王飛虎，陸婧雅

（1.無錫市太湖醫(yī)院口腔科，無錫 214044；2.無錫市第二人民醫(yī)院口腔科，無錫 214000）

侵襲性牙周炎是一種常見口腔疾病，其發(fā)病率高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)牙周支持組織具有明顯破壞效果［1］。齲病是發(fā)生于牙體硬組織的的慢性疾病，可導(dǎo)致牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)瓦解，產(chǎn)生齲洞，甚至致使牙齒脫落［2］。近年來，隨著生活水平的提高，口腔疾病的受關(guān)注度越來越高，口腔疾病與腫瘤及心血管疾病共同稱為人類三大重點(diǎn)防治疾?。?］。定植于人體內(nèi)的微生物數(shù)量遠(yuǎn)大于自身細(xì)胞，而口腔由于潮濕、營(yíng)養(yǎng)豐富、pH值及溫度適宜等原因成為體內(nèi)最適宜微生物定植繁衍的場(chǎng)所之一［4，5］。定植于口腔的微生物具有相互拮抗或協(xié)同作用，同時(shí)通過與宿主間的相互作用，影響宿主口腔健康［6］。既往研究證明，侵襲性牙周炎及齲病與口腔微生物息息相關(guān)［7，8］。由于侵襲性牙周炎與齲病臨床癥狀及治療方式不同，臨床上常將兩種疾病作為完全獨(dú)立的病態(tài)變化［9，10］。為從微生物角度進(jìn)一步分析口腔疾病發(fā)病進(jìn)程，了解口腔定植微生物的種類對(duì)口腔健康的影響，本研究將侵襲性牙周炎與高齲患者的唾液微生物作了對(duì)比，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇我院2015年10月～2019年4月確診并收治的侵襲性牙周炎患者17例及高齲患者15例作為牙周炎組及高齲組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）未合并除侵襲性牙周炎及齲病以外的口腔疾??；（2）未合并急慢性感染性疾病；（3）依從性高，能積極配合試驗(yàn)；④納入試驗(yàn)前24h未行超聲潔治。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜20歲或＞60歲；（2）妊娠期或哺乳期婦女；（3）近半年內(nèi)有抗生素使用史；（4）合并嚴(yán)重神經(jīng)及精神障礙。兩組受試者年齡、男女比例等一般資料無明顯差異，具有可比性，詳見表1。本研究符合赫爾辛基宣言，并獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有受試者及家屬對(duì)本研究?jī)?nèi)容及流程充分知情并理解，同時(shí)自愿給予書面同意。

表1 各組受試者一般資料比較

1.2 方法樣本采集：囑受試者禁食2h，并用無菌蒸餾水漱口1次，動(dòng)作輕柔。之后由專業(yè)牙科醫(yī)生采用含漱法取每一位受試者的口咽溶解物與唾液的混合液5ml于無菌EP管中。DNA提取與驗(yàn)純：采用十二烷基硫酸鈉法提取樣本中DNA。在樣本中加入無水乙醇，混勻后靜置15min，棄上清，加入適量溶菌酶，混合均勻后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min，以使細(xì)菌充分裂解。離心取上清液，加入適量十二烷基硫酸鈉混勻于室溫下放置5min，動(dòng)作輕柔避免基因組DNA斷裂。再次離心后所得沉淀即為DNA。取部分所得DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)純度及濃度。整個(gè)過程中保證無菌操作，以免污染樣本。PCR擴(kuò)增及純化：將所得的基因組DNA作為模板，將Bac1與Bac2作為引物，嚴(yán)格按照PCR試劑盒操作說明書，依次經(jīng)依次經(jīng)預(yù)變性（95℃5min）、變性（93℃1min）、退火復(fù)性（55℃1min）、延伸（70℃1.5min）對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。為增加擴(kuò)增產(chǎn)物量，重復(fù)預(yù)變性到延伸過程40次。引物序列：Bac1：5，-CGCCGCGGCGCCCGT CGGCTCCCGACTCGTGAAGCCGCATGCCGTAGCC3，；Bac2：5，-GCAGTACCGCGATTCTAGCTCG-3，。采用2%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳25min驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物純度，采用紫外分光光度儀（深圳市綠生態(tài)科技有限公司，型號(hào)：KPY-V-5100）鑒別合格擴(kuò)增產(chǎn)物。將所得合格擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，根據(jù)所得電泳圖譜，采用非加權(quán)類平均法對(duì)受試者唾液微生物進(jìn)行聚類分析。

1.3 觀察指標(biāo)各組受試者唾液微生物DNA擴(kuò)增情況，變性梯度凝膠電泳圖譜特征，條帶數(shù)量，戴斯相似性系數(shù)，微生物聚類分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究數(shù)據(jù)分析由SPSS 20.0數(shù)據(jù)軟件完成，其中組間計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，聚類方法采用系統(tǒng)聚類法，其中相似性特征度量采用夾角余弦法。當(dāng)P＜0.05時(shí)，提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增情況將兩組受試者唾液微生物分別擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳及紫外分光光度儀檢驗(yàn)純度及完整度后，分別從侵襲性牙周炎組及高齲組各挑選出12個(gè)合格樣本進(jìn)行后續(xù)研究。將24個(gè)樣本分別編號(hào)為AgP 1-12，SC13-24，紫外分光光度儀檢測(cè)結(jié)果詳見表2。

表2 各合格樣本紫外分光光度儀檢測(cè)結(jié)果

2.2 各組受試者唾液微生物變性梯度凝膠電泳圖譜特征每位受試者唾液微生物變性梯度凝膠電泳圖未出現(xiàn)完全相同的泳道，同一疾病組不同個(gè)體的唾液微生物變性梯度凝膠電泳圖存在共有條帶，詳見圖1。

圖1 各組受試者唾液微生物變性梯度凝膠電泳圖譜

2.3 各組受試者唾液微生物變性梯度凝膠電泳圖譜條帶數(shù)量比較侵襲性牙周炎組受試者變性梯度凝膠電泳圖譜平均條帶有（11.27±1.54）條，高齲組受試者變性梯度凝膠電泳圖譜平均條帶有（12.03±1.49）條，兩組受試者變性梯度凝膠電泳圖譜平均條帶無明顯差別，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表3。

表3 各組受試者唾液微生物變性梯度凝膠電泳圖譜條帶數(shù)量比較

2.4 各組受試者唾液微生物戴斯相似性系數(shù)比較侵襲性牙周炎組受試者唾液微生物組內(nèi)戴斯相似性系數(shù)平均為（58.37±9.73）%；高齲組受試者唾液微生物組內(nèi)戴斯相似性系數(shù)平均為（56.16±9.51）%；侵襲性牙周炎組受試者于高齲組受試者唾液微生物組內(nèi)戴斯相似性系數(shù)平均為（21.83±3.69）%。兩組患者組間戴斯相似性系數(shù)明顯低于侵襲性牙周炎組及高齲組患者各自組內(nèi)戴斯相似性系數(shù)，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 各組受試者唾液微生物聚類分析結(jié)果比較侵襲性牙周炎組及高齲組受試者唾液微生物各自形成的聚類群具有明顯區(qū)別（P＜0.05），詳見圖3。

圖3 各樣本唾液微生物聚類分析

3 討論

多種微生物的共同作用對(duì)口腔健康有重要意義，近年來口腔微生物研究逐漸受到科研人員的重視。侵襲性牙周炎及齲病是由微生物引起的最常見的口腔疾病之一，劉樹泰［11］等在其研究報(bào)告中指出，齦下菌斑是侵襲性牙周炎的主要病因。R Puttipan［12］等研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染對(duì)齲病的發(fā)展有重要作用。侵襲性牙周炎及齲病分別破壞牙周支持組織及牙體硬組織，嚴(yán)重危害患者健康及生活質(zhì)量，故而探究口腔微生物對(duì)侵襲性牙周炎及齲病的影響具有重要意義［13，14］。16S rDNA是一種廣泛存在于各種細(xì)菌的基因，由保守區(qū)及高變區(qū)兩部分結(jié)構(gòu)組成［15］。不同細(xì)菌16S rDNA可變區(qū)具有各自特性，故而其可用于細(xì)菌種類的辨別鑒定［16］。本研究使用16S rDNA引物Bac1及Bac2對(duì)唾液中提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過變性梯度凝膠電泳對(duì)微生物群落構(gòu)成進(jìn)行分析。

變性梯度凝膠電泳是用于分析細(xì)菌多樣性的常用手段之一，具有提供群落優(yōu)勢(shì)信息、多個(gè)樣本同時(shí)操作及可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)［17］。研究者可通過所得圖譜上條帶的序列及數(shù)量分析鑒定樣本中細(xì)菌的群落構(gòu)成，其中條帶數(shù)量代表菌群數(shù)量，而形態(tài)可用于辨別菌群種類［18］。但變性梯度凝膠電泳只是一種定性研究，而不能對(duì)唾液中微生物水平高低作出判斷［19］。戴斯相似性指數(shù)常在微生物分析中用于衡量樣本間的相似程度，戴斯相似性指數(shù)越高，說明兩組樣本微生物種類相同部分越多［20］。聚類分析是將研究對(duì)象分為具有相同特質(zhì)群組的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法［21］。生物學(xué)上常使用聚類分析法對(duì)基因進(jìn)行分類，以此獲得對(duì)種群固有結(jié)構(gòu)的認(rèn)知［22］。

本研究結(jié)果顯示，每位受試者唾液微生物變性梯度凝膠電泳圖未出現(xiàn)完全相同的泳道，提示患有相同口腔疾病的患者唾液微生物種類存在個(gè)體差異性，但同一疾病組不同個(gè)體的唾液微生物變性梯度凝膠電泳圖存在共有條帶，提示患有同種口腔疾病的患者唾液中存在相同微生物。侵襲性牙周炎組受試者變性梯度凝膠電泳圖譜平均條帶有（11.27±1.54）條，高齲組受試者變性梯度凝膠電泳圖譜平均條帶有（12.03±1.49）條，兩組受試者變性梯度凝膠電泳圖譜平均條帶無明顯差別，說明侵襲性牙周炎及高齲患者唾液中微生物在群落數(shù)量上無明顯差別。本研究結(jié)果還顯示，任意兩組樣本間的相似系數(shù)均低于100%，且侵襲性牙周炎組與高齲組患者組間戴斯相似性系數(shù)明顯低于侵襲性牙周炎組及高齲組患者各自組內(nèi)戴斯相似性系數(shù)，提示任意樣本間菌群種類及數(shù)量均存在差異，且不同口腔疾病間唾液微生物差異較同一疾病明顯。聚類分析結(jié)果顯示，侵襲性牙周炎組及高齲組受試者唾液微生物各自形成的聚類群具有明顯區(qū)別，進(jìn)一步說明了侵襲性牙周炎與高齲患者唾液微生物存在明顯區(qū)別。

綜上所述，侵襲性牙周炎患者與高齲患者唾液微生物群落構(gòu)成具有明顯差異，不同微生物的定植對(duì)口腔疾病具有重要影響。但由于變性梯度凝膠電泳只是一種定性研究，而不能對(duì)唾液中微生物水平高低作出判斷，故需之后結(jié)合培養(yǎng)法進(jìn)一步分析侵襲性牙周炎及高齲患者唾液中各微生物水平。