潘巖 劉魯明 花永強(qiáng)

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，因其隱匿起病、高度惡性，且缺乏明顯的臨床表現(xiàn)，85%的患者在發(fā)病確診時(shí)已屬于癌癥終末期，5年生存率低于7%[1]。Sonic Hedgehog信號(hào)通路在胰腺腫瘤的形成發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移、腫瘤多藥耐藥等過程中發(fā)揮重大作用[2]，靶向調(diào)控GLI1轉(zhuǎn)錄因子可改善患者臨床預(yù)后[3]。芹菜素作為一種天然黃酮物質(zhì)，普遍存在于食用蔬菜和水果中，研究證明其可通過調(diào)控腫瘤相關(guān)基因、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)信號(hào)通路傳導(dǎo)、阻斷腫瘤血管形成、放化療增敏及化學(xué)預(yù)防等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[4-5]。有研究報(bào)道芹菜素對(duì)胰腺癌有明顯的抑制作用[5-7]，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究以PTCH1/GLI1/Bcl-2軸為切入點(diǎn)，探索芹菜素對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響及其潛在作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞、SW1990細(xì)胞均為復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科劉魯明教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑與儀器 RPMI1640購自美國Hyclon公司；FBS試劑購自美國Gibco公司；青、鏈霉素雙抗購自德國Sigma公司；體外增殖檢測(cè)試劑盒（CCK-8）購自日本本同仁化學(xué)研究所；細(xì)胞凋亡檢測(cè)AnnexinV/PI試劑盒購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均購自加拿大Fermentas公司；PTCH1、GLI1、Bcl-2和GAPDH引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成；兔抗人PTCH1、GLI1、actin均購自美國 Cell Signalling Technology公司；山羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司；BD FACalibur System流式細(xì)胞分析儀均購自美國BD公司；基因擴(kuò)增儀購自德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞、SW1990細(xì)胞接種于含10%FBS、1%青、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中[8]，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)75%左右時(shí)，1∶3傳代。

1.3.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用CCK-8法。將制成單細(xì)胞懸液的胰腺癌BxPC-3、SW1990細(xì)胞以 1×103個(gè)/孔接種于96孔板（100 μl/孔）。將芹菜素用0.1%DMSO溶解，并制備成濃度梯度的芹菜素溶液（2、5、10、20、40、60、80 μmol/L）。上述細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加入0.1%DMSO及濃度梯度的芹菜素進(jìn)行干預(yù)24、48和72 h。檢測(cè)細(xì)胞活力時(shí)每孔加入CCK-8溶液10 μl，培養(yǎng)1 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)定光密度值，計(jì)算細(xì)胞活力。使用graphpad prism軟件計(jì)算BxPC-3、SW1990細(xì)胞經(jīng)芹菜素干預(yù)48 h后的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.3.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書，通過胰蛋白酶消化獲取的胰腺癌BxPC-3、SW1990 細(xì)胞，用 PBS 洗滌，加入 195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液，常溫避光處理10 min后加入10 μl PI染色液，冰浴避光放置，隨即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 細(xì)胞克隆形成率檢測(cè) 采用平板克隆實(shí)驗(yàn)。將制成單細(xì)胞懸液的胰腺癌BxPC-3、SW1990細(xì)胞以5×102個(gè)/孔接種于6孔板（1 ml/孔），待細(xì)胞貼壁生長后分別加入 0.1%DMSO、10、20、50 μmol/L 的芹菜素干預(yù) 14 d。鏡下觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)目并拍照，取平均值，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.3.5 PTCH1、GLI1、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用RT-PCR法。BxPC-3、SW1990細(xì)胞經(jīng)0.1%DMSO、10、20、50 μmol/L 芹菜素干預(yù) 48 h。參考前期研究[9]提取細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR試劑盒檢測(cè)PTCH1、GLI1、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件：94℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)。PTCH1引物：上游：5′-CGGCGTTCTCAATGGGCTGGTTTT-3′，下游：5′-GTGGGGCTGCTGTTTCGGGTTCG-3′；GLI1 引物：上游：5′-AGGGAGTGCAGCCAATACAG-3′，下游：5′-ATTGGCCGGAGTTGATGTAG-3′；Bcl-2 引物：上游：5′-GAACTGGGGGAGGATTGTGG-3′，下游：5′-CCGG TTCAGGTACTCAGTCA-3′；GAPDH 引物：上游：5′-CA AGG TCATCCATGACAACTTTG-3′，下游：5′-GTCCACCA CCCTGTTGCTGTAG-3′。最終mRNA的相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCt法定量。

1.3.6 PTCH1、GLI1蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。參考前期研究描述的方法，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，進(jìn)行蛋白提取，BCA法檢測(cè)蛋白濃度[9]。取等量蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品；將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，與一抗4℃孵育過夜。緩沖液洗膜（15 min×3次）后將膜與二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)豐度。采用Bio-Rad Image Lab 5.2.1軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 8組BxPC-3、SW1990細(xì)胞活力比較 與 0.1%DMSO 組比較，2、5、10、20、40、60、80 μmol/L 芹菜素組24、48、72 h時(shí)的IC50均明顯降低，且呈劑量及時(shí)間依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖1。

圖1 8組BxPC-3、SW1990細(xì)胞活力比較（a：BxPC-3細(xì)胞；b：SW1990細(xì)胞）

2.2 4組BxPC-3、SW1990細(xì)胞凋亡率比較 與0.1%DMSO 組比較，10、20、50 μmol/L 芹菜素組 BxPC-3、SW1990細(xì)胞凋亡率均明顯升高，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表1、圖2。

圖2 4組 BxPC-3、SW1990細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞圖（a：BxPC-3細(xì)胞；b：SW1990細(xì)胞）

表1 4組BxPC-3、SW1990細(xì)胞凋亡率比較（%）

2.3 4組BxPC-3、SW1990細(xì)胞克隆形成率比較 與0.1%DMSO 組比較，10、20、50 μmol/L 芹菜素組 BxPC-3、SW1990細(xì)胞克隆形成率均明顯下降，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表2、圖3（插頁）。

圖3 4組BxPC-3、SW1990細(xì)胞克隆形成率比較（a：BxPC-3細(xì)胞；b：SW1990細(xì)胞）

表2 4組BxPC-3、SW1990細(xì)胞克隆形成率比較（%）

2.4 4 組 BxPC-3、SW1990 細(xì)胞 PTCH1、GLI1、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與0.1%DMSO組比較，10、20、50 μmol/L 芹菜素組 BxPC-3、SW1990 細(xì)胞 PTCH1、GLI1、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01），見表 3～5。

表3 4組BxPC-3、SW1990細(xì)胞PTCH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

表4 4組BxPC-3、SW1990細(xì)胞GLI1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

表5 4組BxPC-3、SW1990細(xì)胞Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 4組BxPC-3、SW1990細(xì)胞PTCH1、GLI1蛋白表達(dá)水平比較 與0.1%DMSO組比較，10、20、50 μmol/L芹菜素組BxPC-3、SW1990細(xì)胞 PTCH1、GLI1蛋白表達(dá)水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表 6～7、圖 4。

圖4 4組 BxPC-3、SW1990細(xì)胞PTCH1、GLI1蛋白表達(dá)的電泳圖（a：BxPC-3細(xì)胞；b：SW1990細(xì)胞）

表6 4組BxPC-3、SW1990細(xì)胞PTCH1蛋白表達(dá)水平比較

表7 4組BxPC-3、SW1990細(xì)胞GLI1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

芹菜素是一種常見的黃酮類化合物，廣泛存在于多種水果、蔬菜、豆類和茶葉中，在眾多實(shí)體腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用[5]，這一作用主要通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬來實(shí)現(xiàn)[10]。在前列腺癌中，Shukla等[11]發(fā)現(xiàn)芹菜素可以通過下調(diào)NF-κB激酶抑制劑和NF-κB信號(hào)通路來抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。膽管癌HcCCA-1細(xì)胞經(jīng)芹菜素干預(yù)24、48、72 h后，細(xì)胞生長受抑，細(xì)胞凋亡率顯著增加，且這種作用呈劑量和時(shí)間相關(guān)性[12]。本文探索了芹菜素對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，結(jié)果提示不同濃度芹菜素對(duì)胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3和SW1990的細(xì)胞增殖有不同程度的抑制作用，對(duì)細(xì)胞凋亡有不同程度的強(qiáng)化作用，芹菜素干預(yù)劑量越大、干預(yù)時(shí)間越長，作用越明顯。這一結(jié)果與前期報(bào)道的芹菜素干預(yù)胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPc-1、Panc-1和MiaPaCa-2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[6]。

Sonic Hedgehog信號(hào)通路異?；罨c胰腺惡性腫瘤形成發(fā)展關(guān)系密切。PTCH1、GLI1在胰腺腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常胰腺組織[13]。GLI1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)與TNM分期、神經(jīng)浸潤、淋巴管轉(zhuǎn)移有關(guān)，與分化程度和腫瘤大小無關(guān)。GLI1高表達(dá)預(yù)示著胰腺癌更差的生存預(yù)后[14]。因此，Sonic Hedgehog信號(hào)通路，尤其GLI1可能是胰腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。本研究采用RT-PCR和Western blot法證實(shí)了 20 μmol/L 和 50 μmol/L 濃度的芹菜素可以顯著降低胰腺癌BxPC-3和SW1990細(xì)胞中PTCH1、GLI1在基因和蛋白水平的表達(dá)，且兩者表達(dá)變化一致，變化趨勢(shì)與腫瘤細(xì)胞增殖受抑正性相關(guān)，與細(xì)胞凋亡增加呈負(fù)相關(guān)。Slusarz等[15]在前列腺癌的研究中發(fā)表了相似的研究結(jié)果：芹菜素通過降低Hedgehog信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄因子GLI1相對(duì)表達(dá)量來抑制前列腺癌細(xì)胞在體外和小鼠體內(nèi)的生長。

Bcl-2基因是一種抗凋亡因子，參與細(xì)胞凋亡。有研究表明芹菜素可通過減少抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白的比值從而誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞凋亡，使更多的腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期[16]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)胰腺癌BxPC-3和SW1990細(xì)胞經(jīng)10、20、50 μmol/L芹菜素干預(yù)后，腫瘤細(xì)胞凋亡比例呈劑量依賴性顯著性增加，Bcl-2相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，兩者呈負(fù)相關(guān)。有趣的是，Bcl-2是GLI1基因的下游靶基因，當(dāng)GLI1被激活后進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)下游靶基因Bcl-2、PTHC1等的表達(dá)，最終致使胰腺腫瘤細(xì)胞增殖受抑、細(xì)胞凋亡增加。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，芹菜素對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用和凋亡的誘導(dǎo)作用與下調(diào)PTCH1/GLI1/Bcl-2軸有關(guān)。