汪吉烽 王維維 吳穎慧 羅晨栩 竇瑞玲 高玲 王國芬 莫選榮 羅心靜

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性自身免疫疾病，其主要的病理特征是由于關(guān)節(jié)滑膜組織增生和炎癥而導(dǎo)致的軟骨及骨的損傷。RA患者關(guān)節(jié)組織中的滑膜成纖維細胞（rheumatoid arthritis synovial fibroblasts，RASF）是滑膜炎癥的主要效應(yīng)細胞，其過度增殖造成的細胞數(shù)量異常增多是滑膜增生和骨質(zhì)破壞的重要機制[1]。近年的研究表明，TNF-α、IL-1等炎癥因子誘導(dǎo)的RASF自噬上調(diào)是其凋亡抵抗和異常增殖的重要原因之一，并與RA滑膜增生密切相關(guān)[2]。因此調(diào)控RASF自噬所導(dǎo)致的滑膜增生已成為治療RA的有效策略[3]。NF-κB是在RA發(fā)病中起重要作用的炎癥信號通路之一，其在RA滑膜組織中高度活化，參與炎癥因子誘導(dǎo)的滑膜炎癥反應(yīng)[4]。但其對炎癥因子誘導(dǎo)的RASF自噬的影響尚不太清楚。本研究擬以人類RASF細胞株MH7A作為載體，觀察TNF-α對RASF自噬和增殖的影響，并進一步通過抑制NF-κB通路來探討這一影響的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑 MH7A購自廣州吉妮歐公司；改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）、FBS均購自美國Gibco公司；Bay11-7082購自美國MedChemExpress公司；總RNA分離試劑盒（Trizol）購自美國Applied Biosystems公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體購自美國GOOD HERE公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司；重組人TNF-α購自美國Novoprotein公司；噻唑藍法（MTT）試劑盒、熒光二抗、4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒均購自南通碧云天公司；唯Bcl-2同源-3域蛋白-1（Beclin-1）兔單克隆抗體、磷酸化 NF-κB-p65（P-p65）兔單抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ/自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）單抗、腺病毒-綠色熒光蛋白（Ad-GFP）-LC3-Ⅱ試劑、PCR試劑盒均購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 RASF傳代和培養(yǎng) 將MH7A用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔3～4 d換液1次，當(dāng)細胞生長至融合度80%時用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3比例分瓶傳代并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組 在一階段實驗中，根據(jù)5 ng/ml TNF-α 處理時間不同，將細胞分為 6 組，即 0、3、6、12、24 及48 h組。在二階段實驗中，根據(jù)加入的藥物不同，將細胞分為4組，即5 μg/ml Bay11-7082預(yù)處理的Bay組，5 ng/ml TNF-α 預(yù)處理的 TNF-α 組，5 μg/ml Bay11-7082預(yù)處理2 h后再用5 ng/ml TNF-α預(yù)處理的Bay+TNF-α組，細胞不作處理的正常對照（Ctrl）組。

1.2.3 細胞增殖活性檢測 采用MTT法。將上述各組預(yù)處理細胞用胰酶消化并等量接種于96孔板，生長至一定密度加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；終止培養(yǎng)后，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，搖床15 min，在492 nm波長處用酶標(biāo)儀測量吸光度（OD）值。細胞相對活性=實驗組OD值/Ctrl組OD值×100%。

1.2.4 細胞中自噬小體形成情況檢測 共聚焦顯微鏡下采用GFP-LC3-Ⅱ來示蹤自噬形成。將上述各組預(yù)處理細胞用胰酶消化并接種于共聚焦培養(yǎng)皿，生長至一定密度后加入7.5 μl Ad-GFP-LC3-Ⅱ，繼續(xù)培育24 h；PBS漂洗，固定液靜置15 min；再經(jīng)PBS漂洗后每孔加入80 μl的DAPI，避光搖床15 min；吸去染色液，PBS漂洗3遍；在共聚焦顯微鏡下觀察外源性GFP-LC3-Ⅱ在細胞定位，分析細胞中自噬小體的形成情況。

1.2.5 P-p65、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和 Beclin-1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。將上述各組預(yù)處理細胞用PBS緩沖液漂洗3次，加入蛋白裂解液冰上混勻裂解30 min，離心取上清液，采用BCA法測出蛋白濃度；將 20 μg蛋白樣品與6×SDS加樣緩沖液混合上樣；樣品經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后，經(jīng)電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下封閉4 h；分別加入GAPDH、P-p65、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1兔多克隆抗體，孵育過夜；隔日漂洗后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，反應(yīng)1 h；加入ECL試劑，曝光成像并灰度掃描分析。GAPDH為內(nèi)參照物。

1.2.6 Beclin-1 mRNA的表達水平檢測 采用real-time PCR法。用Trizol法提取RNA，將提取后的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄制備 cDNA，反應(yīng)體系如下：1 μg RNA、40 U/μl莫羅尼小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、100 nmol/L多聚胸腺嘧啶、1 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸混合物、0.1 mol/二硫蘇糖醇、40 U/μl RNA酶抑制物、加焦碳酸二乙酯去離子水至總體積為20 μl。反應(yīng)條件如下：42℃60 min，70℃10 min。將生成的cDNA進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下：0.4 μmol/L cDNA、1 μl正、反義鏈 12.5 μl SYBR Green酶、加去離子水至總體積20 μl。PCR反應(yīng)程序如下：95℃5 min預(yù)變性，然后按95℃15 s，60℃1 min共40個循環(huán)，最后72℃7 min延伸。計算模板與對照樣本之間的2－ΔΔCt值差。

1.2.7 P-p65在細胞中表達及定位檢測 采用細胞免疫熒光法。將將上述各組預(yù)處理細胞用胰酶消化并等量移至細胞爬片；入封固液1 h。加入NF-κB p65，4℃過夜，隔日用PBS清洗3次，加入羊抗兔IgG室溫下?lián)u床2 h。用DAPI（1∶1 000）染核（全程避光），用PBS漂洗3次，在新的載玻片上滴加淬滅液，置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 不同時間6組細胞相對活性比較 與0 h組相比，12、24、48 h組細胞相對活性均明顯升高（均P＜0.05），見表 1。

表1 不同時間6組細胞相對活性比較（%）

2.2 不同時間6組自噬小體形成情況比較 GFPLC3-Ⅱ腺病毒轉(zhuǎn)染細胞后，與0 h組相比，TNF-α刺激滑膜細胞后自噬小體形成明顯增多，其中24 h組最為明顯，見圖1（插頁）。

圖1 不同時間6組細胞TNF-α刺激后自噬小體形成共聚集顯微鏡下所見（×200）

2.3 不同時間6組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1蛋白表達水平比較 與0 h組相比，3、6、12 h組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），6、12、24、48 h 組 Beclin-1 蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2、表2。

表2 不同時間6組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表達水平比較

圖2 不同時間6組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1蛋白表達的電泳圖（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ為自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ/自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ；Beclin-1為唯Bcl-2同源-3域蛋白-1）

2.4 不同時間6組細胞Beclin-1 mRNA表達水平比較 與 0 h 組相比，6、12、24、48 h 組 Beclin-1 mRNA表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表3 不同時間6組細胞Beclin-1 mRNA表達水平比較

2.5 不同藥物預(yù)處理4組細胞P-p65蛋白表達及染核情況比較 與TNF-α組相比，Bay+TNF-α組細胞內(nèi)P-p65蛋白表達及染核明顯減少，見圖3（插頁）。與Ctrl組比較，Bay組細胞P-p65蛋白的表達水平明顯下降，與TNF-α組比較，Bay+TNF-α組細胞P-p65蛋白的表達水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

圖3 不同藥物預(yù)處理4組細胞NF-κB染核情況熒光顯微鏡下所見（P-p65為磷酸化NF-κB-p65；DAPI染色，×200）

圖4 不同藥物預(yù)處理4組細胞P-p65蛋白表達的電泳圖（P-p65為磷酸化 NF-κB-p65）

2.6 不同藥物預(yù)處理4組細胞相對活性比較 與Ctrl組比較，Bay組細胞相對活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與 TNF-α 組比較，Bay+TNF-α 組細胞相對活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 不同藥物預(yù)處理4組細胞相對活性比較（%）

2.7 不同藥物預(yù)處理4組細胞自噬小體形成情況比較 與TNF-α組相比，Bay+TNF-α組細胞自噬小體明顯減少，見圖5（插頁）。

圖5 不同藥物預(yù)處理4組細胞自噬小體形成共聚集顯微鏡下所見（×200）

2.8 不同藥物預(yù)處理4組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1蛋白表達水平比較 與Ctrl組比較，Bay組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表達水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與TNF-α組比較，Bay+TNF-α組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表達水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖6、表5。

圖6 不同藥物預(yù)處理4組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表達的電泳圖（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ為自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ/自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ；Beclin-1為唯Bcl-2同源-3域蛋白-1）

表5 不同藥物預(yù)處理4組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表達水平比較

2.9 不同藥物預(yù)處理4組Beclin-1 mRNA表達水平比較 與Ctrl組比較，Bay組Beclin-1 mRNA表達水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與TNF-α組比較，Bay+TNF-α組Beclin-1 mRNA表達水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表6。

表6 不同藥物預(yù)處理4組細胞Beclin-1 mRNA表達水平比較

3 討論

RA病變的一個重要特征就是由于滑膜組織的增生所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨及骨的侵蝕破壞。研究表明RASF是引起關(guān)節(jié)滑膜組織增生的關(guān)鍵效應(yīng)細胞。RASF與正?；ぜ毎煌?，在炎癥因子（如TNF-α、IL-1）等刺激下，其細胞表型及生物學(xué)行為均發(fā)生顯著變化，具有“腫瘤樣”生長和侵襲特性，能逃避正常的生長調(diào)控機制而出現(xiàn)大量增殖，并合成和分泌多種炎性細胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶，導(dǎo)致慢性滑膜炎，形成血管翳并侵蝕軟骨和軟骨下骨[5]。如果能夠有效抑制RASF活化和異常增殖，將能阻斷滑膜增生和骨質(zhì)侵蝕，從而使RA的病變得到有效的控制。然而，RASF異常增殖的機制十分復(fù)雜，目前尚不明確。

近年來研究結(jié)果表明，RASF自噬參與RA滑膜增生病變過程[6-8]。RASF自噬上調(diào)是RASF凋亡抵抗及過度增殖的重要機制，在RA滑膜增生和關(guān)節(jié)破壞中起著重要作用。某些在RA病變中起重要作用的炎癥因子（如 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17等）在 RASF自噬產(chǎn)生過程中發(fā)揮著重要作用[9]。如TNF-α不僅能誘導(dǎo)RASF凋亡抵抗，還能誘導(dǎo)RASF的自噬，故其已被廣泛用作RA的治療靶標(biāo)[10-11]。本研究一階段實驗結(jié)果證實，RASF受TNF-α刺激后細胞增殖活性顯著增加，同時自噬細胞數(shù)及自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平升高，提示TNF-α能誘導(dǎo)RASF自噬，并且與細胞增殖相關(guān)。Beclin-1是酵母自噬相關(guān)基因Atg6的同源物，屬于Bcl-2抗癌基因家族，其不但參與細胞凋亡調(diào)節(jié)，而且參與細胞自噬的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α刺激RASF后Beclin-1 mRNA和蛋白表達水平均升高，表明Beclin-1參與TNF-α誘導(dǎo)RASF自噬過程，可能與RA病變有關(guān)。

目前NF-κB通路是與RA發(fā)病關(guān)系最為明確的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究表明，NF-κB介導(dǎo)RASF活化及多種炎癥細胞因子的生成調(diào)節(jié)[12]。NF-κB也是RASF存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與RA滑膜增生的發(fā)病機制[4]。本研究二階段實驗中，采用NF-κB通路抑制劑BAY11-7082來抑制NF-κB通路活化，觀察TNF-α刺激下的RASF增殖和自噬的變化，結(jié)果顯示，抑制NF-κB通路活化能顯著降低基礎(chǔ)狀態(tài)和TNF-α刺激下的RASF增殖和自噬水平，同時Beclin-1基因表達顯著降低。以上研究提示，NF-κB通路活化介導(dǎo)了TNF-α誘導(dǎo)的RASF自噬和增殖活性，并且可能與其上調(diào)Beclin-1表達有關(guān)。有研究報道抑制NF-κB活化能明顯抑制RASF增殖并促進凋亡[4]。而NF-κB通路是否通過上調(diào)RASF自噬促進其凋亡抵抗及其過度增殖，尚需要進一步研究。

綜上所述，本實驗表明TNF-α能誘導(dǎo)RASF自噬和增殖活性，其機制與其激活NF-κB通路活化有關(guān)。因此，靶向NF-κB介導(dǎo)的RASF自噬的調(diào)控，可能成為有效防治RA的新靶點。