擴(kuò)張：Z值2～＜2.5；或初始Z值＜2，隨訪中Z值下降幅度≥1；③小型冠狀動(dòng)脈瘤：Z值≥2.5～＜5；④中型冠狀動(dòng)脈瘤：Z值≥5～＜10；且內(nèi)徑絕對值＜8mm；⑤巨大冠狀動(dòng)脈瘤：Z值≥10，或內(nèi)徑絕對值≥8mm。

明確KD診斷后均給予靜點(diǎn)丙種球蛋白2g/(kg·d)及口服阿司匹林規(guī)范治療。入選的150例研究對象均為我區(qū)無血緣關(guān)系的漢族兒童，且籍貫在內(nèi)蒙古地區(qū)，本研究已得到內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會準(zhǔn)許，并取得所有研究對象的監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 KD 患兒臨床資料收集

收集KD患兒發(fā)病初期的一般臨床資料，包括性別、年齡、皮疹、口腔黏膜病變、手足水腫等癥狀，以及患兒生化、心臟超聲以及影像的資料。

1.2.2 MPO 基因多態(tài)性分析

使用一次性含有乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管抽取研究對象靜脈血2mL，對兩組血液標(biāo)本分別標(biāo)記(病例組A1-A75，對照組D1-D75)，并立即放置在冰箱中-80℃存儲，半年內(nèi)將標(biāo)本外送至北京六合華大基因公司進(jìn)行基因測序檢測。通過康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)的血液基因試劑盒從血中提取DNA，根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for Biotechnologyinformation，NCBI)公布的MPO基因序列針對rs2333227位點(diǎn)，使用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)含有單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)的引物，上游引物為：5’-TTCAAGCGATTCTTCTGC-3’；下游引物為：5’-AGGGTCCTCCTTCCTGTG-3’。PCR總反應(yīng)體系50μL，含有10倍PCR反應(yīng)緩沖液5μL，dNTP混合液4μL，上下游引物各1μL，EX公司Taq酶1.25U；反應(yīng)條件：循環(huán)條件為：95℃ 15s→(95℃ 15s →50℃ 5s→60℃ 90s)×35cycles→終止反應(yīng)。分別取2μL擴(kuò)增的產(chǎn)物利用內(nèi)切酶BstN I進(jìn)行酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 20.0 (SPSS Inc.，Chicago，USA)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用(±s)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，正態(tài)性檢驗(yàn)采用單樣本K-S擬合優(yōu)度法，兩組均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，不服從正態(tài)分布的組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，統(tǒng)計(jì)推斷采用χ2檢驗(yàn)。運(yùn)用Haploview軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)病例組和對照組及CAL和NCAL組，均符合該定律(P＜0.05)?；蛐皖l率和等位基因頻率分布應(yīng)用頻數(shù)和百分率(%)表示。采用logistic回歸分析探討MPO基因rs2333227位點(diǎn)多態(tài)性對KD及KD并發(fā)CAL的影響，KD與其基因型及等位基因型患病的相對風(fēng)險(xiǎn)比用比值比(odds ratio，OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)表示，其中OR值大于1表示該等位基因或基因型是一個(gè)危險(xiǎn)因素，危險(xiǎn)程度與OR值大小呈正比，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般情況

病例組：男性45例，女性30例，其中0～1歲25例(33.33%)，1～3歲41例(54.67%)，≥3歲9例(12.00%)，年齡為(1.80±1.26)歲。CAL組中男性21例，女性15例，平均年齡為(1.80±1.23)歲；NCAL組中有男性24例，女性15例，平均年齡為(1.79±1.32)歲。

對照組：年齡3月～6歲，其中0～1歲31例(41.33%)，1～3歲35例(46.67%)，≥3歲9例(12.00%)，男性40例，女性35例，年齡為1.78±1.33歲。兩組組間年齡和性別比例分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 病例組與對照組MPO基因

rs2333227位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率分布的比較，病例組和對照組MPO基因rs2333227位點(diǎn)等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.387，P=0.169)，GG、GA和AA基因型頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.316，P=0.339)，詳見表1及表2。

表1 病例組和對照組MPO基因rs2333227位點(diǎn)的等位基因頻率[n(%)]

表2 病例組和對照組MPO基因rs2333227位點(diǎn)的相關(guān)性分析[n(%)]

2.3 MPO 基因多態(tài)性與KD 臨床特點(diǎn)的相關(guān)性

MPO基因rs2333227多態(tài)性與KD臨床特征的相關(guān)性分析結(jié)果表明，皮疹、唇及口腔表現(xiàn)、手足癥狀、球結(jié)膜充血、淋巴結(jié)腫大、WBC、中性粒細(xì)胞百分比、血沉、CRP及BNP在基因型GG和GA+AA組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，詳見表3及表4。

表3 MPO基因rs2333227多態(tài)性與KD臨床特征的相關(guān)性分析[n(%)]

表4 MPO基因rs2333227多態(tài)性與KD輔助檢查的相關(guān)性分析(±s)

表4 MPO基因rs2333227多態(tài)性與KD輔助檢查的相關(guān)性分析(±s)

GG(n=54) GA+AA(n=21) t P WBC(109/L) 15.19±5.60 16.47±6.32 0.625 0.521中性粒細(xì)胞百分比(%) 63.21±21.10 58.05±17.08 0.688 0.611血沉(mm/h) 62.40±24.10 64.20±28.00 0.172 0.812 CRP(mg/L) 75.15±40.07 54.15±30.19 1.372 0.192 BNP(pg/L) 862.50±390.85 500.61±218.60 1.767 0.069

2.4 CAL組和NCAL組 MPO基因 rs2333227位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率分布的比較

KD中CAL組和NCAL組的MPO基因rs2333227位點(diǎn)等位基因頻率分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=6.055，P=0.015)，GG、GA和AA基因型頻率分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.602，P=0.009)，詳見表5及表6。與GA和AA基因型相比，GG基因型增加CAL的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(OR：4.65，95%CI：1.486-14.576)。

表5 KD中CAL組和NCAL組的MPO基因rs2333227位點(diǎn)的等位基因頻率[n(%)]

表6 KD中CAL組和NCAL組的MPO基因rs2333227位點(diǎn)的相關(guān)性分析[n(%)]

3 討論

KD的病因尚未明確，近些年來，越來越多的證據(jù)表明KD存在明顯的種族差異與地域區(qū)別，亞裔兒童及亞洲的發(fā)病率最高，說明遺傳因素可能是發(fā)揮了重要作用。其中，關(guān)于MPO基因的研究早在2001年因其與冠狀動(dòng)脈疾病的關(guān)系較為顯著而受到重視。髓過氧化物酶(MPO)是過氧化物酶亞家族的成員，位于人第17號染色體q23區(qū)域，分子量為140 kDa，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要由11個(gè)內(nèi)含子和12個(gè)外顯子組成，MPO作為白細(xì)胞分泌的一種酶，導(dǎo)致氧化過激，過度激活機(jī)體免疫應(yīng)答系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫功能紊亂，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，最終導(dǎo)致血管炎性改變，其中冠狀動(dòng)脈的損傷較為多見，故MPO的任何異常表達(dá)和釋放都可能加重炎癥和組織的損傷[10]，大量研究證實(shí)MPO通過氧化參與血管炎癥的發(fā)生、發(fā)展，是血管炎癥的重要生物標(biāo)志物之一[11]，對早期預(yù)警心血管疾病有重要作用。

SU等[12]為了確定MPO是否能識別和確認(rèn)血管炎小鼠模型中血管壁炎癥的部位，在研究26只KD小鼠的過程中，使用血管磁共振成像成功識別了血管炎區(qū)域，證實(shí)了MPO是血管炎炎癥的生物標(biāo)志物，進(jìn)一步表明MPO在KD的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。這些發(fā)現(xiàn)均表明，MPO可能在KD引起的炎癥中起重要作用。該位點(diǎn)主要存在于中性粒細(xì)胞的溶酶體中，產(chǎn)生高濃度的活性氧，可調(diào)控MPO基因的活性，進(jìn)而過量產(chǎn)生ROS可引起DNA損傷[13]。Piedrafita FJ、Tang等[14-15]發(fā)現(xiàn)MPO基因rs2333227位點(diǎn)G等位基因的表達(dá)水平較A等位基因強(qiáng)。

近年來，臺灣人Weng KP、國內(nèi)趙宗秀、熊志研究證實(shí)[5-7]，MPOrs2333227位點(diǎn)多態(tài)性與KD的易感關(guān)系較為密切，G的等位基因頻率顯著高于對照組。本研究結(jié)論該基因SNP與內(nèi)蒙古中部地區(qū)漢族兒童的川崎病易感性無明顯相關(guān)性，結(jié)果不盡相同。趙宗秀(研究對象四川成都)認(rèn)為MPO基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性可能與KD患兒冠狀動(dòng)脈損傷的發(fā)生有關(guān)，其中G等位基因可能是風(fēng)險(xiǎn)因子。熊志(研究對象湖北)顯示該SNP位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)膜充血、皮疹、冠狀動(dòng)脈損傷肝臟腫大、脾臟腫大、小葉性肺炎等影像學(xué)特點(diǎn)無關(guān)，攜帶有GG基因型的患兒發(fā)生手足水腫、腹腔積液的比例較其他基因型患兒高。本研究中發(fā)現(xiàn)KD的典型臨床表現(xiàn)(如皮疹、唇及口腔表現(xiàn)、手足癥狀、球結(jié)膜充血、淋巴結(jié)腫大)中與MPO基因rs2333227位點(diǎn)的各基因型無明顯相關(guān)性，但攜帶GG基因型患兒增加CAL的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。臨床表現(xiàn)及冠狀動(dòng)脈損害之間的關(guān)系結(jié)果不完全相同，但均顯示GG基因型患兒為高風(fēng)險(xiǎn)因子。

關(guān)于基因與KD的易感性及其并發(fā)CAL的相關(guān)性在國內(nèi)外近幾年已研究發(fā)現(xiàn)出多種基因，而目前關(guān)于單一致病基因?qū)膊“l(fā)生的影響的相關(guān)研究可能較少，結(jié)合此次研究內(nèi)蒙古中部地區(qū)漢族兒童，樣本例數(shù)少，實(shí)驗(yàn)條件較為局限性，各種與氧化應(yīng)激有關(guān)的生物標(biāo)志物和中性粒細(xì)胞活化也未得到評估，且KD本身存在地區(qū)差異，MPO基因SNP rs2333227位點(diǎn)與KD的臨床表現(xiàn)及KD并發(fā)CAL的關(guān)系尚需大樣本、多中心的研究，建議進(jìn)一步對獨(dú)立大群體進(jìn)行復(fù)制研究。