張苗苗，蔡文超，旦巴達(dá)貢，單春會(huì)，李寶坤，肖石高，郭壯*

（1.湖北文理學(xué)院湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；3.湖北澳利龍食品股份有限公司，湖北 宜昌 444100）

發(fā)酵乳制品是原料乳經(jīng)微生物自然發(fā)酵，通過不同的加工方式制作而成，包括酸馬奶、奶酪、乳酒、酥油和馬奶酒等[1]。發(fā)酵乳制品中微生物類群較為豐富，賦予了產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味，因而對(duì)發(fā)酵乳制品中微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析是極為必要的。張冬蕾[2]對(duì)新疆地區(qū)昭蘇縣和特克斯縣酸牛奶樣品中的微生物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為硬壁菌門（Firmicutes），優(yōu)勢(shì)真菌門為子囊菌門（Ascomycota）；優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus），優(yōu)勢(shì)真菌屬為釀酒酵母屬（Saccharomyces）。ALEJANDRO等[3]對(duì)墨西哥塔巴斯科州的牛奶、發(fā)酵乳清、凝乳和成熟奶酪的細(xì)菌進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在原料奶中主要為大球菌屬（Macrococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和水桿菌屬（Hydrobacillus）；乳清、凝乳和奶酪中主要為Streptococcus和Lactobacillus。SESSOU等[4]對(duì)貝寧和尼日爾地區(qū)的Wagashi奶酪和發(fā)酵牛奶進(jìn)行研究同樣發(fā)現(xiàn)，馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces Max）和Saccharomyces是主要酵母菌種。由此可見，不同地區(qū)生產(chǎn)的發(fā)酵乳制品微生物群落結(jié)構(gòu)存在較大的差異。

奶疙瘩是新疆哈薩克族居民經(jīng)常食用的一種傳統(tǒng)乳制品，其生產(chǎn)工藝和濃縮型酸奶或酸奶干酪類似[5]。奶疙瘩的制作多采用手工生產(chǎn)，將自然發(fā)酵的牛（羊）奶去水后自然干燥而成[6]。然而目前關(guān)于奶疙瘩的研究一般集中在生產(chǎn)工藝[7]、風(fēng)味組成[8]以及乳酸菌的分離[9]等方面，而對(duì)其微生物群落結(jié)構(gòu)的研究較少。高通量測(cè)序技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、測(cè)序深度廣和樣本測(cè)序量大的優(yōu)點(diǎn)[10]，目前在酸奶[11]、酸馬奶[12]、駝奶[13]和奶酪[14]等發(fā)酵乳制品中均有了一定的應(yīng)用。新疆維吾爾自治區(qū)哈密地區(qū)，居住的少數(shù)民族眾多，主要有維吾爾族、哈薩克族、回族、蒙古族以及滿族等，是絲綢之路的咽喉，屬典型的溫帶大陸性干旱氣候，為全國(guó)日照時(shí)數(shù)最多的地區(qū)之一[15]。

本研究采用第二代高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)采集自新疆維吾爾自治區(qū)哈密地區(qū)的4份奶疙瘩樣品中的真菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，以期為后續(xù)奶疙瘩的工業(yè)化生產(chǎn)以及優(yōu)良菌種的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

基因組提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；引物SSU0817F/SSU1196R、338F/806R：天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；DNA 聚合酶、dNTPs mix、FastPfu Fly DNA Polymerase、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

VeritiTM96孔梯度PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)AB公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo Fisher公司；CR21N高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；Fluor Chem FC3型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)ProteinSimple公司；MiSeq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；R930機(jī)架式服務(wù)器：美國(guó)DELL公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的采集

奶疙瘩樣品采自新疆維吾爾自治區(qū)哈密地區(qū)伊州區(qū)、伊吾縣和巴里坤哈薩克自治縣牧區(qū)，共采集了4份，編號(hào)分別為H1～H4。在進(jìn)行細(xì)菌和真菌多樣性分析時(shí)為便于區(qū)分，HB1為H1樣品的細(xì)菌編號(hào)，而HF1為H1樣品的真菌編號(hào)，其他樣品編號(hào)規(guī)則一致。

1.2.2 樣品微生物宏基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

在使用試劑盒對(duì)奶疙瘩樣品中微生物宏基因組DNA提取的基礎(chǔ)上，進(jìn)行核苷酸序列的PCR擴(kuò)增。參照董蘊(yùn)等[16]和周書楠等[17]的方法，對(duì)細(xì)菌16S rRNAV3-V4區(qū)和真菌18SrRNAV4-V5區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物郵寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，使用MiSeq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

參照李娜等[18]的方法，將序列進(jìn)行拼接，然后對(duì)拼接好的序列進(jìn)行質(zhì)控和篩選。使用QIIME分析平臺(tái)[19]對(duì)微生物多樣性進(jìn)行分析，使用PyNAST將質(zhì)檢合格的序列對(duì)齊[20]，使用UCLUST劃分得到各分類操作單元 （operational taxonomic units，OTU）[21]，繼而 使用Greengenes[22]和 RDP（ribosomal database project，Release 11.5）[23]數(shù)據(jù)庫(kù)以及SILVA[24]數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)細(xì)菌和真菌的OTU代表性序列進(jìn)行同源性比對(duì)，然后對(duì)Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)3個(gè)Alpha多樣性指標(biāo)進(jìn)行分析，最后對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和優(yōu)勢(shì)真菌屬的相關(guān)性進(jìn)行研究。本研究將存在于所有樣品的OTU定義為核心OTU，將樣品中平均相對(duì)含量大于1.0%細(xì)菌或真菌的門或?qū)俣x為優(yōu)勢(shì)門或?qū)佟?/p>

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究使用Office 2016繪制瀑布圖，使用Origin 2017繪制柱狀圖和散點(diǎn)圖，使用R軟件（v4.2.0）的UpSetR、Waterfall和Corrplot軟件包繪制其他圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶疙瘩中細(xì)菌和真菌Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)可以用來反映樣品中菌群的多樣性，本研究選取Chao1、Simpson和Shannon 3個(gè)常用指數(shù)來分析奶疙瘩樣品中的微生物多樣性。Chao1指數(shù)與群落的豐富度呈正相關(guān)；Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，Shannon指數(shù)越高表示群落多樣性越大，而Simpson指數(shù)越高表示群落多樣性越小[25]。樣品Alpha多樣性指數(shù)見表1。

表1 樣品Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of samples

如表1所示，通過比較Chao1指數(shù)可知，HB2樣品中細(xì)菌的群落豐富度最大，Chao1指數(shù)為798，而HF3樣品中真菌群落豐富度最大，其Chao1指數(shù)為2 969。通過比較Shannon指數(shù)可知，細(xì)菌多樣性HB1>HB4>HB2>HB3，真菌多樣性HF3>HF2>HF1>HF4。由表1還可知，不同奶疙瘩樣品間的微生物多樣性和豐富度存在較大差異，樣品中真菌的豐富度比細(xì)菌高但真菌的多樣性整體稍低于細(xì)菌。為進(jìn)一步評(píng)估本研究的測(cè)序深度是否滿足后續(xù)要求，對(duì)Shannon指數(shù)的變化趨勢(shì)進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖1所示。

圖1 細(xì)菌和真菌的Shannon曲線Fig.1 Shannon curves of bacteria and fungi in samples

本研究中4個(gè)奶疙瘩樣品細(xì)菌和真菌的平均有效測(cè)序深度分別為41 587條序列和49 637條序列，由圖1可知，樣品細(xì)菌和真菌的Shannon曲線均在測(cè)序量約為5 000條時(shí)趨于平穩(wěn)，表明本研究測(cè)序深度足夠，測(cè)序數(shù)據(jù)可滿足后續(xù)要求。

2.2 基于門和屬水平奶疙瘩中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

本研究對(duì)代表性序列進(jìn)行同源性對(duì)比發(fā)現(xiàn)，4個(gè)奶疙瘩樣品中共鑒定出了24個(gè)細(xì)菌門和9個(gè)真菌門?；陂T水平細(xì)菌和真菌相對(duì)含量的比較分析見圖2。

圖2 基于門水平細(xì)菌和真菌相對(duì)含量的比較分析Fig.2 Comparative analysis of relative contents of bacteria and fungi at phylum level

如圖2所示，平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌門有5個(gè)，分別為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和梭桿菌門（Fusobacteria），平均相對(duì)含量分別為44.47%、41.63%、5.77%、3.24%和2.75%；核心真菌門有3個(gè)，主要隸屬于子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota），平均相對(duì)含量分別為77.10%、11.74%和7.36%。滕香旭[26]對(duì)酸奶、嚼克和奶豆腐等內(nèi)蒙傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中微生物多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，Ascomycota為優(yōu)勢(shì)真菌門。劉楊柳[27]發(fā)現(xiàn)Proteobacteria和Firmicutes亦為新疆3個(gè)不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵奶疙瘩中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，雷炎等[28]發(fā)現(xiàn)新疆塔城地區(qū)奶豆腐中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為Proteobac－teria、Frimicutes、Actinobacteria 和 Bacteroidetes，上述報(bào)道均與本研究相同。

在屬的分類水平上，共鑒定出426個(gè)細(xì)菌屬和57個(gè)真菌屬，其中細(xì)菌和真菌平均相對(duì)含量大于1.0%的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為14個(gè)和11個(gè)，其分布情況如圖3所示。

圖3 基于屬水平細(xì)菌和真菌相對(duì)含量的比較分析Fig.3 Comparative analysis of relative contents of bacteria and fungi at genus level

由圖3A可知，奶疙瘩樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和平均相對(duì)含量分別為乳桿菌屬（Lactobacillus，21.34%）、醋桿菌屬（Acetobacter，12.44%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，9.86%）、乳球菌屬（Lactococcus，9.06%）、鏈球菌屬（Streptococcus，6.64%）、羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia，5.20%）、埃希氏菌屬/志賀氏菌屬（Escherichia/Shigella，2.70%）、沙門氏菌屬（Salmonella，2.60%）、纖毛菌屬（Leptotrichia，2.27%）、腸球菌屬（Enterococcus，1.76%）、普雷沃氏菌屬（Prevotella，1.47%）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia，1.43%）、放線菌屬（Actinomyces，1.41%） 和巨大球菌屬（Macrococcus，1.15%），Lactobacillus在樣品HB3中含量為80.84%，而在HB1、HB2和HB4中僅占0.88%、0.78%和2.86%，由此說明不同樣品間細(xì)菌多樣性存在差異。

由圖3B可知，優(yōu)勢(shì)真菌屬及平均相對(duì)含量分別為畢赤酵母屬（Pichia，19.53%）、曲霉屬（Aspergillus，18.94%）、耐堿酵母屬（Galactomyces，15.87%）、巴克斯霉屬（Backusella，6.61%）、寡囊盤菌屬（Thelebolus，6.29%）、黑蔥花酵母屬（Filobasidium，6.21%）、德巴氏酵母屬（Debaryomyces，1.49%）、青霉屬（Penicillium，1.26%）、假絲酵母屬（Candida，1.19%）、絲孢酵母屬（Trichosporon，1.12%）和鹿茸屬（Cutaneotrichosporon，1.10%），但仍有13.70%的真菌無法鑒定到屬，間接說明奶疙瘩樣品含有豐富的真菌群落。

新疆地區(qū)乳制品種類繁多，包含酸牛奶、酸馬奶、酸駝奶、奶疙瘩和奶酪等多種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，其中蘊(yùn)含了豐富的微生物資源。XIE等[29]從新疆伊犁牧區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵馬奶酒中分離得到了68株Lactobacillus。李偉程等[30]發(fā)現(xiàn)Lactobacillus為新疆伊犁牧區(qū)酸馬奶中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，Galactomyces為優(yōu)勢(shì)真菌屬，李王強(qiáng)等[31]發(fā)現(xiàn)Pichia和孢圓酵母（Torulaspora）為新疆塔城地區(qū)奶酪中的優(yōu)勢(shì)酵母，上述研究與本研究結(jié)果基本一致。

2.3 基于OTU水平奶疙瘩中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

OTU在樣品中的分布如圖4所示。

圖4 基于OTU的細(xì)菌和真菌UpSet分布圖Fig.4 OTU based UpSet diagram of bacteria and fungi in samples

由圖4A可知，樣品HB1～HB4中OTU總數(shù)為634、764、213、656個(gè)，核心OTU數(shù)為58個(gè)，占OTU總數(shù)的1.66%，但包含83790條序列，占總序列數(shù)的50.37%。由圖4B可知，樣品HF1～HF4中OTU總數(shù)為663、781、1 429、645個(gè)，核心OTU數(shù)僅為36個(gè)，占OTU總數(shù)的1.26%，但包含98 956條序列，占總序列數(shù)的49.84%。細(xì)菌和真菌中均有7個(gè)平均相對(duì)含量大于1.0%的核心OTU，其相對(duì)含量如圖5所示。

圖5 平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌和真菌核心OTUFig.5 Core OTUs of bacteria and fungi with an average relative content greater than 1.0%in samples

由圖5A可知，細(xì)菌中核心OTU所包含序列數(shù)占總序列數(shù)的 50.37%，其中 OTU263、OTU965、OTU1694、OTU1750、OTU2433、OTU2949 和 OTU3240 分別隸屬于Lactococcus、Lactobacillus、Acetobacter、Ralstonia、Streptococcus、Escherichia/Shigella 和 Acinetobacter。由圖 5B可知，奶疙瘩中真菌核心優(yōu)勢(shì)OTU所包含序列數(shù)占總序列數(shù)的 49.84%，其中 OTU25、OTU167、OTU744、OTU850、OTU1552、OTU2222 和 OTU2751 分別隸屬于Aspergillus、Debaryomyces、Digitaria、Backusella、Pichia、Filobasidium和未鑒定多毛霉菌綱（Dothidecomycetes）。由此可見，奶疙瘩中的核心細(xì)菌類群主要以Lactobacillus、Acetobacter、Acinetobacter 和 Lactococcus 為主，累計(jì)平均相對(duì)含量為47.27%，核心真菌群主要以Pichia、Aspergillus和Backusella為主。本研究通過分析發(fā)現(xiàn)奶疙瘩中還存在一定的Salmonella等常見的有害致病菌，可能引起病原菌感染、發(fā)熱和食物中毒[32]。

本研究進(jìn)一步對(duì)奶疙瘩中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和真菌屬之間的相關(guān)性進(jìn)行了探究，如圖6所示。

圖6 細(xì)菌和真菌優(yōu)勢(shì)菌屬的秩相關(guān)熱圖Fig.6 Rank correlation heat map of dominant genera of bacteria and fungi in samples

由圖 6可知，Galactomyces與 Streptococcus呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05，r=-0.924），與 Macrococcus與呈正相關(guān)（P＜0.05，r=0.966），與 Escherichia/Shigella呈極顯著 正 相 關(guān) （P ＜0.001，r=0.999），Aspergillus 與 Leptotrichia、Prevotella和 Actinomyces均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；Candida與 Enterococcus呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，r=0.966）。由此可見，奶疙瘩中細(xì)菌和真菌類群可能存在一定的共生關(guān)系。

3 結(jié)論

哈密地區(qū)奶疙瘩中的細(xì)菌門主要為Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria，真菌門主要為 Ascomycota、Basidiomycota 和 Mucoromycota，細(xì)菌屬主要為 Lactobacillus、Acetobacter，真菌主要為 Pichia、Aspergillus和Galactomyces，奶疙瘩中細(xì)菌和真菌類群可能存在一定的共生關(guān)系。