郭葉青，劉 娟，李 陽，湯 寧，姚 穗

（1.湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，長沙 410005；2.株洲中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，株洲 412000；3.瀏陽市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，瀏陽 410300）

全面兩孩政策實施后，高齡妊娠（35周歲以上）發(fā)生率顯著上升，其妊娠并發(fā)癥發(fā)生率也明顯增加，包括流產(chǎn)、死產(chǎn)、早產(chǎn)、低出生體重、胎盤植入和子癇前期等［1，2］。有研究發(fā)現(xiàn)將高齡母親的受精卵移植到“年輕”的子宮內(nèi)進行發(fā)育，其后代心臟室中隔缺損的風(fēng)險會大大降低［3］。還有學(xué)者［4］發(fā)現(xiàn)將高齡雌鼠胚胎置于年輕雌鼠子宮內(nèi)代育能改善絕大部分胚胎和胎盤的發(fā)育異常。因此，高齡所致不良妊娠可能還與子宮密切相關(guān)。子宮蛻膜化是成功妊娠的關(guān)鍵因素之一，而雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）蛋白共同調(diào)控子宮蛻膜化［5］。為此，本研究檢測了高齡孕婦蛻膜中ER、PR水平，并研究了其與妊娠結(jié)局的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料與分組對2018年1月～8月間于湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的孕婦，收集其一般資料和妊娠結(jié)局。納入標(biāo)準：自然受孕的單胎妊娠，孕周≥28周，且分娩時成功收集蛻膜組織。排除標(biāo)準：胎兒染色體異?；蛱夯?，子宮畸形，孕期有激素或免疫抑制劑治療史，早產(chǎn)史，糖尿病或高血壓家族史，宮腔操作≥3次，合并嚴重的內(nèi)外科疾病。本研究方案倫理會委員會已批準，研究對象知情、自愿，并簽定知情同意書。最終有141例納入本研究，以年齡≥35周歲定義為高齡，根據(jù)年齡分為年輕組和高齡組，再結(jié)合妊娠結(jié)局分為高齡正常結(jié)局組、高齡不良結(jié)局組、年輕正常結(jié)局組和年輕不良結(jié)局組。

1.2 方法

1.2.1 診斷標(biāo)準子癇前期、妊娠期糖尿?。℅DM）、羊水過少、早產(chǎn)、胎兒生長受限（FGR）、新生兒窒息的診斷標(biāo)準均參照人民衛(wèi)生出版社謝幸等［6］編著的《婦產(chǎn)科學(xué)》（第9版）。分娩孕周依據(jù)末次月經(jīng)和孕早期B超聯(lián)合確定。

1.2.2 觀察指標(biāo)對高齡組和年輕組孕婦的一般資料（包括年齡、分娩孕周、孕產(chǎn)史、孕前BMI指數(shù)、新生兒出生體重、分娩方式等）和不良妊娠結(jié)局發(fā)生率分別比較。分析ER、PR表達情況與妊娠結(jié)局的關(guān)系。

1.2.3 蛻膜組織中ER、PR的檢測胎盤娩出后30min內(nèi)，在無菌操作下，于胎盤母體面中央切取大約為1.0cm×1.0cm×1.0cm大小的蛻膜組織（注意避開鈣化、出血和壞死區(qū)）；用生理鹽水洗凈血漬及細碎組織，置于10%中性緩沖福爾馬林液固定，脫水浸蠟和石蠟包埋，切片，采用SP免疫組織化學(xué)方法，由專人操作，實驗步驟嚴格按照操作方法說明實施，實驗設(shè)置HE染色對照、空白對照和陽性對照。

1.2.4 實驗試劑兔抗人雌孕激素受體單克隆抗體均購自福州邁新生物技術(shù)公司；二抗試劑盒 Kit-0014購自福州邁新生物技術(shù)公司。SP免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.5 結(jié)果判定由同一位病理科醫(yī)師觀察切片。ER和PR陽性染色均主要定位于細胞核，ER與PR陽性細胞的判斷：細胞核內(nèi)出現(xiàn)淺黃色-桔黃色-棕黃色染色顆粒分布。依照Fromowitz綜合計分法［7］。根據(jù)染色的強度分級：細胞核內(nèi)沒有染色或呈均勻一致的淡黃色，與背景一致的為0分；細胞核內(nèi)可見少量的淡黃色顆粒，高于背景的為1分；細胞核內(nèi)可見較多的深棕色顆粒為2分；細胞核內(nèi)可見大量深棕色或褐色顆粒為3分。陽性細胞所占的百分率：無陽性細胞為0分；百分率≤25%為1分；百分率26%～50%為2分；百分率51%-75%為3分；百分率＞75%為4分。取以上兩項之和：和為0-1分為（-）；和為2-3分為（+）；和為4-5分為（++）；和＞5分為（+++）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析運用SPSS 21.0軟件進行分析。計量資料以mean±SD表示，比較兩組樣本總體間差異采用獨立樣本t檢驗（方差齊）或Wilcoxon秩和檢驗（方差不齊），計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗或 Fisher 確切概率法，ER與PR相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析收集的孕婦共141例，其中年輕組88例，高齡組53例，年輕組與高齡組的年齡、分娩孕周、新生兒出生體重和不良妊娠結(jié)局發(fā)生率比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），兩組孕婦孕次、產(chǎn)次、孕前BMI、剖宮產(chǎn)率、新生兒1分鐘和5分鐘Apgar評分分別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表1。

表1 一般臨床資料比較

2.2 不同年齡及妊娠結(jié)局組間ER、PR的比較單純按照年齡或妊娠結(jié)局分組，高齡組ER、PR表達水平較年輕組均顯著下降（P＜0.05）；不良結(jié)局組ER、PR表達水平較正常結(jié)局組均顯著下降（P＜0.05）。結(jié)合年齡和妊娠結(jié)局分組，同一妊娠結(jié)局下高齡組ER、PR表達水平較年輕組下降（P＜0.05）；同一年齡段內(nèi)，不良結(jié)局組ER、PR表達水平較正常結(jié)局組下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 不同年齡及妊娠結(jié)局組間ER、PR的比較

2.3 蛻膜中ER與PR表達水平的相關(guān)性分析蛻膜中ER與PR的表達水平呈弱正相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.301，P＜0.05）（見表3）。

表3 ER與PR表達水平的相關(guān)分析

3 討論

近年來，亞洲地區(qū)女性初產(chǎn)年齡上升2歲左右，高齡孕婦比例上升至19.1%［8］，高齡孕婦妊娠并發(fā)癥及死亡率均有升高［9］。本研究也提示高齡組孕婦早產(chǎn)、子癇前期、GDM、前置胎盤、FGR等的發(fā)生率較年輕組顯著升高。高齡妊娠患者不良妊娠結(jié)局的發(fā)生機制尚未完全闡明，多位學(xué)者［10，11］研究顯示子宮內(nèi)膜蛻膜化異常會導(dǎo)致“漣漪效應(yīng)”，導(dǎo)致胎盤異常、胎兒發(fā)育遲緩、子癇前期和早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局。在子宮蛻膜化中PR至關(guān)重要，而且ER和PR在胚胎植入的發(fā)生中均不可或缺［12］。因此，本研究著重探討了ER、PR與高齡及不良妊娠結(jié)局的關(guān)系。

3.1 ER、PR相關(guān)性及二者與高齡的相關(guān)分析本研究中發(fā)現(xiàn)蛻膜中ER與PR呈弱的正相關(guān)。Hewitt等［13］學(xué)者發(fā)現(xiàn)不僅ER的表達水平與E2作用相關(guān)，PR的表達也與E2水平相關(guān)。Ran［14］學(xué)者發(fā)現(xiàn)Shp2d/d小鼠子宮PR表達顯著降低，與子宮基質(zhì)中ERα激活受限有關(guān)，同時ER靶基因，包括胰島素樣生長因子1（Igf1）和表皮生長因子受體（ErbB-1）在Shp2d/d子宮中的表達也降低。提示PR和ER的表達可能存在某種程度的正相關(guān)關(guān)系，與本研究結(jié)論大致相同。

本研究發(fā)現(xiàn)不論按同一妊娠結(jié)局比較，還是總體比較，高齡組孕婦分娩后蛻膜中ER、PR水平較年輕組均顯著下降。與大多學(xué)者的結(jié)論是一致的，如Woods等［1］發(fā)現(xiàn)在高齡雌鼠蛻膜異常表達的基因中，超過50%的失調(diào)基因均有雌激素受體Esr1和/或Pgr的結(jié)合位點，提示它們可能被雌激素或孕酮調(diào)控。Niklaus［15］和Gul［16］等均研究表明女性子宮中PR表達與年齡呈負相關(guān)。

3.2 ER、PR與妊娠結(jié)局的相關(guān)分析本研究發(fā)現(xiàn)不良妊娠結(jié)局組中ER、PR表達水平較正常結(jié)局組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與大多數(shù)學(xué)者研究結(jié)論一致，Langmia等［17］研究表明PR基因和表達水平下降與早產(chǎn)有關(guān)，推測可能是PR介導(dǎo)作用的喪失促使宮頸發(fā)生結(jié)構(gòu)重建，常駐巨噬細胞增加，從而誘發(fā)早產(chǎn)［18］。有學(xué)者［19］研究發(fā)現(xiàn)胎盤中ESR1表達的降低以及ESR2和PGR蛋白的失活與先兆子癇的發(fā)病有關(guān)。結(jié)合既往文獻，推測機制可能是ER、PR表達下降影響胎盤灌注及其分泌功能，從而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。Kleiblova等［20］研究發(fā)現(xiàn)GDM患者皮下脂肪中ER較正常孕婦的表達降低，但胎盤中ER表達未見明顯差異。Piltonen［21］等研究發(fā)現(xiàn)多囊卵巢綜合征婦女子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞PR呈下降趨勢，子宮蛻膜化反應(yīng)受損，進而導(dǎo)致胎盤受損，發(fā)生不良妊娠結(jié)局。有學(xué)者［22］發(fā)現(xiàn)胎盤合體滋養(yǎng)層細胞中ERβ表達的下降與IUGR有關(guān)，可能與其導(dǎo)致NO輸出降低，滋養(yǎng)細胞侵襲受損有關(guān)。但本研究也與部分學(xué)者研究結(jié)論不一致，有學(xué)者［23］發(fā)現(xiàn)PR-/-雌性大鼠比PR+/+的快速血糖偏低；有學(xué)者［24］曾對卵巢切除的孕鼠，予以維持妊娠的最低劑量孕激素刺激，發(fā)現(xiàn)PR受體表達率最高的胎盤基底區(qū)總重量以及胚胎重量均下降。暫未查詢到關(guān)于新生兒窒息與ER、PR的相關(guān)研究，本研究中高齡與年輕組中新生兒窒息例數(shù)僅為1，可比性不大，有待擴增樣本量后進一步探討。本研究提示高齡組不良妊娠較正常妊娠發(fā)生率顯著升高，而相同年齡段不良結(jié)局組ER、PR表達水平較正常妊娠結(jié)局組稍低，但無統(tǒng)計學(xué)差異。可能與同年齡段兩組各自樣本量小相關(guān)，還可能與不良妊娠結(jié)局一般是多因素多機制及多通道共同作用所致有關(guān)［6］。

綜上所述，高齡孕婦不良妊娠發(fā)生率升高的原因之一可能與高齡所致ER、PR減少有關(guān)。我們可以進一步擴大樣本量研究高齡孕婦孕早期蛻膜組織中ER、PR對妊娠結(jié)局的影響。鑒于母胎界面上的激素—細胞因子網(wǎng)絡(luò)對免疫耐受起重要作用，且Paolino等［25］學(xué)者在Nature上發(fā)表的研究表明性激素可能通過RANK調(diào)控胸腺，從而影響母體免疫及代謝功能，導(dǎo)致流產(chǎn)、妊娠期糖尿病等的發(fā)生。我們可以通過動物實驗進一步探討ER、PR與免疫相關(guān)因子對蛻膜化和妊娠結(jié)局的影響，探討其作用機制，為臨床改善高齡孕婦不良妊娠結(jié)局提供理論依據(jù)。