屈海蓉，韓彩寧，張洪煒，李 瓊，張心愿，哈春芳

多囊卵巢綜合征(PCOS)近年來(lái)發(fā)病率逐漸升高，有5%～10%[1]的育齡婦女受其困擾，所造成的高雄激素、肥胖、胰島素抵抗、月經(jīng)紊亂等，給患者的生活帶來(lái)了不良影響。PCOS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[2]，提示PCOS的發(fā)生與炎癥相關(guān)，有明顯的家族聚集性，也提示其發(fā)生可能與遺傳相關(guān)[3-4]。因此，從相關(guān)炎癥因子基因關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)層面探討PCOS的發(fā)病原因，對(duì)于PCOS的診治具有重要的意義。IL-1β、IL-6、TNF-α及TGFβ1為臨床上常見(jiàn)的炎癥因子，多項(xiàng)國(guó)外研究表明上述炎癥因子水平在PCOS患者體液中明顯升高[5-6]，但目前國(guó)內(nèi)針對(duì)炎癥因子基因多態(tài)性與PCOS相關(guān)性的研究相對(duì)較少。故本研究基于此，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，旨在探討IL-1β基因-511位點(diǎn)、IL-6基因rsl800796位點(diǎn)、TNF-α基因rs4645843位點(diǎn)及TGFβ1基因-869位點(diǎn)基因型多態(tài)性與PCOS的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2018年6月-2020年6月我院診治的103例PCOS患者作為PCOS組，

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)檢查等符合《多囊卵巢綜合征中國(guó)診療指南》中相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②年齡為28～40歲的育齡婦女；③所有患者對(duì)本試驗(yàn)知情并簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3個(gè)月有使用過(guò)免疫抑制劑；②合并惡性腫瘤(特別是卵巢癌)；③合并其他易導(dǎo)致激素水平異常的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病；④合并腎上腺皮質(zhì)增生。選取同期正常體檢的171例女性患者作為對(duì)照組(納入標(biāo)準(zhǔn)為同年齡段女性，且經(jīng)體檢檢查未發(fā)現(xiàn)明顯異常癥狀體征和陽(yáng)性輔助檢查項(xiàng)目)。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。2組患者一般資料比較結(jié)果顯示PCOS組患者BMI、吸煙及飲酒比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而2組患者年齡、陰道清潔度相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 2組患者匹配前一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 傾向性評(píng)分匹配:根據(jù)未匹配前PCOS組和對(duì)照組患者的臨床資料，將2組患者中存在偏移的臨床資料作為協(xié)變量，包括BMI、吸煙、飲酒，使用Logistic回歸模型計(jì)算傾向性評(píng)分，按照傾向性得分是否接近進(jìn)行l(wèi)∶l匹配，整個(gè)傾向性匹配分析使用R語(yǔ)言Matching軟件包進(jìn)行實(shí)施。

1.2.2 標(biāo)本采集:抽取所有患者5 mL空腹靜脈血，使用3.2%檸檬酸抗凝管抗凝，以3 000 r/min離心后取下層紅細(xì)胞及白細(xì)胞，置于-80 ℃醫(yī)用冰箱中保存，用于提取基因組DNA。

1.2.3 IL-1β、IL-6、TNF-α及TGFβ1基因多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè):①引物。所用引物均由合肥知恩生物技術(shù)有限公司提供，所用引物見(jiàn)表2。②反應(yīng)條件。所有基因PCR反應(yīng)體系體積為25 μl，含DNA樣品2 μl，10×緩沖液2.5 μl，三磷酸脫氧核苷(dNTP)0.5 μl，耐熱DNA聚合酶0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，雙蒸水18.5 μl。③循環(huán)條件。a.IL-1β基因-511位點(diǎn)，預(yù)變性94 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min；b.IL-6基因rs1800796位點(diǎn)，預(yù)變性95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、61 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min；c.TNF-α基因rs4645843位點(diǎn)，預(yù)變性95 ℃ 5 min、94 ℃ 45 s、59.5 ℃ 45 s、72 ℃ 1.5 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min；d.TGFβ1基因-869位點(diǎn)，預(yù)變性94 ℃ 5 min、94 ℃ 40 s、56 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。④PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)。取4 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，判讀炎癥因子基因位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率。

表2 IL-1β、IL-6、TNF-α及TGFβ1基因各位點(diǎn)引物序列

1.3 觀察指標(biāo):IL-1β、IL-6、TNF-α及TGFβ1基因多態(tài)性的比較，經(jīng)傾向性評(píng)分匹配后，比較2組人群IL-1β基因-511位點(diǎn)、IL-6基因rsl800796位點(diǎn)、TNF-α基因rs4645843位點(diǎn)及TGFβ1基因-869位點(diǎn)基因型及等位基因頻率，并采用Logistic回歸模型對(duì)不同基因型及等位基因與PCOS的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 采用最臨近匹配法:匹配比例1∶1，卡鉗值設(shè)為0.02，以PCOS組為基準(zhǔn)組進(jìn)行匹配，2組共85例對(duì)匹配成功，在2組間的協(xié)變量經(jīng)匹配后均達(dá)到平衡，經(jīng)PSM個(gè)協(xié)變量的均衡性得到了明顯提高(P>0.05)，見(jiàn)圖1(目錄后)與表3。

表3 匹配后2組一般資料比較

2.2 2組IL-1β基因-511位點(diǎn)基因型比較:PCOS組-511位點(diǎn)基因型頻率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TT基因型頻率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且T等位基因頻率高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 2組IL-1β基因-511位點(diǎn)基因型及等位基因比較[n(%)]

2.3 2組IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因型及等位基因比較:2組患者rs1800796位點(diǎn)基因型及等位基因頻率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5。

表5 2組IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因型及等位基因比較[n(%)]

2.4 2組TNF-α基因rs4645843位點(diǎn)基因型比較:PCOS組rs4645843位點(diǎn)基因型頻率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CC基因型頻率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且C等位基因頻率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 2組TNF-α基因rs4645843位點(diǎn)基因型及等位基因比較[n(%)]

2.5 2組TGF-β1基因-869位點(diǎn)基因型及等位基因比較:2組患者-869位點(diǎn)基因型及等位基因頻率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表7。

表7 2組TGF-β1基因-869位點(diǎn)基因型及等位基因比較[n(%)]

2.6 IL-1β、TNF-α基因多態(tài)性及等位基因與PCOS的相關(guān)性分析:多因素Logistic回歸分析顯示，IL-1β基因-511位點(diǎn)TT基因型(OR=1.974，P<0.05)、T等位基因(OR=2.061，P<0.05)是PCOS發(fā)生的危險(xiǎn)因素，TNF-α基因rs4645843位點(diǎn)TT基因型(OR=0.449，P<0.05)、T等位基因(OR=0.674，P<0.05)是抑制PCOS發(fā)生的保護(hù)因素，見(jiàn)表8-表9。

表8 IL-1β基因多態(tài)性及等位基因與PCOS的多因素Logistic回歸分析

表9 TNF-α基因多態(tài)性及等位基因與PCOS的多因素Logistic回歸分析

3 討論

PCOS作為一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病，其發(fā)病原因與多種因素有關(guān)，如遺傳、環(huán)境、雄激素、肥胖、炎癥因子等[8]，目前其發(fā)病機(jī)制是婦科疾病中研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。細(xì)胞因子是細(xì)胞信號(hào)分子，對(duì)正常妊娠發(fā)育有重要作用，任何表達(dá)數(shù)量或位置上的異常都可能影響滋養(yǎng)層-子宮內(nèi)膜相互作用，從而導(dǎo)致妊娠并發(fā)癥。相關(guān)研究表明，PCOS為一種慢性炎癥性疾病，在肥胖型PCOS患者中，其血清IL-1β水平明顯提高，且MARTíNEZ-GARCíA[9]等研究提示，TNF-α及IL-6與胰島素抵抗密切相關(guān)，其中TNF-α與睪酮水平呈正相關(guān)性，而胰島素抵抗和高雄激素是導(dǎo)致PCOS發(fā)生的重要因素。應(yīng)用傾向性評(píng)分匹配方法研究PCOS患者炎癥因子的基因多態(tài)性，可以在控制已知混雜因素的基礎(chǔ)上從遺傳學(xué)角度探討其發(fā)病機(jī)制，對(duì)于PCOS的診治有重要的意義。

IL-1基因家族在早期懷孕期間起著關(guān)鍵作用，其在卵巢局部被發(fā)現(xiàn)，與卵子的發(fā)育成熟、排卵以及受精卵的種植存在顯著的相關(guān)性[10]。本研究結(jié)果顯示，PCOS組IL-1β基因-511位點(diǎn)TT基因型及T等位基因頻率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，IL-1β基因-511C/T多態(tài)性很可能是PCOS發(fā)生的危險(xiǎn)因素。考慮其原因?yàn)?，炎癥因子IL-1β與肥胖相關(guān)，而高BMI是PCOS發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。RASHID[11]等研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β基因-511位點(diǎn)的T等位基因可促進(jìn)IL-1β分泌；ROSTAMTABAR[12]等對(duì)60例PCOS患者研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β基因-511位點(diǎn)攜帶T等位基因的患者有明顯發(fā)胖的風(fēng)險(xiǎn)。

TNF-α水平的升高與胰島素抵抗、糖耐量的下降顯著相關(guān)，而TNF-α中某些基因的多態(tài)性與TNF-α的分泌改變有關(guān)[13]。本研究顯示，TNF-α基因rs4645843位點(diǎn)CC基因型和C等位基因頻率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。多項(xiàng)研究表明，TNF-α基因rs4645843位點(diǎn)CC基因型是少數(shù)炎癥性疾病的關(guān)鍵標(biāo)記物，其能提高血清內(nèi)TNF-α水平，增加胰島素抵抗發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[14]，且C等位基因頻率增高，將提高血液中甘油三酯和血糖水平，并導(dǎo)致卵泡細(xì)胞進(jìn)一步分泌雄激素，抑制卵泡的發(fā)育成熟，影響正常卵泡組織的排卵[15-16]。因此，TNF-α基因rs4645843位點(diǎn)多態(tài)性可能是誘導(dǎo)PCOS發(fā)生的關(guān)鍵因素。

本研究用多因素Logistic回歸分析結(jié)果提示，IL-1β基因-511位點(diǎn)TT基因型及T等位基因是PCOS的發(fā)生的危險(xiǎn)因素，TNF-α基因rs4645843位點(diǎn)TT基因型及T等位基因是抑制PCOS發(fā)生的保護(hù)因素。IL-1和TNF-α在生殖生理學(xué)中起著關(guān)鍵作用，包括卵泡成熟、排卵和植入，因此，要對(duì)上述基因多態(tài)性進(jìn)行研究，以便更好地描述PCOS的風(fēng)險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，IL-6基因rs4645843位點(diǎn)及TGFβ1基因-869位點(diǎn)多態(tài)性與PCOS的發(fā)生無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性(P>0.05)。

綜上所述，IL-1β和TNF-α基因的遺傳變異與PCOS的發(fā)生具有相關(guān)性，但本研究納入樣本數(shù)量有限，具有一定局限性，且未對(duì)不同BMI數(shù)值的PCOS患者進(jìn)行探究分析，故在后續(xù)的研究中，將繼續(xù)收集病例，并對(duì)所收集PCOS患者的BMI、血脂水平與IL-1β、IL-6、TNF-α及TGFβ1基因多態(tài)性的相關(guān)性進(jìn)行探討分析。