鄭浩然，蔣愛民，劉 娜，傅 瀟，姚 煜

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061)

在世界范圍內(nèi)，腎癌約占成人惡性腫瘤的2%～3%，其最常見的病理類型為腎透明細(xì)胞癌(renal clear cell carcinoma,RCCC)，約占腎癌病理分型的75%[1]。RCCC預(yù)后差，早期診斷困難，20%的患者初診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，晚期患者5年生存率小于10%[2]。因此，找到RCCC早期診斷及預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。以培唑帕尼、舒尼替尼等為代表的靶向治療是晚期RCCC的傳統(tǒng)一線治療。近年來，免疫治療的出現(xiàn)在晚期RCCC的治療中具有里程碑式意義[3]，腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)也成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，通過生物信息學(xué)方法找到與RCCC腫瘤微環(huán)境相關(guān)的差異表達(dá)基因TNFSF13B，進(jìn)一步驗(yàn)證了其在RCCC中的表達(dá)、對(duì)RCCC預(yù)后的影響及其與RCCC腫瘤微環(huán)境成分的關(guān)系，為RCCC的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、綜合治療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供了新思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源605例RCCC病例(正常樣品72例，腫瘤樣品533例)的轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)均從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥portal.gdc.cancer.gov/)下載。

1.2 ESTIMATE評(píng)分、免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分的計(jì)算

使用R語(yǔ)言estimate包中的ESTIMATE算法估計(jì)腫瘤微環(huán)境中免疫成分和基質(zhì)成分的比率，以3種得分的形式展現(xiàn)：免疫評(píng)分(immune score)、基質(zhì)評(píng)分(stromal score)和ESTIMATE評(píng)分。其分別與免疫成分、基質(zhì)成分和兩者之和呈正相關(guān)。得分越高，TME中相應(yīng)成分的比率越大[4]。

1.3 生存分析及臨床相關(guān)性分析使用R語(yǔ)言survminer包進(jìn)行生存分析，生存曲線通過Kaplan-Meier法繪制，采用對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)，以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)進(jìn)行臨床相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 在免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分的高分組和低分組之間生成差異表達(dá)基因根據(jù)免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分的中位數(shù)將腫瘤樣本分為高分組和低分組。通過R語(yǔ)言limma包對(duì)高分組之間和低分組之間分別進(jìn)行分析，篩選出差異表達(dá)基因(differently expressed genes,DEGs)[5]。以|log2FC|>1和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05作為DEGs的截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)。

1.5 GO和KEGG富集分析通過R語(yǔ)言clusterProfiler、enrichplot、ggplot2軟件包對(duì)篩選出的93個(gè)DEGs進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)分析及京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析，以P值和q值均小于0.05為顯著性富集。

1.6 識(shí)別核心基因首先，采用STRING(https:∥string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)構(gòu)建[6]。隨后，運(yùn)用Cytoscape 3.8.0(http:∥www.cytoscape.org/)[7]中的cytohubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重構(gòu)，采用交互關(guān)系置信度大于0.95的節(jié)點(diǎn)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。其次，通過R語(yǔ)言survival包進(jìn)行單因素Cox回歸分析，分析結(jié)果在森林圖中顯示。最后，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)及單因素Cox回歸分析中發(fā)現(xiàn)的DEGs繪制韋恩圖以獲得核心基因。

1.7 GSEA富集分析從Molecular Signatures(https:∥www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)數(shù)據(jù)庫(kù)下載Hallmark和C7(免疫相關(guān)通路)數(shù)據(jù)集作為目標(biāo)集，進(jìn)行GSEA富集分析[8]。用所有腫瘤標(biāo)本的全部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA富集分析，只有當(dāng)NOMP<0.05且FDRq<0.06時(shí)即為顯著性富集。

1.8 腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞譜及其相關(guān)性分析通過R語(yǔ)言CIBERSORT算法估算所有腫瘤樣本中腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的豐度分布。隨后進(jìn)行免疫細(xì)胞間相關(guān)性分析、免疫細(xì)胞與基因表達(dá)水平差異性和相關(guān)性分析。

1.9 HPA數(shù)據(jù)庫(kù)運(yùn)用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.proteinatlas.org/)初步驗(yàn)證基因在RCCC和正常組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 高免疫評(píng)分與RCCC患者不良預(yù)后及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)除了腫瘤細(xì)胞外，TME主要由免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等成分組成，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中產(chǎn)生重要作用[9]?；|(zhì)細(xì)胞已被證實(shí)在腫瘤的血管生成和基質(zhì)重塑方面發(fā)揮重要作用[10]。而TME中不同種類的免疫細(xì)胞在抗腫瘤和促腫瘤方面發(fā)揮不同作用。越來越多的研究表明，TME中腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞水平可能作為療效預(yù)測(cè)的指標(biāo)[11]。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載RCCC患者的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，通過ESTIMATE算法計(jì)算免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和ESTIMATE評(píng)分，進(jìn)而估計(jì)免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在RCCC微環(huán)境中所占的比例。對(duì)三種評(píng)分分別進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析以建立TME中免疫和基質(zhì)比例與患者生存的相關(guān)性(圖1)。結(jié)果表明，免疫評(píng)分高與RCCC患者預(yù)后不良相關(guān)(P=0.033，圖1B)。然而，ESTIMATE評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分與患者預(yù)后無相關(guān)性(圖1A和圖1C)。隨后，我們研究了3種評(píng)分與RCCC主要臨床病理特征的關(guān)系(圖2)，結(jié)果顯示，免疫評(píng)分高與RCCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.021，圖2G)。

2.2 基于免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分篩選DEGs并進(jìn)行GO和KEGG富集分析將RCCC樣本根據(jù)免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分的中位數(shù)分為高分組和低分組，構(gòu)建基因表達(dá)譜熱圖(圖3A、C)，進(jìn)而篩選出DEGs。結(jié)果表明，兩組之間有44個(gè)上調(diào)的DEGs和49個(gè)下調(diào)的DEGs(圖3B、D)。隨后，我們對(duì)這些DEGs進(jìn)行了GO和KEGG富集分析，以研究這些DEGs最常見的生物學(xué)過程和途徑。GO富集分析結(jié)果表明，這些DEGs主要參與B細(xì)胞增殖、體液免疫應(yīng)答、白細(xì)胞增殖、淋巴細(xì)胞增殖和單核細(xì)胞增殖(圖3E)。KEGG富集分析結(jié)果表明，這些DEGs主要在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用、造血細(xì)胞系、原發(fā)性免疫缺陷、酮體的合成和降解等通路富集(圖3F)。

2.3 通過PPI網(wǎng)絡(luò)和單因素Cox回歸分析確定核心基因我們對(duì)DEGs進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和單因素Cox回歸分析，以確定RCCC中潛在的與預(yù)后相關(guān)的核心基因。圖4A顯示了前52個(gè)基因之間的蛋白質(zhì)相互作用，圖4B用條形圖表示按節(jié)點(diǎn)數(shù)排列的前30個(gè)基因。單因素Cox回歸分析結(jié)果表明，23個(gè)DEGs與RCCC的預(yù)后相關(guān)(圖4C)。最后，我們選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中的前20個(gè)基因與單因素Cox回歸分析篩選出的23個(gè)基因并繪制韋恩圖，從而確定核心基因。結(jié)果表明，只有IGLL5和TNFSF13B重疊(圖4D)。

A：ESTIMATE評(píng)分；B：免疫評(píng)分；C：基質(zhì)評(píng)分。

A～D：ESTIMATE評(píng)分；E～H：免疫評(píng)分；I～L：基質(zhì)評(píng)分。

A：基質(zhì)評(píng)分DEGs熱圖；B：免疫評(píng)分DEGs熱圖；C：免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分共有上調(diào)DEGs的韋恩圖；D：免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分共有下調(diào)DEGs的韋恩圖；E：DEGs的GO富集分析；F：DEGs的KEGG富集分析。

A：PPI網(wǎng)絡(luò)；B：按節(jié)點(diǎn)數(shù)排列的前30個(gè)基因；C：DEGs的單因素Cox回歸分析；D：PPI網(wǎng)絡(luò)中前20個(gè)基因和單因素Cox回歸分析共有基因的韋恩圖。

2.4TNFSF13B的表達(dá)與RCCC預(yù)后、N分期及TME相關(guān)TNFSF13B又稱B細(xì)胞激活因子(BAFF)，在B細(xì)胞生存、增殖、向漿細(xì)胞分化等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。作為免疫相關(guān)基因，我們進(jìn)一步研究了TNSF13B表達(dá)與RCCC預(yù)后、臨床病理特征和TME的關(guān)系。結(jié)果表明TNFSF13B在RCCC腫瘤組織中的表達(dá)顯著升高(圖5A、B)。通過HPA數(shù)據(jù)庫(kù)初步驗(yàn)證TNFSF13B蛋白在RCCC組織中的表達(dá)高于正常組織(圖8D)。生存分析結(jié)果表明TNFSF13B高表達(dá)與RCCC患者更短的總體生存率(OS)顯著相關(guān)(圖5C，P<0.001)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)TNFSF13B的高表達(dá)與RCCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(圖5F)。隨后，對(duì)C7基因集(免疫相關(guān)通路)的GSEA富集分析結(jié)果顯示，TNFSF13B的高表達(dá)主要在抗原的處理和提呈、趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的毒性等通路富集(圖6A)。此外，對(duì)Hallmark基因集的GSEA富集分析結(jié)果表明，在TNFSF13B高表達(dá)組中，多個(gè)免疫通路相關(guān)基因集，如移植物排斥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、補(bǔ)體、IL2-STAT5信號(hào)通路和IL6-JAK-STAT3信號(hào)通路等顯著富集(圖6B)。這表明，TNFSF13B與RCCC免疫微環(huán)境存在一定的相關(guān)性。

A：TNFSF13B在RCCC腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)；B：同一患者來源的正常組織和腫瘤組織中TNFSF13B表達(dá)的配對(duì)差異性分析；C：不同TNFSF13B表達(dá)RCCC患者的生存分析；D～G：TNFSF13B表達(dá)與RCCC患者臨床病理特征的相關(guān)性。

A：TNFSF13B高表達(dá)樣本中C7基因集的GSEA富集分析；B：TNFSF13B高表達(dá)樣本中Hallmark基因集的GSEA富集分析。

2.5TNFSF13B表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的相關(guān)性為了進(jìn)一步證實(shí)TNFSF13B表達(dá)與RCCC免疫微環(huán)境的相關(guān)性，我們采用CIBERSORT算法分析了RCCC腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞亞群的豐度分布(圖7A)，構(gòu)建了RCCC樣本的21種免疫細(xì)胞相關(guān)性圖譜(圖7B)。我們進(jìn)一步繪制了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平相對(duì)于TNFSF13B表達(dá)水平差異性的小提琴圖(圖8A)和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平與TNFSF13B表達(dá)水平相關(guān)性的散點(diǎn)圖(圖8B)。差異性和相關(guān)性分析結(jié)果表明，共11種腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞與TNFSF13B表達(dá)相關(guān)(圖8C)。其中未成熟B細(xì)胞、靜息CD4+記憶T細(xì)胞、活躍樹突狀細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞與TNFSF13B表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。CD8+T細(xì)胞、活躍的CD4+記憶T細(xì)胞、Tfh細(xì)胞、Treg細(xì)胞、γδT細(xì)胞、靜息的NK細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞與TNFSF13B表達(dá)呈正相關(guān)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)TNFSF13B表達(dá)會(huì)對(duì)RCCC腫瘤免疫微環(huán)境產(chǎn)生一定影響。

A：RCCC樣本中21種腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞比例；B：RCCC樣本中21種腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的相關(guān)性。

A：RCCC中21種腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞比例相對(duì)于TNFSF13B表達(dá)水平差異性分析的小提琴圖；B：RCCC中15種腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞與TNFSF13B表達(dá)水平相關(guān)性的散點(diǎn)圖；C：差異性分析和相關(guān)性分析共有的腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞韋恩圖；D：TNFSF13B蛋白在RCCC腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)。

3 討 論

大量研究表明RCCC是免疫原性惡性腫瘤，TME中存在大量浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞，如CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、髓樣細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)等[13]。然而，CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的大量浸潤(rùn)卻與RCCC的高分級(jí)和生存期縮短相關(guān)。研究表明，CD8+T細(xì)胞的高增殖率與RCCC患者生存期延長(zhǎng)相關(guān)，這表明免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)是決定其抗腫瘤活性的關(guān)鍵因素。RCCC中腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞無法發(fā)揮抗腫瘤功能可能是與Treg細(xì)胞、MDSCs等免疫抑制性細(xì)胞的大量浸潤(rùn)相關(guān)[14]。RCCC的免疫抑制狀態(tài)可以通過應(yīng)用靶向免疫檢查點(diǎn)抑制劑的負(fù)向調(diào)節(jié)作用打破，恢復(fù)抗腫瘤免疫反應(yīng)。RCCC中30%的患者存在PD-L1的過表達(dá)[15]，TME中亦經(jīng)常發(fā)現(xiàn)PD-1陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞、MDSCs和NK細(xì)胞。巨噬細(xì)胞中PD-1的表達(dá)與M2型巨噬細(xì)胞的極化以及IL-6的產(chǎn)生增加相關(guān)，從而導(dǎo)致免疫抑制及腫瘤進(jìn)展[16]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑在RCCC的治療過程中顯示出良好的療效，目前，免疫治療以及免疫治療聯(lián)合靶向治療已經(jīng)成為晚期RCCC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療模式。盡管如此，部分RCCC患者對(duì)免疫治療響應(yīng)差，找到能夠影響RCCC腫瘤微環(huán)境及預(yù)測(cè)免疫治療療效的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)掘出的與RCCC患者預(yù)后及TME相關(guān)的關(guān)鍵基因TNFSF13B又稱B細(xì)胞激活因子(B cell activating factor,BAFF)，是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)家族成員之一，在B細(xì)胞增殖分化過程中發(fā)揮重要作用。血液中可溶性BAFF的升高與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[17]。自發(fā)現(xiàn)以來，BAFF在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用一直是研究的熱點(diǎn)。由于BAFF在維持B細(xì)胞和漿細(xì)胞的存活方面發(fā)揮重要作用，血清中BAFF水平的升高與多發(fā)性骨髓瘤和B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤患者不良預(yù)后相關(guān)[18-19]。目前，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)批準(zhǔn)的抗BAFF抗體貝利木單抗(Belimumab)只適用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療，其在B細(xì)胞淋巴瘤的療效仍在臨床試驗(yàn)過程中[20]。在實(shí)體瘤中，已有研究表明，胰腺癌、腎癌及神經(jīng)內(nèi)分泌癌等腫瘤中TNFSF13B表達(dá)升高，且與患者不良預(yù)后相關(guān)[21-23]。RIHACEK等[24]的研究表明BAFF可能通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗導(dǎo)致癌癥患者晚期惡病質(zhì)的出現(xiàn)。最近，YARCHOAN等[25]的研究表明，BAFF在TME中發(fā)揮雙重作用：既可以增強(qiáng)B細(xì)胞對(duì)CD4+Th細(xì)胞的抗原提呈能力，增強(qiáng)TME中Th1細(xì)胞的抗腫瘤活性，又能夠?qū)е耇ME中Treg細(xì)胞的增加，從而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。我們的研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞浸潤(rùn)水平與TNFSF13B表達(dá)呈正相關(guān)，這說明TNFSF13B高表達(dá)可能與RCCC免疫逃逸及免疫抑制狀態(tài)相關(guān)。CD8+T細(xì)胞、活躍的CD4+記憶T細(xì)胞等抗腫瘤免疫細(xì)胞水平雖然與TNFSF13B表達(dá)呈正相關(guān)，但其功能可能處于抑制狀態(tài)，無法發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。TNFSF13B對(duì)RCCC腫瘤微環(huán)境影響的具體機(jī)制仍有待于更詳細(xì)、更具體的體內(nèi)外研究的進(jìn)一步開展。

綜上所述，TNFSF13B基因高表達(dá)與RCCC患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，并對(duì)RCCC腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生一定影響。本研究基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行研究，存在一定的局限性，如樣本量較小、未通過真實(shí)世界進(jìn)行驗(yàn)證等。但本研究找到了與RCCC預(yù)后及TME相關(guān)的關(guān)鍵基因，為RCCC的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、預(yù)后評(píng)估及治療策略提供了一定的依據(jù)，為新型藥品的研發(fā)及RCCC基礎(chǔ)與臨床試驗(yàn)提供了新思路。TNFSF13B有望成為RCCC新的潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物。