◎ 盧福榮，李 杰，邵 悅，高 陽

（1.營口市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，遼寧 營口 115000；2.歐陸食品檢測服務(wù)（大連）有限公司，遼寧 大連 116023）

菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后所得1 g或1 mL檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。它可以反映食品的新鮮度、被細(xì)菌污染的程度、生產(chǎn)過程中食品是否變質(zhì)和食品生產(chǎn)的一般衛(wèi)生狀況等。在歷年國家監(jiān)督抽檢工作中，不合格的微生物指標(biāo)主要是菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母菌的污染[1]。菌落總數(shù)項(xiàng)目的檢測包括多種產(chǎn)品類別，如糕點(diǎn)、飲料、乳制品及肉制品等，長期食用菌落總數(shù)超標(biāo)的食品對人體健康會(huì)產(chǎn)生危害[2]。因此，食品中菌落總數(shù)的測定具有重要意義，不僅能為深入研究奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供參考。

能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間對比，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評價(jià)參加者的能力[3]，能力驗(yàn)證也是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理運(yùn)行中風(fēng)險(xiǎn)管理和質(zhì)量持續(xù)改進(jìn)的方式之一[4]。營口市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心微生物檢驗(yàn)室2020年參加中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價(jià)中心組織的食品中菌落總數(shù)的檢測能力驗(yàn)證，對2份待測樣品進(jìn)行了稀釋、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，取得結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 測試樣品

樣品1：由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價(jià)中心提供，食品中菌落總數(shù)的檢測能力驗(yàn)證ACAS-PT89（2020），樣品編號(hào)：20-D980。

樣品2：由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價(jià)中心提供，食品中菌落總數(shù)的檢測能力驗(yàn)證ACAS-PT89（2020），樣品編號(hào)：20-R172。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

氯化鈉，批號(hào)：20190515，規(guī)格：500 g/瓶，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂，批號(hào)：1085235，規(guī)格：250 g/瓶，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器，設(shè)備編號(hào)：2015-B3316，廠家：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；生化培養(yǎng)箱，備編號(hào)：150093，廠家：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；生物安全柜，設(shè)備編號(hào)：HR1500-IIA2，廠家：青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；可調(diào)移液器，型號(hào)：容量1 mL，容量10 mL；品牌：普蘭德公司。

1.4 檢驗(yàn)方法

按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）[5]、能力驗(yàn)證參試指導(dǎo)書進(jìn)行檢測。

1.5 操作步驟

1.5.1 樣品前處理

按照參考說明指導(dǎo)，對樣品進(jìn)行處理。將待測試樣品從冰箱中取出，恢復(fù)至常溫，在生物安全柜內(nèi)將待測試樣品1的西林瓶打開，立即加入5 mL無菌生理鹽水進(jìn)行再水化，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，用余下的無菌生理鹽水清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液放入上述無菌瓶中，定容至60.0 mL，充分混勻，此溶液即是待測樣品原液。對樣品2處理方法相同。

1.5.2 樣品稀釋

按照GB 4789.2—2016中“樣品的稀釋”要求對兩份樣品分別進(jìn)行稀釋，用無菌吸管吸取25 mL樣品勻液注入225 mL 0.85%生理鹽水稀釋液中，旋渦充分混勻，再吸取1 mL注入9 mL稀釋液中，逐級稀釋，制成10倍系列稀釋的樣品勻液，即10-1～10-5。

1.5.3 樣品培養(yǎng)

將樣品原液和各稀釋度樣品勻液各取1 mL注入無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對照。及時(shí)將冷卻至46 ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL傾注平皿中，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻，待瓊脂凝固后再覆蓋一層培養(yǎng)基（約4 mL）。待凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，于（36±1）℃下培養(yǎng)48 h。

1.5.4 計(jì)數(shù)與報(bào)告

按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）中的標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行計(jì)數(shù)和結(jié)果報(bào)告。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測結(jié)果分析

樣品計(jì)數(shù)結(jié)果及結(jié)果報(bào)告見表1。對樣品1選取原液進(jìn)行結(jié)果計(jì)算，選取原液、10-1及10-2稀釋度，結(jié)果為220 CFU·mL-1；樣品2選取10-2稀釋度進(jìn)行結(jié)果計(jì)算，選取 10-2、10-3及10-4稀釋度，結(jié)果為10 000 CFU·mL-1。

表1 樣品測試結(jié)果表

菌落計(jì)數(shù)結(jié)果與稀釋度倍數(shù)成反比，且同一稀釋度平行樣品間差異較小，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對準(zhǔn)確，空白對照無菌落生長，表明實(shí)驗(yàn)過程無污染，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

2.2 能力驗(yàn)證結(jié)果分析

能力驗(yàn)證結(jié)果見表2。能力驗(yàn)證評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按照|Z|值進(jìn)行評價(jià)，|Z|＜2.0為滿意結(jié)果；2.0＜|Z|＜3.0為可疑結(jié)果；|Z|≤3.0為不滿意（離群）結(jié)果。營口市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心微生物檢驗(yàn)室兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果|Z|值均小于2.0，且|Z|值較小，評價(jià)結(jié)果滿意。因此，營口市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心微生物檢驗(yàn)室在菌落總數(shù)項(xiàng)目上檢測具有較好的檢測能力。

表2 能力驗(yàn)證評價(jià)結(jié)果表

2.3 菌落總數(shù)檢測質(zhì)量控制分析

本次菌落總數(shù)的能力驗(yàn)證嚴(yán)格按照國標(biāo)方法及操作指導(dǎo)書要求操作，并對實(shí)驗(yàn)過程每個(gè)可能存在不確定度和風(fēng)險(xiǎn)的環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格控制，如實(shí)驗(yàn)備品滅菌情況、無菌操作、樣品液制備及稀釋、稀釋液吸取量、計(jì)數(shù)方面和溫濕度等，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想。

2.3.1 實(shí)驗(yàn)備品滅菌的控制

PCA培養(yǎng)基、0.85%生理鹽水、移液器、槍頭等所有實(shí)驗(yàn)相關(guān)用品應(yīng)嚴(yán)格按照要求，在121 ℃條件下高壓滅菌15 min，確保無菌狀態(tài)，避免對檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不良影響。

2.3.2 無菌操作的控制

嚴(yán)格按照無菌操作要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，開始操作前實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)戴好帽子、口罩、手套，防止樣品被污染，同時(shí)做好個(gè)人安全防護(hù)。樣品內(nèi)可能含有致病菌，因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)前生物安全柜應(yīng)紫外滅菌30 min，用75%乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái)面及操作人員雙手，打開樣品西林瓶前同樣需用75%乙醇擦拭瓶蓋，確保實(shí)驗(yàn)全過程為無菌操作。

2.3.3 樣品液制備的控制

①能力驗(yàn)證的樣品為凍干粉裝，在樣品液的制備過程中，凍干粉應(yīng)充分溶解。為了增加溶解性，將滅菌好的稀釋液（0.85%生理鹽水）放入46 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)保溫。②打開樣品西林瓶，加入5 mL無菌生理鹽水進(jìn)行再水化時(shí)應(yīng)用移液器反復(fù)吹打，使其充分混勻。③為避免氣溶膠的產(chǎn)生，應(yīng)采用帶濾芯的槍頭，同時(shí)控制好吹打力度。④待溶解后，吸出放入無菌瓶中，用余下的無菌生理鹽水清洗西林瓶內(nèi)壁，應(yīng)多次反復(fù)沖洗，確保西林瓶內(nèi)所有菌液都被收集。⑤定容要準(zhǔn)確。

2.3.4 稀釋液吸取量的控制

樣品稀釋液含量會(huì)直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)嚴(yán)格按照稀釋比例進(jìn)行樣品的稀釋。高壓滅菌會(huì)使稀釋液的含量減少，因此，本實(shí)驗(yàn)為避免稀釋液散失，采用滅菌后實(shí)驗(yàn)前定量分裝。同時(shí)要正確使用移液器，確保吸取量準(zhǔn)確。

2.3.5 計(jì)數(shù)瓊脂的控制

實(shí)驗(yàn)室購買的PCA瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)有相應(yīng)的質(zhì)控報(bào)告，同一批次的培養(yǎng)基應(yīng)按照GB 4789.28—2013標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行驗(yàn)收。①培養(yǎng)基溫度要控制在46 ℃左右，將配置好的PCA瓊脂培養(yǎng)基放置46 ℃恒溫水浴鍋中保溫，避免培養(yǎng)基溫度過高或過低影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。②傾注培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)果斷迅速，控制在15 min內(nèi)完成傾注，避免樣品稀釋液中微生物生長或失活，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。③傾注培養(yǎng)基旋轉(zhuǎn)混勻時(shí)，應(yīng)向同一方向旋轉(zhuǎn)5次，然后反方向旋轉(zhuǎn)5次，旋轉(zhuǎn)時(shí)應(yīng)注意防止混合物濺到平皿上方，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。④平皿傾注的厚度按要求為9 cm，培養(yǎng)皿應(yīng)傾注15～20 mL培養(yǎng)基。

為防止培養(yǎng)后菌落蔓延，需在傾注完待瓊脂凝固后，加3～4 mL PCA瓊脂培養(yǎng)基覆蓋平皿表層，便于結(jié)果計(jì)數(shù)。傾注完成的培養(yǎng)基應(yīng)倒置培養(yǎng)，倒置培養(yǎng)可防止培養(yǎng)水分蒸發(fā)時(shí)形成的冷凝水滴落在培養(yǎng)基上造成染菌，同時(shí)可防止菌落蔓延，有利于單菌落的形成，便于計(jì)數(shù)。

2.3.6 計(jì)數(shù)觀察控制

有研究表明，PCA直接傾注法菌落生長相對較快，培養(yǎng)24 h，菌落數(shù)已達(dá)到峰值，因此在培養(yǎng)24 h后應(yīng)進(jìn)行一次觀察計(jì)數(shù)，以防止菌落被覆蓋而影響到計(jì)數(shù)結(jié)果。

3 結(jié)論

本此實(shí)驗(yàn)菌落總數(shù)測定的結(jié)果相對準(zhǔn)確，符合檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)要求及相關(guān)的質(zhì)量要求，能夠?yàn)榫淇倲?shù)檢測提供科學(xué)準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，為實(shí)驗(yàn)室的持續(xù)運(yùn)行提供了技術(shù)支撐，也能更好地為地方食品安全監(jiān)管作出貢獻(xiàn)。

同時(shí)，能力驗(yàn)證也是客觀的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力和管理水平的考核方法，是重要且有效的實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量控制評估手段[3]。能力驗(yàn)證不僅可以真實(shí)的反映出實(shí)驗(yàn)室在項(xiàng)目檢驗(yàn)中的水平，且可通過能力驗(yàn)證的結(jié)果，分析該項(xiàng)目在檢驗(yàn)過程中存在的問題，對不滿意結(jié)果進(jìn)行“人、機(jī)、料、法、環(huán)”多方面分析，從而幫助實(shí)驗(yàn)室解決可能存在的問題，并及時(shí)改進(jìn)。