蔚慧欣，秦丹，王燕*，張志旭

（1.山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術(shù)中心，山西 汾陽(yáng) 032205；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

中國(guó)白酒釀造是一種古老的食品發(fā)酵技術(shù)，也是一種多菌種參與的固態(tài)發(fā)酵技術(shù)體系。汾酒以其獨(dú)特的固態(tài)發(fā)酵釀造環(huán)境，造就了具有獨(dú)特生理性能的微生物菌群，在白酒發(fā)酵中起著關(guān)鍵作用[1-2]。近年來(lái)，基于高通量測(cè)序結(jié)果研究表明，汾酒發(fā)酵過(guò)程主要包括2個(gè)階段：階段I（0～7 d），乳桿菌和畢赤酵母是豐度最高的微生物；階段II（7 d～28 d），耐酸乳桿菌和釀酒酵母是豐度最高的微生物。其中耐酸乳桿菌的數(shù)量與白酒中乳酸乙酯的數(shù)量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系[3-4]，芽孢桿菌在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程占比維持穩(wěn)定，參與風(fēng)味物質(zhì)的形成。因此，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中耐酸乳桿菌、芽孢桿菌和酵母菌的生物量可以為產(chǎn)品品質(zhì)的人工調(diào)控提供更為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步利用特定微生物資源以及控制發(fā)酵代謝的深入研究做好基礎(chǔ)鋪墊。

白酒釀造過(guò)程中微生物群落組成復(fù)雜，隨著發(fā)酵的進(jìn)行微生物菌群組成會(huì)發(fā)生變化。采用可培養(yǎng)技術(shù)檢測(cè)原位系統(tǒng)微生物菌群組成較為困難，無(wú)法準(zhǔn)確分析微生物之間以及微生物與環(huán)境之間的相互關(guān)系[5]。高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物多樣性及其動(dòng)態(tài)的研究并不全面，無(wú)法對(duì)真菌和細(xì)菌同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是將普通PCR和光譜分析、實(shí)時(shí)檢測(cè)等手段巧妙結(jié)合到一起的一項(xiàng)技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，已被成功用于復(fù)雜微生物群落中微生物的定量分析，如魏娜等[6]應(yīng)用qPCR對(duì)濃香型白酒窖泥中優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行研究。已有學(xué)者采用微生物純培養(yǎng)技術(shù)、變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）和高通量測(cè)序技術(shù)等對(duì)食醋發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析[7-9]。陳筆等[10]嘗試用qPCR技術(shù)研究白酒發(fā)酵過(guò)程中塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）生物量變化。路虎等[11]利用該技術(shù)定量分析了產(chǎn)土味素的鏈霉菌。但是清香型白酒微生物的定量數(shù)據(jù)報(bào)道較少。

本研究采用qPCR技術(shù)對(duì)汾酒發(fā)酵過(guò)程酒醅中總細(xì)菌、總真菌、耐酸乳桿菌、芽孢桿菌和酵母菌生物量進(jìn)行定量分析，為清香型白酒釀造機(jī)理解析、發(fā)酵工藝過(guò)程控制提供重要參數(shù)[12-14]。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

發(fā)酵過(guò)程酒醅樣品取樣于山西杏花村汾酒廠股份有限公司，采樣時(shí)間點(diǎn)為大茬、二茬發(fā)酵0、7、15、28 d，選擇同一車間4個(gè)班組作為平行樣品，用無(wú)菌袋采樣后迅速放置冰盒內(nèi)，取樣時(shí)間與樣品處理時(shí)間間隔不大于20 min。

1.2 試劑與儀器

RNA 酶（10 mg/mL）、溶菌酶（50 mg/mL）、瓊脂糖、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（均為優(yōu)級(jí)純）：天根生化科技有限公司；引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；鹽酸、乙二胺四乙酸、磷酸鈉、溴化十六烷三甲基銨、氯化鈉、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、無(wú)水乙醇（均為化學(xué)純）：國(guó)藥集團(tuán)股份有限公司；2×Taq MasterMix、Puc-T TA cloning kit、感受態(tài)細(xì)胞DH5α（均為優(yōu)級(jí)純）：康為世紀(jì)生物科技有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTMII（TliRNaseHPlus）ROXplus、DL2000DNAMarker（均為優(yōu)級(jí)純）：寶生物工程（大連）有限公司。

ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀、核酸濃度測(cè)定儀BioSpectrometer?basic：賽默飛世爾科技公司；Power－PacBasic核酸電泳儀：美國(guó)BIO-RAD公司；Geldocit310凝膠成像系統(tǒng)：英國(guó)UVP公司；FMB40制冰機(jī)：日本SANYO公司；RC-6TMPlus離心機(jī)：Eppendorf公司。

1.3 酒醅總DNA的提取

酒醅總DNA提取采用月桂酸鈉法。稱取20 g酒醅，懸浮于180 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，漩渦振蕩，靜置1 min收集上清液。12 000 r/min，4℃離心1 min后收集細(xì)胞沉淀，液氮速凍并充分研磨。將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移到混合裂解液[9]中，渦旋振蕩20 min，加入等體積的抽提液（酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1，體積比），搖勻?；旌弦涸?12 000 r/min，4℃條件下離心10 min，吸取上清液，加入10 μL RNA酶，于37℃靜置30 min，然后加入等體積的抽提液，抽提1次，再加入0.7倍體積異丙醇，置于-20℃，靜置30 min；4℃，12 000 r/min離心20 min，收集沉淀。用70%乙醇洗滌沉淀2次，真空干燥。加入20μL的ddH2O溶解30min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用核酸濃度測(cè)定儀確定DNA濃度，分析A260/A280評(píng)價(jià)DNA純度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA純度及濃度。

1.4 qPCR特異性引物設(shè)計(jì)

針對(duì)酒醅中總細(xì)菌、總真菌、耐酸乳桿菌、芽孢桿菌和酵母菌分別設(shè)計(jì)特異性引物用于qPCR擴(kuò)增，引物名稱及序列見(jiàn)表1[15-17]。

表1 特異性引物的名稱及序列Table 1 The information of specific primer

1.5 酒醅微生物的qPCR定量分析

采用絕對(duì)定量法跟蹤白酒發(fā)酵過(guò)程中微生物的生物量，其中標(biāo)準(zhǔn)品為重組質(zhì)粒，根據(jù)重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的線性關(guān)系構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]。為了使從不同樣品獲得的結(jié)果具有更好的可比性，質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成為模板拷貝數(shù)濃度的公式，公式如下。

CN=M×N/L×D

式中：M為質(zhì)量濃度，g/mL；N為阿佛加德羅常數(shù)，6.02×1023；L為核酸分子長(zhǎng)度（總長(zhǎng)度為靶片段加載體之和），kb；D 為轉(zhuǎn)換因子（dsDNA），6.6×105g/mol·kb。

qPCR反應(yīng)體系如下：2×UltraSYBRMixture10μL，引物各 0.5 μL，模板 2 μL，加 ddH2O 至 20 μL。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個(gè)梯度取2 μL為模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增程序?yàn)樽冃噪A段95℃30 s；循環(huán)階段95℃5 s、60℃40 s，40個(gè)循環(huán)。qPCR擴(kuò)增結(jié)束后通過(guò)熔解曲線分析，驗(yàn)證擴(kuò)增的特異性。

以白酒酒醅樣品DNA為模板進(jìn)行qPCR特異性擴(kuò)增，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酒醅中各類微生物的拷貝數(shù)。每份樣本先稀釋10倍，然后取稀釋液DNA 2 μL作為反應(yīng)量，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線

標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品信息和標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard reference materials and standard curve

結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于熒光定量分析（R2>0.99）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅樣品總DNA的提取

分析采用月桂酸鈉法提取樣品總DNA，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示。

圖1 部分樣品DNA電泳圖Fig.1 The electrophoretogram of parts of sample DNA

由圖1可知，本研究所提取的基因組較為完整。核酸濃度檢測(cè)的A260/A280比值均在1.8至1.9左右，質(zhì)量較好。

2.2 大茬、二茬發(fā)酵過(guò)程中微生物生物量的動(dòng)態(tài)變化

大茬、二茬酒醅發(fā)酵過(guò)程中各類微生物實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線如圖2～圖6所示，生物量的變化如圖7所示。

圖2 總細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品中總細(xì)菌實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線Fig.2 Standard curve and melting curve of total bacteria

圖3 耐酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品中耐酸乳桿菌實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線Fig.3 Standard curve and melting curve of L.acetotolerans

圖4 芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品中芽孢桿菌實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線Fig.4 Standard curve and melting curve of Bacillus

圖5 總真菌標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品中總真菌實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線Fig.5 Standard curve and melting curve of total fungi

圖6 酵母菌標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品中酵母菌的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線Fig.6 Standard curve and melting curve of yeast

圖7 酒醅發(fā)酵過(guò)程中各微生物動(dòng)態(tài)變化曲線Fig.7 Dynamic curve of the microorganism during the fermentation process

汾酒大茬、二茬發(fā)酵過(guò)程中功能微生物前期（0～7 d）演替規(guī)律相似，二茬發(fā)酵中后期菌群呈現(xiàn)顯著衰亡趨勢(shì)。大茬總細(xì)菌的生物量呈上升趨勢(shì)，耐酸乳桿菌和芽孢桿菌的生物量呈先上升后下降趨勢(shì)，分別于第 28、15、7 天達(dá)到最大值（5.53×1016、1.40×1013、1.21×106copies/g酒醅DNA）。二茬總細(xì)菌、耐酸乳桿菌和芽孢桿菌的生物量整體呈先上升后下降趨勢(shì)，分別于第15、15、7 天達(dá)到最大值（1.33×1016、6.77×1012、1.21×106copies/g酒醅DNA）。大茬總真菌在發(fā)酵過(guò)程中呈遞增趨勢(shì)，酵母菌在0～7 d增長(zhǎng)，7 d～15 d下降，隨后增長(zhǎng)至大茬發(fā)酵結(jié)束。大茬總真菌和酵母菌的生物量在發(fā)酵0～7 d差異不大，呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，且均在發(fā)酵結(jié)束達(dá)到最高（1.07×1015、1.56×1014copies/g酒醅DNA）。二茬總真菌和酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中呈先增后減趨勢(shì)。二茬中總真菌和酵母菌的生物量均在第7天達(dá)到最大值（1.51×1015、1.43×1014copies/g酒醅 DNA），第 7 天至發(fā)酵結(jié)束，總真菌和酵母菌的生物量逐漸降低。

在清香型白酒發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌和乳酸菌是豐度最高的兩類微生物，與發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)醇、產(chǎn)酸密切相關(guān)。由圖7可知，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中總細(xì)菌生物量高于總真菌，耐酸乳桿菌的生物量高于酵母菌，采用qPCR方法輔助分析酒醅中優(yōu)勢(shì)菌能夠較全面地反映各發(fā)酵階段微生物群落結(jié)構(gòu)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，地缸內(nèi)逐漸形成厭氧、高濃度的有機(jī)酸和乙醇等特殊環(huán)境[19-20]，大部分微生物由于不能適應(yīng)而衰亡，然而乳酸菌和釀酒酵母菌屬于兼性厭氧菌，且能夠耐受較低的pH值，這些特性可能導(dǎo)致其逐漸成為發(fā)酵酒醅中主要微生物。但在二茬發(fā)酵后期，可能由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗，各菌種的生長(zhǎng)均受到限制，出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

3 討論與結(jié)論

近些年qPCR方法雖然在醫(yī)藥、食品等研究中得到了廣泛的應(yīng)用，但用于檢測(cè)白酒釀造過(guò)程中的微生物生物量還少見(jiàn)報(bào)道。本文針對(duì)汾酒發(fā)酵過(guò)程中功能菌群建立了一套qPCR方法，從基因組提取、設(shè)計(jì)引物、引物專一性驗(yàn)證、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立、方法準(zhǔn)確性的驗(yàn)證，再到生產(chǎn)實(shí)踐的具體應(yīng)用。本研究證實(shí)了耐酸乳桿菌和酵母菌為酒醅中的主體微生物，二者分別占總細(xì)菌和總真菌總和的80%以上。與瀘香型酒、芝麻香型等其他固態(tài)發(fā)酵體系相比，汾酒相應(yīng)微生物菌群生物量除芽孢桿菌外數(shù)量級(jí)均高于前人研究。生物量是表征生物活性的一個(gè)重要指標(biāo)，而白酒釀造微生物主要來(lái)源于大曲，推測(cè)該結(jié)果與汾酒大曲中低溫培制工藝相關(guān)。

傳統(tǒng)白酒固態(tài)發(fā)酵中，微生物菌群的結(jié)構(gòu)與占比受環(huán)境因子以及微生物之間相互作用的影響。熒光定量PCR方法可與預(yù)測(cè)微生物學(xué)相結(jié)合，構(gòu)建具有較強(qiáng)應(yīng)用價(jià)值的數(shù)學(xué)模型，用于解析環(huán)境因素對(duì)微生物組成和生理特性的影響，微生物之間的相互作用關(guān)系，有助于實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程的人工調(diào)控。吳衍廉[13]在研究濃香型酒老窖時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和預(yù)測(cè)微生物學(xué)建立了關(guān)于甲烷細(xì)菌與己酸菌的數(shù)學(xué)模型，開(kāi)發(fā)了甲烷細(xì)菌與己酸菌共窖的二元發(fā)酵技術(shù)，探究?jī)煞N菌在二元發(fā)酵中的數(shù)量變化規(guī)律及環(huán)境對(duì)其發(fā)酵的影響，優(yōu)化了發(fā)酵工藝，降低了發(fā)酵成本。同時(shí)，該定量方法可以為研究釀酒微生物的生態(tài)模型提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為白酒走出地域化提供可能。本研究構(gòu)建了特定類群的快速定量方法，有助于建立針對(duì)不同生產(chǎn)周期新產(chǎn)酒質(zhì)量的科學(xué)、全面的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)體系。