華男 方瑩 張芳芳 桑建忠

肝臟是人體重要的代謝和消化器官，也是清除腸道源性細菌和內(nèi)毒素的場所，肝臟的免疫調(diào)節(jié)功能主要是靠Kupffer細胞起作用的。Kupffer細胞是一種肝臟獨有的巨噬細胞[1-2]，經(jīng)脂多糖（LPS）激活可以導致肝臟炎癥和全身炎癥反應。Kupffer細胞的激活常常受到腸道菌群、微生物代謝物、內(nèi)毒素等的影響，同時也和肝臟中的肝細胞、星形細胞以及其他免疫細胞有關[3-4]。Kupffer細胞發(fā)揮了重要的炎癥免疫調(diào)節(jié)作用，可以發(fā)生極化，而極化狀態(tài)不同可使其起不同的作用，在肝損傷中M1型極化的巨噬細胞主要發(fā)揮促炎作用[5-6]，且M1型細胞可以由LPS誘導產(chǎn)生，但是其極化的機制以及復雜的誘導因素尚未被完全揭示。

IL-23是一種致炎性的細胞因子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在銀屑病等疾病中表達增高，同時與疾病的發(fā)生、發(fā)展有關[7-8]。而IL-23在肝損傷中的表達以及作用機制尚未見報道，由于M1型細胞的激活和炎癥因子及信號激活有關，因此本文旨在探究IL-23在急性肝損傷模型中調(diào)控Kupffer細胞M1型極化的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 Kupffer細胞購自武漢普諾賽生物技術有限公司；抗IL-23抗體購自美國Abcam公司；佛波酯（PMA）、LPS和重組人 IFN-γ均購自美國 Sigma公司；藻紅帶白（PE）標記的抗-F4/80抗體（PE-F4/80）、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的 CD11c+抗體（FITC－CD11c+）均購自美國Invitrogen Bioscience公司；HE染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技技術有限公司；免疫組織化學染色試劑盒購自上海生工有限公司；一氧化氮合酶（iNOS）、TNF-α、IL-6的 ELISA 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；JAK1、STAT1 以及 p-JAK1、p-STAT1 的單克隆抗體（一抗）和辣根過氧化物酶標記的IgG抗體（二抗）均購自美國Abcam公司；四氯化碳購自美國Merck公司；BCA試劑盒及 ECL試劑盒均購自上海碧云天生物技術公司。

1.2 實驗用動物 40只雄性8周齡清潔級小鼠[C57BL/6，體質量為（24.54±3.11）g]購自浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，分籠飼養(yǎng)，5只/籠。飼養(yǎng)溫度為20～25 ℃，濕度（70±5）%，自由活動、攝食。

1.3 方法

1.3.1 誘導Kupffer細胞分組及M1型極化 取對數(shù)生長期Kupffer細胞分為IL-23+anti-IL-23組、IL-23組和對照組，以106個/孔接種到6孔板中，加入200 ng/ml的PMA誘導刺激6 h，之后加入1 μg/ml的LPS和20 ng/ml的IFN-γ進行誘導；IL-23組加入20 ng/ml的IL-23，而IL-23+anti-IL-23組中除了加入20 ng/ml的IL-23外還同時加入20 ng/ml的anti-IL-23，培養(yǎng)24 h。

1.3.2 M1型細胞比例檢測 采用流式細胞術。取上述培養(yǎng)細胞，用PBS洗2次，調(diào)整細胞濃度為107個/ml，將細胞懸液加入Eppendoff管中，并加入PE-F4/80和FITC－CD11c+標記Kupffer細胞，混勻后避光孵育30 min，PBS洗2次后加入200 μl的Binding緩沖液，上機檢測。

1.3.3 Kupffer細胞 iNOS、TNF-α、IL-6水平檢測 采用ELISA法。取上述培養(yǎng)細胞，3 000 r/min離心15 min后取上清液，參照試劑盒說明進行操作。

1.3.4 Kupffer細胞 JAK1、p-JAK1、STAT1 及 p-STAT1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。取上述培養(yǎng)細胞，NP-40裂解液冰上裂解30 min，收集裂解液離心，采用BCA試劑盒進行蛋白質定量，調(diào)整蛋白質濃度后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜后使用封閉液封閉，加入一抗4℃下孵育過夜，TBST洗2次后，二抗孵育，經(jīng)過化學發(fā)光ECL試劑盒反應后顯影，采用Image J軟件進行灰度值分析。

1.3.5 急性肝損傷小鼠模型的構建及分組 40只小鼠采用擲骰子隨機法分為anti-IL-23組、IL-23組、模型組及對照組。用四氯化碳誘導小鼠構建肝損傷模型[14]。建模后anti-IL-23組小鼠尾靜脈先注射50 ng/ml的IL-23 溶液 100 μl，再注射 50 ng/ml的 anti-IL-23 溶液100 μl；IL-23 組小鼠尾靜脈注射 50 ng/ml的 IL-23 溶液100 μl；模型組小鼠僅構建肝損傷模型；對照組小鼠不作任何處理。

1.3.6 小鼠肝臟組織中 iNOS、TNF-α、IL-6水平檢測 上述處理完24 h后，二氧化碳窒息法法處死4組小鼠，取小鼠外周血，參照ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.3.7 小鼠肝臟組織中CD11c+表達水平檢測 采用免疫組織化學染色法。取小鼠肝臟組織使用4%的中性多聚甲醛固定，石蠟包埋后連續(xù)切片（4 μm），經(jīng)過脫蠟、內(nèi)源性過氧化物酶消除、熱修復抗原、封閉、CDI68孵育、二氨基聯(lián)苯胺顯色后觀察，以PBS代替第一抗體作為陰性對照。

1.3.8 小鼠肝臟組織病理變化檢測 取小鼠肝臟組織使用4%的中性多聚甲醛固定，石蠟包埋后連續(xù)切片（4 μm），按照HE染色試劑盒操作。

1.3.9 小鼠肝臟組織中 JAK1、p-JAK1、STAT1及 p-STAT1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。取小鼠肝臟組織，使用無菌剪剪碎后液氮下研磨至無顆粒狀，加入PMSF的NP40細胞裂解液，冰上裂解30 min后，3 000 r/min離心30 min，取上清液，采用BCA試劑盒進行蛋白質定量，調(diào)整蛋白質濃度后進行SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF轉膜后使用封閉液封閉，加入單克隆抗體4℃下孵育過夜，TBST洗2次后，二抗孵育，經(jīng)過化學發(fā)光ECL試劑盒反應后顯影，采用Image J軟件進行灰度值分析。

2 結果

2.1 3組Kupffer細胞M1型細胞比例比較 結果顯示IL-23組中M1型細胞的比例為（12.05±1.32）%，而IL-23+anti-IL-23組中M1細胞的比例為（7.55±1.08）%，對照組中M1型細胞的比例為（8.32±1.32）%，IL-23組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 3組Kupffer細胞M1型細胞的流式細胞圖

2.2 3 組 Kupffer細胞 iNOS、TNF-α、IL-6 水平比較IL-23組的iNOS、TNF-α、IL-6水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而IL-23+anti-IL-23組的iNOS、TNF-α、IL-6水平均明顯低于IL-23組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 3組 Kupffer細胞 iNOS、TNF-α、IL-6 水平比較（pg/ml）

2.3 3 組 Kupffer細胞 JAK1、p-JAK1、STAT1 以及 p-STAT1蛋白表達水平比較 IL-23組的JAK1、p-JAK1、STAT1以及p-STAT1蛋白表達水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而IL-23+anti-IL-23組的JAK1、p-JAK1、STAT1以及p-STAT1蛋白表達水平均明顯低于IL-23組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖 2、表 2。

表2 3組Kupffer細胞JAK1、p-JAK1、STAT1以及p-STAT1蛋白表達水平比較

圖2 3組 Kupffer細胞 JAK1、p-JAK1、STAT1以及 p-STAT1蛋白表達的電泳圖

2.4 4組小鼠肝臟組織中iNOS、TNF-α、IL-6水平比較對照組iNOS、TNF-α、IL-6水平均較其余3組低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而模型組iNOS、TNF-α、IL-6水平均較IL-23組、anti-IL-23組低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4組小鼠肝臟組織中 iNOS、TNF-α、IL-6 水平比較（pg/ml）

2.5 4組小鼠肝臟組織中CD11c+表達情況及肝臟組織病理變化比較 對照組小鼠肝組織中未見CD11c+的表達，而模型組小鼠CD11c+表達明顯，IL-23組小鼠CD11c+的表達較模型組更為明顯，見圖3（插頁）。對照組小鼠肝組織無明顯損傷，無細胞炎癥反應，呈正常生理狀態(tài)；而模型組小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的炎癥反應和細胞損傷；IL-23組小鼠肝組織損傷較模型組明顯；而anti-IL-23組小鼠肝組織損傷較IL-23組減輕，見圖4。

圖3 4組小鼠肝組織免疫組織化學染色結果（×200）

圖4 4組小鼠肝組織HE染色結果（×200）

2.6 4組小鼠肝臟組織中JAK1、p-JAK1、STAT1及p-STAT1蛋白表達水平比較 與對照組比較，IL-23組、模型組JAK1、p-JAK1、STAT1及p-STAT1蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；anti-IL-23 組、IL-23 組 JAK1、p-JAK1、STAT1 及 p-STAT1蛋白表達水平與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05）。見圖5、表4。

圖5 4組小鼠肝臟組織中JAK1、p-JAK1、STAT1及p-STAT1蛋白表達的電泳圖

表4 4組小鼠肝臟組織中JAK1、p-JAK1、STAT1及p-STAT1蛋白表達水平比較

3 討論

肝損傷是一種發(fā)病機制較為復雜的肝臟疾病。Kupffer細胞組成單核-巨噬細胞系統(tǒng)的一群特殊細胞，在肝臟免疫中發(fā)揮著重要的作用。肝臟微環(huán)境是由肝細胞、基質細胞以及免疫細胞組成的[9-10]，Kupffer細胞主要來源于血液中的單核細胞，在不同細胞因子刺激下形成不同的亞型。M1型細胞是由IFN-γ、LPS刺激形成的，可以分泌IL-1、IL-6、IL-12等[11-12]。M1型具有較高的抗原提呈能力，可激活免疫反應，保護機體免受感染，所以M1型細胞也被稱為是促炎的Kupffer細胞。目前也有研究發(fā)現(xiàn)M1型Kupffer細胞在多種肝臟炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用[13-14]。而M2型可以被IL-4、IL-10等刺激形成，其高表達CD163和CD206，具有抑制免疫應答、促進腫瘤血管生成、誘導組織重構等作用，同時可發(fā)揮抑制炎癥反應的作用。

M1型細胞在肝損傷中起到重要的作用，而前期研究也發(fā)現(xiàn)IL-17A參與了M1型細胞的激活，在非酒精性脂肪性肝病中發(fā)揮著重要的作用[15]。IL-23也是一種重要的炎癥因子，已有的研究發(fā)現(xiàn)在乙型肝炎患者中Th17細胞比例上調(diào)，同時IL-23和IL-6水平上調(diào)，且炎癥因子和ALT、AST的表達呈正相關[16]，說明IL-23與肝炎的進程有關，但其確切的機制未明。為了進一步明確其機制，本研究采用LPS+PMA+IFN-γ誘導Kupffer細胞M1極化，同時添加IL-23觀察其對于M1細胞極化的影響，LPS+PMA+IFN-γ是經(jīng)典的誘導巨噬細胞極化的方法，結果顯示在此基礎上添加IL-23可以協(xié)同刺激Kupffer細胞的極化，這種變化是明顯的，而進一步添加anti-IL-23抗體后這種作用被抑制，說明IL-23確實促進了M1極化。JAK1-STAT1信號是M1極化的經(jīng)典信號。本研究結果證明，IL-23刺激了JAK1和STAT1的磷酸化，進一步調(diào)控了信號的激活，同時可以提高M1型細胞標志物iNOS、TNF-α、IL-6的表達。為了明確其在組織中的作用，采用四氯化碳誘導小鼠急性肝損傷，在此基礎上利用重組IL-23進行干預，結果證明IL-23可以進一步促進肝組織中M1型細胞的極化，同時增強了細胞組織的炎癥反應，而添加anti-IL-23后可以抑制這種變化，其機制同樣和JAK1-STAT1的激活有關。

綜上所述，本研究結果證明，IL-23可以通過促進Kupffer細胞M1極化增強肝臟炎癥性損傷。