徐月陽，甘均龍，史軍杰，潘均華，彭麗華，成金樂*

（1. 廣州中醫(yī)藥大學 中藥資源科學與工程研究中心，廣東 廣州 510006； 2. 中山市中智藥業(yè)集團有限公司國家中醫(yī)藥管理局中藥破壁飲片技術與應用重點研究室，廣東 中山 528437；3. 廣州中醫(yī)藥大學 嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東 廣州 510006；4. 國家中成藥工程技術研究中心 南藥研發(fā)實驗室，廣東廣州 510006）

明代姚可成《食物本草》首次記載玫瑰花，其味甘、微苦，性溫，無毒，主利肺脾、益肝膽、辟邪惡之氣，食之芳香甘美，令人神爽[1]。玫瑰花藥材為薔薇科植物玫瑰Rosa rugosaThunb.的干燥花蕾，具有行氣解郁、和血、止痛的功效，用于肝胃氣痛、食少嘔惡、月經(jīng)不調(diào)、跌撲傷痛[2]等癥的治療。作為藥食同源品種，玫瑰花的主要活性成分為黃酮類、揮發(fā)油類、多糖類、多酚類（主要為沒食子酸）等[3-9]。現(xiàn)代藥理學研究表明，玫瑰花具有抗疲勞、抗氧化、抗病毒、抑菌作用以及提高免疫功能，對急性心肌缺血損傷的保護作用等[10-16]。玫瑰花破壁飲片是將符合2020年版《中國藥典》要求的玫瑰花傳統(tǒng)飲片，經(jīng)現(xiàn)代粉碎技術加工至粒徑D90＜45 μm以上的粉體，后經(jīng)無添加成型劑的專利技術制成30 ～ 100目的干燥顆粒，具有質(zhì)量均一、成分高效利用、服用便捷等特點[17-20]。2020年版《中國藥典》僅對玫瑰花藥材的性狀、鑒別和浸出物等進行要求，無法較全面的反映其質(zhì)量特征。中藥指紋圖譜以化學成分為基礎，能夠較系統(tǒng)、全面地表征中藥的物質(zhì)基礎概貌[21]。目前，國內(nèi)外尚無玫瑰花破壁飲片的HPLC指紋圖譜研究報道。本實驗首次對玫瑰花破壁飲片開展HPLC指紋圖譜研究，綜合分析玫瑰花破壁飲片的化學成分信息，并以相似度評價比較玫瑰花傳統(tǒng)飲片到破壁粉體再制成破壁飲片三者之間化學成分的相關性以及通過聚類分析和主成分分析比較玫瑰花破壁飲片小試與大生產(chǎn)工藝樣品的區(qū)別，以期為玫瑰花破壁飲片及其原料的質(zhì)量控制以及玫瑰花破壁飲片生產(chǎn)工藝評價提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Millipore TM-D24UV型超純水機（美國密理博公司）；Waters 2695/2988型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

超純水（自制）、甲醇、乙腈（色譜純，安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司）、甲醇、磷酸（分析純，廣州化學試劑廠）、沒食子酸（批號：110831-200803，純度：90.1%，中國食品藥品檢定研究院）、鞣花酸（批號：MUST-19052603，純度：99.65%，成都曼斯特科技生物有限公司）。

玫瑰花傳統(tǒng)飲片：收集15批（詳見表1）種植基地及主產(chǎn)地玫瑰花原藥材，經(jīng)中藥師賈世清鑒定為薔薇科植物玫瑰Rosa rugosaThunb.的干燥花蕾，原藥材凈制，揀去雜質(zhì)，摘除花柄及蒂，后經(jīng)低溫干燥制成傳統(tǒng)飲片。

表1 玫瑰花樣品信息Tab. 1 Sample information of Rosae Rugosae Flos

玫瑰花破壁粉體及破壁飲片：將上述15批傳統(tǒng)飲片依次通過氣流粉碎技術制備成15批破壁粉體（中間體）、再經(jīng)“ 無添加成型”技術，進一步制備成15批破壁飲片成品（小試工藝樣品）。

20批次大生產(chǎn)玫瑰花破壁飲片：生產(chǎn)批號依次 為15060203、20151101、20151201、20160301、20160902、16100102、20170302、20170303、17050102、17060202、20171202、20180101、20180103、20190504、20190503、20190502、20190501、20190203、20190202、20190201；樣品編號依次為UGP16-UGP35。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido CAP Cell MGⅡ C18柱（ 250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序，見表2；流速：0.9 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：300 nm；進樣體積：10 μL。

表2 流動相梯度洗脫程序Tab. 2 Mobile phase gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱定65批玫瑰花樣品各0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇25 mL，稱定重量，超聲30 min，取出放冷至室溫，用提取液補足減少的重量，搖勻，用濾紙濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱定鞣花酸、沒食子酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含沒食子酸 0.08 mg、鞣花酸 0.13 mg的混合對照品溶液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 取編號為UGP1的玫瑰花破壁飲片，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液和80%甲醇空白溶液，進樣，按“2.1”項下色譜條件。結果顯示空白溶劑在色譜條件下無對應色譜峰，表明建立的方法專屬性好。

2.3.2 精密度考察 取編號為UGP1的玫瑰花破壁飲片，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，同一樣品連續(xù)進樣6次，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄測定結果。以1號峰為參照峰，計算共有峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD值均小于3%，結果表明儀器的精密度良好。

2.3.3 重復性考察 取編號為UGP1的玫瑰花破壁飲片，平行6份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件下進行測定，記錄測定結果。以1號峰為參照峰，計算共有峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD值均小于3%，表明分析方法的重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取編號為UGP1的玫瑰花破壁飲片，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h檢測，記錄測定結果。以1號峰為參照峰，計算共有峰的相對峰面積和相對保留時間均小于3%，表明24 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜采集 分別取15批次玫瑰花傳統(tǒng)飲片（DP1-DP15）、破壁粉體（UP1-UP15）、破壁飲片（UGP1-UGP15）及20批次大生產(chǎn)玫瑰花破壁飲片（UGP16-UGP35），按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行分析，得到HPLC指紋圖譜色譜圖。

2.4.2 共有模式的建立及色譜峰的指認 將“2.4.1”項下得到的HPLC指紋圖譜采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2012版進行分析，確認共有色譜峰17個，采用中位數(shù)法生成對照圖譜，結果見圖1-3。通過與對照品的保留時間和紫外吸收峰對比，指認出1號峰為沒食子酸，12號峰為鞣花酸，見圖4。

圖1 15批玫瑰花傳統(tǒng)飲片的指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of 15 batches of decoction pieces of Rosae Rugosae Flos

圖2 15批玫瑰花破壁粉體的指紋圖譜Fig.2 Fingerprints of 15 batches of ultrafine powder of Rosae Rugosae Flos

圖3 35批玫瑰花破壁飲片的指紋圖譜Fig.3 Fingerprints of 35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

圖4 色譜峰的指認Fig.4 Identification of chromatographic peaks

2.5 玫瑰花傳統(tǒng)飲片-破壁粉體-破壁飲片化學成分的相關性分析

采用上述相似度評價系統(tǒng)，分別計算15批玫瑰花傳統(tǒng)飲片、15批破壁粉體、35批破壁飲片的相似度及同批次玫瑰花由傳統(tǒng)飲片到破壁粉體再制成破壁飲片之間的相似度，并生成3種狀態(tài)飲片各自的對照指紋圖譜、計算其相似度。結果表明15批玫瑰花傳統(tǒng)飲片（原料）之間的相似度均大于0.99，15批玫瑰花破壁粉體（ 中間品）之間的相似度均大于0.98，35批玫瑰花破壁飲片（成品）之間的相似度均大于0.98。各批次玫瑰花由傳統(tǒng)飲片到破壁粉體再制成破壁飲片三者之間的相似度均大于0.99，見表3。玫瑰花傳統(tǒng)飲片、破壁粉體和破壁飲片分別生成的共有模式非常相似，如圖5、表4所示三者的相似度大于0.99。上述結果表明，來自同一主產(chǎn)地的玫瑰花藥材化學成分物質(zhì)基礎相較一致，玫瑰花由傳統(tǒng)飲片制成破壁飲片時，只是外觀形態(tài)發(fā)生改變，各主要化學成分均較一致，物質(zhì)基礎傳遞好，制備工藝穩(wěn)定。

表3 15批次玫瑰花傳統(tǒng)飲片-破壁粉體-破壁飲片間的相似度Tab. 3 Similarity among the 15 batches of decoction pieces-ultrafine powder-ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

表4 共有模式相似度結果Tab. 4 Similarity results of shared pattern

圖5 15批玫瑰花傳統(tǒng)飲片-15批破壁粉體-35批破壁飲片共有模式比較Fig.5 Shared mode comparison among the 15 batches of decoction pieces of Rosae Rugosae Flos-15 batches ultrafine powder of Rosae Rugosae Flos-35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

2.6 35批玫瑰花破壁飲片聚類分析和主成分分析

運用SPSS 26.0和SIMCA 14.1軟件對35批玫瑰花破壁飲片樣品進行聚類分析和主成分分析。以17個共有峰的峰面積為變量，采用Ward聯(lián)結法，選用Z得分對數(shù)據(jù)進行標準化，以平方歐式距離測量進行系統(tǒng)聚類，分析結果見圖6，結果顯示，當平方歐式距離為15時，35批樣品被分為2類，其中UGP1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、14聚為一類，其全部為小試工藝制成的玫瑰花破壁飲片。UGP8、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35歸為一類，除UGP8、13、15外，其余全是大生產(chǎn)玫瑰花破壁飲片。以17個共有峰的峰面積為變量進行PCA分析，結果顯示，2個主成分的累計貢獻率達到73.4%。從PCA得分圖顯示35批玫瑰花破壁飲片可大致分為兩類，其中12批小試破壁飲片分為一類（除UGP7、13、15），20批大生產(chǎn)破壁飲片分為一類，與聚類分析的結果基本相一致，得分圖見圖7。為進一步確認造成分類差異的因素對其進行OPLS-DA分析，分析結果見圖8，從中更可以直觀的看出將35批破壁飲片分為兩類，提取OPLS-DA模型中變量的VIP圖，分析結果見圖9，對17個共有峰的峰面積進行VIP排序，顯示17號峰（VIP 1.611 67），5號峰（VIP 1.567 39），10號峰（VIP 1.374 4），11號峰（VIP 1.287 63），4號峰（VIP1.179 83），2號 峰（VIP 1.063 78），3號 峰（VIP 1.031 43），9號峰（VIP 1.028 15）的VIPpred值均大于1，說明以上這些化學成分是造成15批小試制備破壁飲片和20批大生產(chǎn)破壁飲片分類的主要差異性成分。

圖6 35批玫瑰花破壁飲片HCA圖Fig.6 HCA of 35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

圖7 35批玫瑰花破壁飲片PCA-X得分圖Fig.7 PCA-X scores of 35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

圖8 35批玫瑰花破壁飲片OPLS-DA得分圖Fig.8 OPLS-DA scores of 35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

圖9 差異標志物的VIP得分圖Fig.9 VIP scores of different markers

3 討論

在供試品的制備方法優(yōu)化中，考察了提取時間（30、45、60 min）、提取方式（超聲、加熱回流和索氏提?。?、提取溶劑（乙醇和50%、70%、80%、100%甲醇）以及料液比（0.5 g∶25 mL、0.5 g∶50 mL、1 g∶25 mL、1 g∶50 mL）對提取效率的影響，確定了最終的供試品溶液制備方法。

在色譜條件的優(yōu)化中，分別考察了不同檢測波長（254、280、300 nm）、流動相系統(tǒng)（乙腈/甲醇-水；乙腈/甲醇-0.1%冰醋酸水溶液；乙腈/甲醇-0.1%甲酸水溶液；乙腈/甲醇-0.1%磷酸水溶液）并進行梯度優(yōu)化，考察不同柱溫（20、25、30、35、40℃）、流 速（0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2 mL/min）、進樣體積（5、10、15、20 μL）的影響，根據(jù)色譜峰峰形、分離情況等確定上述最佳色譜條件。

本研究通過計算相似度對比分析65批玫瑰花樣品的HPLC指紋圖譜，結果提示，玫瑰花傳統(tǒng)飲片與破壁飲片和粉體之間具有極高的相似度，表明玫瑰花破壁飲片由玫瑰花傳統(tǒng)飲片到破壁粉體再到制粒，只是物理形態(tài)發(fā)生改變，三者之間的化學成分種類基本沒有新增和減少，整體概貌未改變，具有同質(zhì)性。且15批收集的玫瑰花樣品在同一地區(qū)不同區(qū)域之間的相似度大于0.99，表明同一主產(chǎn)地的玫瑰花樣品之間的物質(zhì)基礎相一致。通過聚類分析和主成分分析對不同工藝的玫瑰花破壁飲片樣品進行分析，聚類結果和PCA分析得分圖顯示35批玫瑰花破壁飲片樣品大致分為兩類，可見不同工藝制備的玫瑰花破壁飲片之間存在差異性。進而通過SIMCA軟件進行正交偏最小二乘判別分析，其得分圖明顯顯示35批樣品分為兩類，其中小試一類，大生產(chǎn)一類，通過VIP預測找到主要影響分類的因素，結果表明峰17、5、10、11、4、2、3、9是造成分類的主要因素。說明大生產(chǎn)與小試工藝制成的玫瑰花破壁飲片存在差異，主要表現(xiàn)在峰17、5、10、11、4、2、3、9上。由于本實驗沒有進行上述成分的指認，因此后續(xù)需要進一步進行上述成分的指認及含量測定并考察不同工藝對這些化學成分的影響。

4 結論

本研究所建立的玫瑰花破壁飲片HPLC指紋圖譜方法，確定了17個共有峰，指認了2個化學成分（沒食子酸、鞣花酸）。該方法具有良好的重復性、精密度及穩(wěn)定性，可用于評價玫瑰花傳統(tǒng)飲片到破壁粉體再制成破壁飲片三者之間的物質(zhì)基礎是否發(fā)生改變以及生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，可為玫瑰花破壁飲片的質(zhì)量控制提供參考，后續(xù)研究可進一步在本研究的基礎上結合LC-MS和GC-MS等多種手段對玫瑰花破壁飲片指紋圖譜中的化學成分進行指認。