◎ 殷春燕，謝廣明，韓博洋，張獻忠，李 丹，董占軍

（1.邯鄲學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北 邯鄲 056005；2.河北美臨多維糧油貿(mào)易有限公司，河北 邯鄲 056600）

黃刺玫（Rosa xanthinaLindl）屬薔薇科薔薇屬野生落葉灌木，晉南地區(qū)民間將其稱為馬茹子，廣泛分布于南太行山區(qū)[1-2]。研究表明，黃刺玫果實營養(yǎng)豐富，含有維生素、黃酮、蘆丁等物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)人體機能、抗氧化等功能[3]。黃刺梅果質(zhì)量的50%～60%為黃刺玫籽，其中黃刺玫籽中含脂肪11%左右。黃刺玫籽油中富含維生素E、維生素A等多種微量元素和不飽和脂肪酸（約94%）[4]，其中亞油酸和亞麻酸的含量分別為53.88%、24.06%，因此黃刺玫籽油可作為一種新興油脂產(chǎn)品，具有廣闊的發(fā)展前景。

黃刺玫鮮果資源十分豐富，每667 m2產(chǎn)量為60～80 kg[2]，因相關(guān)研究較少，對其開發(fā)利用不足，導(dǎo)致大量的黃刺玫籽被白白浪費，因此有效利用黃刺玫籽，建立一種綠色高效的黃刺玫籽油提取方法顯得尤為重要。目前，植物油的提取方法主要包括壓榨法、溶劑萃取法、超聲輔助法、水酶法以及超臨界CO2萃取法等[5-8]。其中水酶法因反應(yīng)條件溫和、無溶劑殘留、對環(huán)境友好等優(yōu)點被廣泛用于胡麻籽油[9]、牡丹籽油[10]、山核桃油[11]等植物油脂的提取。黃刺玫籽油作為一種新興油脂產(chǎn)品，相關(guān)研究還較少，目前只有溶劑萃取法[12]和超臨界CO2萃取法[4]被用于黃刺玫籽油的提取，水酶法在黃刺玫籽油提取中的應(yīng)用在國內(nèi)外還沒有相關(guān)報道。因此，本文以水酶法作為提取方法，采用單因素實驗分析5個因素（酶的種類、料液比、酶解時間、pH及酶添加量）對黃刺玫籽油提取率的影響，并在單因素基礎(chǔ)上選出影響較大的因素，利用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計建立模型，對黃刺玫籽油提取工藝條件進行優(yōu)化，確定水酶法提取黃刺玫籽油的最佳工藝，以便為黃刺玫籽油的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃刺玫籽，市售；纖維素酶（≥30 000 U·g-1）、堿性蛋白酶（≥30 000 U·g-1）、中性蛋白酶（≥200 000 U·g-1）、半纖維素酶（≥2 000 U·g-1）、果膠酶（≥30 000 U·g-1），合肥博美生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YS-08高速粉碎機，北京燕山正德機械設(shè)備有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科貿(mào)有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；80-2型臺式電動離心機，國華電器有限公司；GRX-200電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，西安禾普生物科技有限公司；2004-21（61）超級恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；FA2104N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃刺玫籽油的提取

選擇正常并經(jīng)自然干燥，無霉爛的黃刺玫籽，置于60 ℃烘箱中，烘干30 min。將黃刺玫籽用萬能粉碎機進行粉碎，過篩（60目），備用。

準確稱取一定質(zhì)量的黃刺玫籽粉末，加入蒸餾水（料液比1∶8）作為分散相，用0.1 mol·L-1的HCl 和0.1 mol·L-1的NaOH調(diào)節(jié)pH，加酶，混勻，酶解5 h后，95 ℃保溫10 min滅酶，將酶解液在5 000 r·min-1的條件下離心20 min，取上清液即為黃刺玫籽油。對得到的黃刺玫籽油進行稱重，按式（1）計算提取率[13]。

式中：m1-黃刺玫籽油質(zhì)量，g；m0-黃刺玫粉的質(zhì)量，g。

1.3.2 單因素試驗

針對黃刺玫籽酶解過程中涉及的5個主要酶解條件進行單因素試驗，各個條件梯度設(shè)置如表1所示。

表1 單因素試驗設(shè)計表

1.3.3 響應(yīng)面實驗設(shè)計

在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取對提取率影響較大的3個因素，利用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計，以黃刺玫籽油提取率y為響應(yīng)值，優(yōu)化水酶法提取黃刺玫籽油的工藝。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均做3次平行實驗，使用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果以均值±標準差表示。采用Origin8.0繪圖，響應(yīng)面實驗設(shè)計及分析采用Design Expert8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 酶的種類

酶的種類顯著影響植物油脂的提取率。LIU Z等[14]采用超聲輔助水酶法提取無患子種仁中油脂時，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶（65.23%±1.45%）和纖維素酶（60.95%±1.45%）的提取效果最佳，果膠酶（42.52%±0.97%）和α-葡聚糖酶（38.91%±0.89%）的提取率較低。楊瑞[15]研究發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶比中性蛋白酶、纖維素酶更適用于奇亞籽油的提取。

在各酶最適溫度和pH下，分別考察果膠酶（50 ℃，pH4.0）、中性蛋白酶（45 ℃，pH7.5）、纖維素酶（50 ℃，pH4.5）、堿性蛋白酶（45 ℃，pH10）和半纖維素酶（50 ℃，pH5.0）對黃刺玫籽油提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，單類酶中，纖維素酶（6.43%±0.09%）和中性蛋白酶（6.32%±0.08%）的提取率最高且兩者沒有顯著差異，其次為果膠酶（6.10%±0.10%）和堿性蛋白酶（5.92%±0.16%），半纖維素酶（5.41%±0.08%）的提取率最低。相關(guān)研究表明，復(fù)合酶可以產(chǎn)生協(xié)同作用，增加油脂的提取率[14,16]，故在50 ℃，pH6.0條件下測定復(fù)合酶（纖維素酶∶中性蛋白酶=1∶1）的提取率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酶的提取率顯著高于單一酶，故在后續(xù)研究中，選用纖維素酶和中性蛋白酶按照1∶1的比例進行黃刺玫籽油的提取。

圖1 酶的種類對黃刺玫籽油提取率的影響圖

2.1.2 料液比

不同料液比下，黃刺玫籽油的提取率變化情況如圖2所示。由圖2知，料液比＜1∶8時，溶劑比例越大，黃刺玫籽油的提取率越高。當(dāng)料液比＞1∶8時，提取率開始呈現(xiàn)降低趨勢?？赡苡捎诹弦罕鹊脑龃螅瑢?dǎo)致酶與底物濃度的降低，從而引起酶解效率下降[17]，因此在后續(xù)提取過程中選擇料液比為1∶8。

圖2 料液比對黃刺玫籽油提取率的影響圖

2.1.3 酶解時間

不同的酶解時間時黃刺玫籽油的提取率變化情況如圖3所示。隨著酶解時間從2 h增加至5 h，黃刺玫籽油的提取率由2.35%±0.10%增加至6.63%±0.09%。酶解時間大于5 h后，提取率不再發(fā)生明顯變化（p＜0.05）。綜合提取率和時間成本來看，水酶法提取黃刺玫籽油的最佳酶解時間為5 h。

圖3 酶解時間對黃刺玫籽油提取率的影響圖

2.1.4 pH

在不同pH下，黃刺玫籽油的提取率變化情況如圖4所示。隨著pH由4.0增加至6.0，黃刺玫籽油的提取率從4.11%±0.12%增加至最大值6.63%±0.09%，當(dāng)pH由6.0繼續(xù)增加時，提取率開始下降。在pH為8.0時，提取率比pH為6.0時下降了33.18%。在適宜的pH下，酶才能發(fā)揮活性[9]。纖維素酶和中性蛋白酶的最適pH不同，分別為4.5和7.5。在提取過程中，pH偏高或偏低都會影響兩種酶的活力，結(jié)果表明在pH為6.0時兩種酶的綜合活力達到最大，因此所用復(fù)合酶的最適pH為6.0。

圖4 pH對黃刺玫籽油提取率的影響圖

2.1.5 酶添加量

不同酶添加量時黃刺玫籽油的提取率變化情況如圖5所示。在酶添加量為1%～3%，隨著酶添加量的增加，黃刺玫籽油的提取率由5.25%±0.08%增加至6.85%±0.09%，當(dāng)添加量到達3%時，黃刺玫籽油的提取率達到最高。酶添加量為3%和4%時的提取率沒有顯著差異，但當(dāng)酶添加量超過4%時，提取率開始下降。呂秋冰等[18]利用葡聚糖酶提取冬瓜籽油以及楊瑞[15]用堿性蛋白酶提取奇亞籽油時也得到同樣的結(jié)果?？赡苡捎诿柑砑恿窟^大，使得酶的活性部位不能充分暴露，減少了酶與黃刺玫籽粉末的接觸機會，酶作用受到限制[17-18]，因此復(fù)合酶最佳添加量為3%。

圖5 酶添加量對黃刺玫籽油提取率的影響圖

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立

在單因素實驗基礎(chǔ)上，固定條件為酶解溫度50 ℃、料液比1∶8、復(fù)合酶（纖維素酶∶中性蛋白酶）比1∶1，選擇酶解時間、pH、酶添加量3個因素進行Box-Behnken響應(yīng)面實驗設(shè)計，對提取工藝條件進行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗因素水平如表2所示，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果如表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平表

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果表

對表3中實驗結(jié)果進行多元回歸擬合，模型為：提取率y=-47.249 5+2.753 8A+14.640 5B+1.140 2C-0.017 5AB+0.020 0AC+0.057 5BC-0.259 0A2-1.191 5B2-0.254 0C2。方差分析具體情況如表4所示。

表4 方差分析表

由方差分析結(jié)果可知，模型p＜0.000 1，失擬項p=0.117 4＞0.05，說明模型具有極高的顯著性。決定系數(shù)R2=0.996 5，校正決定系數(shù)R2=0.992 0，預(yù)測R2=0.957 1，說明模型適用于預(yù)測不同反應(yīng)條件下黃刺玫籽油的提取率。所選擇的3個因素都顯著影響黃刺玫籽油的提取率（p＜0.05），且影響大小依次為B（pH）＞A（酶解時間）＞C（加酶量）。此外，模型中二次項A2、B2、C2對黃刺玫籽油提取率的影響極顯著（p＜0.000 1），AB、AC、BC對提取率沒有顯著影響（p＞0.05），說明因素間沒有交互作用。

2.2.2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖

不同因素交互作用對黃刺玫籽油提取率影響的響應(yīng)面圖如圖6所示。響應(yīng)面圖能夠直觀反映因素水平改變時提取率的變化情況，響應(yīng)曲面越陡峭說明該因素水平變化時，提取率的變化越大，因素對提取率的影響越顯著[19-20]。

圖6 不同因素對黃刺玫籽油提取率影響的響應(yīng)面圖

從圖6中可以看出，所有的響應(yīng)曲面均存在最高峰，說明在所選擇的因素水平范圍內(nèi)存在最大值，所選擇的因素水平合理[21]。圖6（a）為固定酶添加量在0水平（3%）時，提取率隨酶解時間和pH改變時的變化情況。當(dāng)酶添加量不變時，隨著酶解時間和pH的增加，提取率都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。與酶解時間相比，pH改變時提取率的響應(yīng)曲面更陡峭。圖6（b）為pH固定在0水平（pH6.0）時，提取率隨酶添加量和酶解時間改變時的變化情況。當(dāng)酶添加量為3%、酶解時間為5 h時提取率達到峰值，酶添加量和酶解時間的繼續(xù)增加不會引起提取率的升高，反而導(dǎo)致提取率下降。酶解時間對提取率的響應(yīng)曲面更陡峭。圖6（c）為固定酶解時間0水平（5 h）時，提取率隨酶添加量和pH改變時的變化情況。與上述結(jié)果類似，當(dāng)pH不變時，提取率隨酶添加量的增加，呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，在酶添加量為3%時，提取率達到最大值。同樣，當(dāng)酶添加量不變時，提取率隨pH變化的趨勢類似隨酶添加量的變化。與酶添加量相比，pH對提取率的響應(yīng)曲面更陡峭，說明pH的影響更顯著。這與表4中方差分析的結(jié)果相吻合。

2.2.3 驗證實驗結(jié)果分析

由回歸方程求得黃刺玫籽油提取的最優(yōu)工藝為：酶解時間5 h、酶添加量3.20%、pH6.17，在此工藝條件下，提取率預(yù)測為6.94%。并做3組平行實驗作為驗證實驗?？紤]實際實驗條件，將工藝條件調(diào)整為酶解時間5 h、酶添加量3.20%、pH6.2，得到提取率為7.05%±0.12%，與預(yù)測值相差1.56%，可信度較高，表明回歸模型可以對不同因素條件下黃刺玫籽油的提取率進行預(yù)測。

3 結(jié)論

本文利用水酶法對黃刺玫籽中的油脂進行提取，采用單因素實驗和響應(yīng)面實驗探討不同的酶解條件對黃刺玫籽油提取率的影響，并確定水酶法提取黃刺玫籽油的最佳工藝。最佳工藝條件為固定料液比為1∶8、酶解溫度50 ℃、復(fù)合酶（纖維素酶∶中性蛋白酶）比1∶1、酶解時間5 h、pH6.2以及酶添加量3.20%，在此條件下，提取率為7.05%±0.12%，與預(yù)測值相差1.56%，表明回歸模型可以較好地預(yù)測不同因素條件下黃刺玫籽油的提取率。方差分析結(jié)果表明，所選擇的3個因素都顯著影響黃刺玫籽油的提取率（p＜0.05），且影響大小依次為pH＞酶解時間＞加酶量。