紀(jì)梓良，彭艷紅，陳 忠，溫志強，路瑞靜

(1.南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳 518101；2.深圳市寶安區(qū)婦幼保健院檢驗科，廣東深圳 518133)

腎癌是起源于腎小管上皮的惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的3%。根據(jù)2017年的統(tǒng)計，腎癌已成為男性第6常見的惡性腫瘤，而在女性中發(fā)病率排名第10[1]。由于腎癌對放療和化療不敏感，晚期腎癌的5年生存率仍不到10%[2]。另外，目前缺乏有效的腫瘤標(biāo)志物來早期診斷或監(jiān)測腎癌的進展。因此，尋找理想的分子生物學(xué)標(biāo)志物作為腎癌的預(yù)后預(yù)測和治療靶點具有重要的臨床意義。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是繼微小RNA(microRNA，miRNA)及長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)后，RNA家族又一新的內(nèi)源性非編碼RNA，對基因表達(dá)的調(diào)控有重要作用，并成為RNA領(lǐng)域的一個新的研究熱點[3]。由于閉環(huán)結(jié)構(gòu)，circRNA比線性RNA更穩(wěn)定，更適合用作腫瘤標(biāo)志物[4]。大量研究報道，circRNA在多種癌癥(例如肺癌、骨肉瘤和前列腺癌)的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[5-7]。在前期研究中，我們通過測序在腎癌中篩選了一系列異常表達(dá)的miRNA，其中miR-192-5p在腎癌中表達(dá)顯著降低[8]。通過定量實時聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測45對腎癌和鄰近正常腎臟標(biāo)本，證實了miR-192-5p的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞功能實驗表明miR-192-5p可以抑制腎癌細(xì)胞株的增殖、侵襲和遷移[9]。此外，我們使用高通量測序在腎癌中鑒定出21個顯著上調(diào)和32個顯著下調(diào)的circRNA，其中高表達(dá)的circ-STK39在生物信息學(xué)分析中顯示存在與miR-192-5p相互結(jié)合的位點。本研究擬進一步檢測circ-STK39在腎癌組織中的表達(dá)，探討circ-STK39、miR-192-5p調(diào)控通路在腎癌中的作用及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本來源該研究得到南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)和監(jiān)督。所有患者均簽署了書面知情同意書。收取南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院2019年1月至2020年3月期間手術(shù)切除的腎癌標(biāo)本和鄰近的正常腎組織。所有患者均無化療、放療或其他癌癥的病史。其中取離腫瘤邊緣>5 cm的組織作為相鄰的正常腎組織。根據(jù)世界衛(wèi)生組織分類系統(tǒng)進行組織病理學(xué)診斷，并根據(jù)Fuhrman分類系統(tǒng)對細(xì)胞核分級進行評分。

1.2 RNA提取和qRT-PCR使用Trizol試劑(Life Technologies，美國)從組織中提取總RNA。使用NanoDrop分光光度計(Isogen Life Science，荷蘭)測量RNA樣品的濃度和純度。如果A260/A280的比率在1.8～2.1之間，則RNA樣品的純度合格。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Life Technologies，美國)，通過隨機引物對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。使用實時定量PCR系統(tǒng)(ABI 7500，Applied Biosystems，美國)和SYBR Premix Ex TaqTMII(TaKaRa，日本)來進行qRT-PCR反應(yīng)。GAPDH被用作內(nèi)源性對照基因。表1列出了用于qRT-PCR的引物。circRNA的相對表達(dá)水平用2-△△Ct表示。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，美國)中，并在37 ℃含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中生長。

1.4 circ-STK39的Sanger測序及RNase R處理circ-STK39的Sanger測序由廣州吉賽科技公司完成。從ACHN細(xì)胞系提取的RNA，加入RNase R(吉賽科技，廣州)，按3 U/μg RNA配置成20 μL反應(yīng)體系，37 ℃水浴30 min后進行qRT-PCR反應(yīng)，檢測circ-STK39及STK39 mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 circRNA/miRNA/mRNA調(diào)控通路預(yù)測我們使用了RegRNA 2.0(http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw)[10]，circRNA Interactome(https://circinteractome.nia.nih.gov/)[11]和StarBase(http：//starbase.sysu.edu.cn)[12]來預(yù)測circRNA/miRNA/mRNA的調(diào)控通路。使用MiRanda(http://www.microrna.org/microrna/)和Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72)預(yù)測相關(guān)miRNA的潛在靶基因。使用Cytoscape軟件構(gòu)建circRNA/miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析circRNA表達(dá)差異采用配對的Wilcoxon秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用接受者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線和ROC曲線下面積(area under curve，AUC)分析circRNA在臨床中的診斷意義，所有圖形均使用GraphPad Prism(v8.2.1)繪制。

2 結(jié) 果

2.1 臨床標(biāo)本資料收取南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院2019年1月至2020年3月期間手術(shù)切除的腎癌標(biāo)本和鄰近的正常腎組織共31例。平均年齡54歲，其中男性20例，女性11例。病理分型包括透明細(xì)胞癌27例，Xp11.2易位-TFE3基因融合相關(guān)性腎癌2例，嫌色細(xì)胞癌2例。臨床分期大多為Ⅰ期，腫瘤分級大多為T1期，F(xiàn)uhrman分級以G2級為主(表2)。

表2 患者的臨床資料

2.2 生物信息學(xué)分析顯示circ-STK39存在miR-192-5p潛在結(jié)合位點在前期篩選的腎癌中高表達(dá)的circRNA中，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005882(circ-STK39)存在miR-192-5p潛在結(jié)合位點(圖1A)。STK39基因位于2號染色體，STK39 pre-mRNA長度為66 259 bp，包含外顯子14、外顯子13、外顯子12、外顯子11、外顯子10、外顯子9、內(nèi)含子13、內(nèi)含子12、內(nèi)含子11、內(nèi)含子10和內(nèi)含子9。此后，circ-STK39剪切為僅包含外顯子14、外顯子13、外顯子12、外顯子11、外顯子10和外顯子9的閉環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1B)?？?顯示了STK39基因的GC百分率和100個脊椎動物的保守性(圖1B，Box.1)。此外，通過Sanger測序驗證了circRNA的特定反向剪接位點(圖1B，Box.2)。

2.3 circ-STK39在腎癌組織中高表達(dá)為了進一步驗證RNA測序的結(jié)果，我們應(yīng)用qRT-PCR檢測31對腎癌和鄰近正常腎組織標(biāo)本中circ-STK39的表達(dá)水平。如圖2A、B所示，與匹配的正常腎組織相比，腎癌組織中circ-STK39的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)。同時，經(jīng)RNase R核酸外切酶處理后，RNase R未能消化circ-STK39，其表達(dá)量較對照組無明顯差異。而STK39 mRNA表達(dá)卻顯著降低(圖2C)。 結(jié)果表明circ-STK39存在環(huán)化結(jié)構(gòu)，且不被RNase R核酸外切酶所降解，與mRNA相比，其在細(xì)胞內(nèi)更為穩(wěn)定。

A：circ-STK39和miR-192-5p之間的預(yù)測結(jié)合位點示意圖；B：circ-STK39的基因特征示意圖，STK39基因的GC百分率和100個脊椎動物保守性(Box.1)，Sanger測序驗證了circ-STK39的反向剪接位點(Box.2)。

A、B：qRT-PCR結(jié)果顯示circ-STK39在31個腎癌組織中較相鄰正常腎臟組織表達(dá)明顯升高；C：RNase R處理后，circ-STK39表達(dá)無變化；而線性STK39 mRNA表達(dá)顯著下降。

2.4 circ-STK39可作為腎癌的潛在腫瘤標(biāo)志物我們通過繪制ROC曲線，進一步評估了circ-STK39對腎癌的診斷價值。我們發(fā)現(xiàn)circ-STK39具有很高的診斷準(zhǔn)確性，AUC為0.734(95%CI：0.610～0.857，P<0.01，圖3)。敏感性和特異性分別為0.871和0.516。

2.5 circRNA/miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為了進一步研究circ-STK39的潛在生物學(xué)功能，我們利用生物信息學(xué)程序預(yù)測并構(gòu)建了一個circRNA/miRNA/mRNA相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)。該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包含5個miRNA和25個mRNA，這可能有助于預(yù)測circRNA與目標(biāo)基因之間的潛在調(diào)控聯(lián)系。

圖3 Circ-STK39的ROC曲線分析

圖4 Circ-STK39/miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

circRNA是近年來興起的一個新的研究熱點，越來越多的研究表明circRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。circRNA的特征可歸納如下：①豐富性和多樣性：circRNA在多種正常和惡性腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)，其在特定疾病或組織細(xì)胞中的表達(dá)具有多樣性；②穩(wěn)定性：閉環(huán)結(jié)構(gòu)使它們比線性RNA更穩(wěn)定；③保守性：編碼circRNA的基因在物種之間是高度保守的；④細(xì)胞定位：部分包含內(nèi)含子的circRNA通常位于細(xì)胞核中，其余大多數(shù)成熟的circRNA位于細(xì)胞質(zhì)中；⑤特異性：一些circRNA表現(xiàn)出疾病特異性表達(dá)，并可以作為潛在的生物標(biāo)志物發(fā)揮作用[13]。circRNA分子富含miRNA應(yīng)答元件，在細(xì)胞中起到miRNA海綿的作用，能夠解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平，這一作用機制被稱為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)機制。由于高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析的發(fā)展，circRNA在人類惡性腫瘤中的表達(dá)譜和潛在功能正逐漸被認(rèn)識。

最近，越來越多的證據(jù)表明circRNA在腎癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。例如，HUANG等[14]發(fā)現(xiàn)在腎癌中上調(diào)的circPDK1通過調(diào)節(jié)miR-377-3P-NOTCH1軸來促進細(xì)胞遷移和侵襲；FENG等[15]報道了circRNA_001287能夠靶向調(diào)控miR-144/CEP55的表達(dá)促進腎癌細(xì)胞的增殖；circ_0039569被證明可通過調(diào)節(jié)miR-34a-5p/CCL22促進腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[16]。在前期研究中，我們通過使用高通量測序在腎癌中鑒定出53個顯著差異表達(dá)的circRNA(倍數(shù)變化≥2.0，P<0.05)，以及前期研究發(fā)現(xiàn)在腎癌中表達(dá)下調(diào)的miR-192-5p能夠發(fā)揮抑癌的作用，抑制腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移。因此我們試圖尋找能夠靶向調(diào)控miR-192-5p的circRNA。在21個上調(diào)的circRNA中，生物信息學(xué)分析提示circ-STK39能與miR-192-5p結(jié)合。

據(jù)我們所知，目前鮮有關(guān)于circ-STK39的研究，但已有大量研究表明miR-192-5p在各種人類惡性腫瘤中起著抑癌作用，盡管其潛在的分子機制未被完全闡明。ZOU等[17]發(fā)現(xiàn)miR-192-5p通過靶向調(diào)控TRIM44來抑制肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。ZHOU等[18]報道了miR-192-5p通過靶向調(diào)控USP1抑制骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展。在本研究中，我們驗證了在腎癌中，與miR-192-5p的低表達(dá)相反，circ-STK39在腎癌中顯著高表達(dá)。生物信息學(xué)分析顯示circ-STK39帶有miR-192-5p 3非翻譯區(qū)(3 untranslated region，3 UTR)的結(jié)合位點，提示circ-STK39能夠通過海綿狀吸附miR-192-5p從而調(diào)控其表達(dá)。此外，通過Sanger測序和RNase R處理驗證了circ-STK39的特殊剪接位點和閉環(huán)穩(wěn)定性。因此，我們有理由推測，miR-192-5p在腎癌中的抑癌作用可能與circ-STK39的miRNA海綿功能有關(guān)。后期需要進一步的研究，包括雙熒光素酶報告基因、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀等實驗以驗證circ-STK39對miR-192-5p的調(diào)控作用。

如上所述，circRNA在某些癌癥中穩(wěn)定并特異性表達(dá)，這意味著它們適合作為腫瘤標(biāo)志物。例如CHEN等[19]研究表明hsa_circ_0000190在診斷胃癌方面比癌胚抗原和癌抗原19-9具有更好的敏感性和特異性。YAO等[7]報道了在非小細(xì)胞肺癌中，circRNA-100876的上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期密切相關(guān)。在本研究中，我們繪制了circ-STK39的ROC曲線，曲線下面積為0.734。結(jié)果表明，circ-STK39對腎癌的診斷及監(jiān)測可能具有一定的臨床意義。

到目前為止，腎癌中circRNA和miRNA相互作用的研究還很有限。因此，我們基于幾種生物信息學(xué)程序構(gòu)建了circRNA/miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以幫助我們進一步了解circRNA在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用，預(yù)測其可能的調(diào)控通路。

綜上所述，我們的研究驗證了circ-STK39在腎癌中的高表達(dá)。生物信息學(xué)分析表明，高表達(dá)的circ-STK39可能與miR-192-5p的調(diào)控有關(guān)，并可能成為腎癌中的潛在分子標(biāo)志物。后期除了擴大樣本量檢測外，仍需進一步驗證circ-STK39對miR-192-5p的調(diào)控作用，并闡明circ-STK39在腎癌中的生物學(xué)功能和確切分子機制。