孫卓，楊程程，許宏虹，戰(zhàn)虎

（天津華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證有限公司，天津 300000）

隨著生活水平的提高，人們對(duì)飲食營(yíng)養(yǎng)的要求日益增加。水產(chǎn)品中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、人體必需氨基酸，因此水產(chǎn)品經(jīng)過(guò)不同加工后成為餐桌上常見的美味佳肴。但是在進(jìn)行腌制、油炸過(guò)程中，水產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)轉(zhuǎn)化成少量N-亞硝胺類化合物[1]，該物質(zhì)是公認(rèn)的具有較大毒害作用的污染物，也是已知的強(qiáng)致癌物之一，會(huì)對(duì)人體健康造成嚴(yán)重影響，過(guò)量攝入含有亞硝胺的食物后，人體會(huì)出現(xiàn)肝臟損傷，血小板破壞，乃至全身中毒[2]等表征。

隨著人們對(duì)亞硝胺的致癌機(jī)理[3]深入了解，對(duì)如何有效監(jiān)管食品中的亞硝胺顯得尤為重要。GB 2762—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中規(guī)定水產(chǎn)動(dòng)物[4]及其制品中N-二甲基亞硝胺[5]的限量值為4.0 μg/kg。GB 5009.26—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中N-亞硝胺類化合物的測(cè)定》中提供了兩種檢測(cè)方法。從儀器角度分析，氣相色譜-熱能分析法[6]由于儀器價(jià)格昂貴，不適用于一般實(shí)驗(yàn)室。氣相色譜-質(zhì)譜法，由于結(jié)果離子信息少，定性不準(zhǔn)確等問(wèn)題，容易產(chǎn)生N-二甲基亞硝胺假陽(yáng)性的結(jié)果，而且很難消除樣品基質(zhì)干擾。從前處理角度分析，水蒸氣蒸餾法[7]的試劑消耗量大，從提取到濃縮過(guò)程時(shí)間長(zhǎng)，易造成目標(biāo)化合物損失，回收率不穩(wěn)定而且批量檢測(cè)存在一定的局限性。由于標(biāo)準(zhǔn)對(duì)N-二甲基亞硝胺限量要求低，因此傳統(tǒng)試驗(yàn)儀器與前處理方法不能滿足水產(chǎn)品中N-二甲基亞硝胺檢測(cè)的準(zhǔn)確度要求。相比之下，QuEChERS方法改進(jìn)了樣品前處理方式，通過(guò)對(duì)樣品提取、凈化、直接進(jìn)樣，利用基質(zhì)分散萃取機(jī)理，進(jìn)而達(dá)到吸附干擾物，保留目標(biāo)物與凈化樣品的目的。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

扇貝柱、鮮蝦滑、巴沙魚片、墨魚丸：市售。

4種N-亞硝胺類化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液[N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-亞硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-亞硝基二丙胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亞硝基正丁胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA），純度均大于 98.0%，質(zhì)量濃度均為100 mg/L]：安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；QuEChERS凈化填料除脂分散凈化包、除脂萃取鹽包：美國(guó)安捷倫公司；乙腈、正己烷（色譜純）：美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 儀器

8860-5977型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電子轟擊離子源）：美國(guó)安捷倫公司；Vortex Genius 3型漩渦振蕩器：德國(guó)IKA公司；MGS-2200G型氮吹儀、RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本東京理化公司；KQ-500DV型超聲波清洗器：昆山舒美有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取亞硝胺類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用正己烷稀釋并配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，放于棕色儲(chǔ)液瓶，在-18℃冰箱保存。臨用時(shí)，移取上述配制好的工作液，用正己烷配制成濃度分別為1、5、10、20、40、50、100 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

稱取10 g（精確到0.000 1 g）水產(chǎn)樣品，放進(jìn)50 mL離心管，加入20 mL正己烷，在室溫（35℃以下）以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，樣品殘?jiān)儆?0 mL正己烷重復(fù)提取3遍，合并正己烷提取液于100 mL離心管中，使用渦旋振蕩器振蕩1 min，在室溫（35℃以下）用速率為5 000 r/min的離心機(jī)離心3 min，棄去正己烷層，重復(fù)兩次，然后轉(zhuǎn)移到容量瓶中進(jìn)行定容，等待凈化。

1.4.2 凈化

使用移液器量取試樣1.5 mL待凈化溶液，置于含N-丙基乙二胺混合吸附劑50 mg、硅膠吸附劑150 mg以及無(wú)水硫酸鎂100 mg的2 mL離心管中，使用漩渦振蕩器振蕩30 s，使試樣混勻，放入轉(zhuǎn)速為12 000 r/min的離心機(jī)離心3 min，取上清液待氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定使用[8]。

1.5 空白基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

提取3種空白基質(zhì)水產(chǎn)品樣品，待凈化液減壓旋蒸至干后，加入2.0 mL質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、40、50、100 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液復(fù)溶，渦旋振蕩，量取1.5 mL溶液振蕩后進(jìn)行QuEChERS凈化，即可獲得空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）計(jì)算

由于質(zhì)譜分析會(huì)普遍存在基質(zhì)效應(yīng)，客觀存在的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)方法的精密度、靈敏度以及準(zhǔn)確度都會(huì)造成影響[3]。本試驗(yàn)前處理過(guò)程會(huì)用到大量有機(jī)試劑，而且水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，有可能會(huì)對(duì)目標(biāo)物產(chǎn)生一定影響。本文參考李婷等[9]的研究方法，通過(guò)先萃取后添加的方法，配制質(zhì)量濃度為0.100 mg/L的4種N-亞硝胺類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶劑以及空白基質(zhì)匹配校準(zhǔn)溶劑，在同樣條件下進(jìn)行分析，根據(jù)公式（1）計(jì)算ME。

式中：Pm為空白基質(zhì)匹配校準(zhǔn)溶液中N-亞硝胺類化合物的響應(yīng)值；Ps為標(biāo)準(zhǔn)溶液中N-亞硝胺類化合物的響應(yīng)值。

當(dāng)ME=0時(shí)，表示溶液中沒有基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME＜0時(shí)，表示溶液中存在基質(zhì)抑制；當(dāng)ME＞0時(shí)，表示溶液中存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。試驗(yàn)所得4種N-亞硝胺類化合物在水產(chǎn)品中都存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。在基質(zhì)效應(yīng)均存在的情況下，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，就可以在一定程度降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.7 色譜條件

色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為220℃，不分流進(jìn)樣模式。載氣為氦氣，純度為99.99%，流速為1.0 mL/min。升溫程序：30℃，保持3 min，以5℃/min升至100℃，以30℃/min升至240℃，保持5 min；溶劑放空模式進(jìn)樣：放空溫度為30℃，放空流速：100 mL/min，放空時(shí)間為0.42 min，以 600℃/min速率升溫至 300℃，進(jìn)樣體積：5 μL。

1.8 質(zhì)譜條件

離子源：EI，離子源的溫度為230℃，四極桿的溫度為150℃，接口的溫度230℃，電子能量為90 eV，碰撞能量均為15 eV。4種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的保留時(shí)間、產(chǎn)物離子[10]、前體離子以及其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 4種N-亞硝胺類化合物的保留時(shí)間、產(chǎn)物離子以及其他質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times，product ions and other MS paramerters of the four N-nitrosamine compounds

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 去脂方式的選擇

對(duì)于大多數(shù)水產(chǎn)品，QuEChERS的凈化填料具有較好的去除雜質(zhì)和油脂的作用[11]。但對(duì)于油脂含量較高的動(dòng)物性食品，在凈化濃縮后，會(huì)有相對(duì)明顯的油脂吸附在玻璃容器管壁上。因此試驗(yàn)嘗試多種不同的凈化、萃取去脂方式。凝膠色譜凈化方法彌補(bǔ)上述缺陷，在確保精密度和準(zhǔn)確度的同時(shí)提高了檢測(cè)效率。

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化

使用乙腈進(jìn)行提取，雞心瓶壁內(nèi)會(huì)留有大量復(fù)溶不能溶解的油狀殘留物，如果增加溶劑使用量，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)方法的檢測(cè)限降低。同時(shí)大量油脂會(huì)使得硅膠粉末和N-丙基乙二胺填料不能將樣品凈化干凈，致使色譜基線[12]響應(yīng)偏高、回收率差、儀器污染等，同時(shí)還會(huì)存在其它明顯問(wèn)題。

1）上機(jī)樣品量少，如果增加上機(jī)樣品量會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物分散，造成收集時(shí)間延長(zhǎng)，雜質(zhì)數(shù)量增加等多種影響。

2）前處理時(shí)間較長(zhǎng)，凈化1個(gè)樣品基本需要1 h以上。

以上問(wèn)題在一定程度上限制了凝膠色譜儀的凈化作用，為了更好優(yōu)化前處理階段去脂效果，參考文獻(xiàn)[13]的方法，在乙腈提取過(guò)程中添加正己烷溶液（乙腈飽和）進(jìn)行去脂。與未經(jīng)去脂或者QuEChERS凈化的效果進(jìn)行對(duì)比，考察凈化效果。通過(guò)回收率考察發(fā)現(xiàn)，具有極性的N-亞硝胺類化合物在具有非極性的正己烷中幾乎未被分解，即使用正己烷多次去脂也不會(huì)影響乙腈提取液中的N-亞硝胺類化合物含量。因此確定采用正己烷去除乙腈層中的油脂。

2.2 定性、定量方法的選擇

水產(chǎn)品成分復(fù)雜，經(jīng)常會(huì)受到基質(zhì)效應(yīng)的影響，而且N-亞硝胺類化合物在前處理過(guò)程中不穩(wěn)定，為了更好地對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量、定性分析，試驗(yàn)采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）[14]模式進(jìn)行檢測(cè)，使用混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，既排除了基質(zhì)干擾，又彌補(bǔ)了前處理對(duì)整體回收率的影響。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、檢出限和定量限

稱取10.00 g試樣，加入100 μL混合內(nèi)標(biāo)溶液，配制成質(zhì)量濃度為 5、10、20、30、50、100、150 μg/L 的 N-亞硝胺類化合物溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行處理，在儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，得到4種N-亞硝胺類化合物的線性回歸方程，見表2。

表2 4種N-亞硝胺類化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation corfficient，limit of detection and limit of quantitation of the 4 N-nitrosamine compounds

由表2可見，4種N-亞硝胺類化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9985～0.9999。檢出限為0.05 μg/kg～0.10 μg/kg，定量限為 0.1 μg/kg～0.5 μg/kg。本方法靈敏度高，線性范圍廣。

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

將不同質(zhì)量濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白水產(chǎn)品試樣中，分別制成 1.0、3.0、10.0 μg/kg的加標(biāo)樣品，按試驗(yàn)方法每個(gè)濃度平行測(cè)試6次，得出回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。

表3 4種N-亞硝胺類化合物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviation of the 4 kinds of N-nitrosamines compounds（n=6）

結(jié)果顯示，經(jīng)QuEChERS前處理的樣品回收率較未經(jīng)處理的樣品回收率數(shù)值偏高，表明QuEChERS方法在準(zhǔn)確性方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

本文使用改進(jìn)的QuEChERS方法，建立了水產(chǎn)品中4種N-亞硝胺類化合物的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析方法，前處理快捷簡(jiǎn)單、便于操作，目標(biāo)化合物損失較低、回收率較高，具有較高的準(zhǔn)確性，適用于大批量水產(chǎn)品的檢測(cè)，實(shí)際檢測(cè)運(yùn)用良好，對(duì)日常檢測(cè)工作具有一定的指導(dǎo)和借鑒意義。該方法也可以應(yīng)用于高油脂含量的各類食品中的N-亞硝胺類化合物的測(cè)定。