張子寬，邵 淵，陳勇全，吳 波，王東文

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，山西太原 030001)

腎腫瘤(renal cell carcinoma，RCC)是人類最常見的實(shí)體腫瘤之一，近年來發(fā)病率迅速上升[1]。2020年美國(guó)有73 750例新發(fā)腎腫瘤患者，同時(shí)有14 830人因腎腫瘤死亡[2]。腎腫瘤經(jīng)常發(fā)生缺氧和壞死，腫瘤缺氧已被證明是患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素[3]，其可削弱手術(shù)、化療、放療等治療方式的療效[4]。因此，許多研究試圖量化腫瘤缺氧程度，并對(duì)其精確測(cè)量以預(yù)測(cè)治療效果[5]。

基于組織的RCC生物標(biāo)志物的檢測(cè)可能有助于預(yù)測(cè)術(shù)后疾病的進(jìn)展和對(duì)輔助治療的反應(yīng)[6]。碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9，CA9)也稱MN蛋白，已被作為預(yù)測(cè)RCC術(shù)前或術(shù)后結(jié)局的生物標(biāo)志物[7]。與正常腎組織相比，CA9在RCC中表達(dá)水平較高[8]，而在正常腎臟中不表達(dá)，因此被認(rèn)為是一種很好的潛在組織生物標(biāo)志物。其主要功能是通過反應(yīng)：CO2+H2O=HCO3-+H+來維持細(xì)胞內(nèi)外pH之間的平衡，從而產(chǎn)生酸性的細(xì)胞外微環(huán)境[9]。CA9作為一種缺氧相關(guān)蛋白，其高表達(dá)與頭頸部腫瘤[10]、卵巢腫瘤[11]的低氧狀態(tài)和不良臨床結(jié)果有關(guān)。圍繞RCC，已有報(bào)道稱高CA9表達(dá)與良好的預(yù)后相關(guān)[12-21]。但也有研究認(rèn)為CA9的表達(dá)與RCC預(yù)后無相關(guān)性[22-23]。CA9的研究產(chǎn)生了矛盾的結(jié)果，因此我們進(jìn)行Meta分析以確定CA9是否可以作為RCC的預(yù)后指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索、納入標(biāo)準(zhǔn)及數(shù)據(jù)提取在PubMed、Cochrane圖書館和Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索關(guān)鍵詞：renal or kidney;cancer or carcinoma or tumor or neoplasm；“carbonic anhydraseⅨ” or “CAⅨ” or “CA9”,以及prognosis or survival，對(duì)CA9在RCC預(yù)后中的作用的文獻(xiàn)進(jìn)行初步文獻(xiàn)檢索。發(fā)表文章時(shí)間截至2020年12月。文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)的腎細(xì)胞癌診斷；②采用免疫組織化學(xué)染色法(immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)原發(fā)性腎癌組織CA9水平。本研究主要評(píng)價(jià)經(jīng)手術(shù)治療的腎腫瘤的預(yù)后與CA9表達(dá)的關(guān)系，未行手術(shù)者則排除。當(dāng)同一患者隊(duì)列被多篇論文報(bào)告時(shí)，患者數(shù)量最多的報(bào)告被納入本研究。

由邵淵和吳波2位研究員提取的數(shù)據(jù)包括納入文獻(xiàn)的基本信息(第一作者、發(fā)表年份、作者國(guó)家和病例數(shù))、腫瘤特征(腫瘤分期和分級(jí))、CA9表達(dá)強(qiáng)弱分界值、生存結(jié)局(CA9表達(dá)相關(guān)生存)。

從PubMed、Web of Science和Cochrane數(shù)據(jù)庫(kù)中，分別檢索出493、318和97篇(共908篇)可能與本研究相關(guān)的文章。使用Endnote軟件后，排除125篇重復(fù)論文。閱讀標(biāo)題和摘要，有71篇論文可用于評(píng)估RCC患者CA9表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性。我們的Meta分析共包括27項(xiàng)研究[12-21,24-40]，其中包括12篇新的研究[25-35,40]，是在最近5年(2014年之后)發(fā)表的。

我們的Meta分析共納入了5 462例患者。這些研究中，有9項(xiàng)采用多變量分析進(jìn)行評(píng)估，18項(xiàng)采用單變量分析進(jìn)行評(píng)估。疾病特異性生存率(disease-specific survival，DSS)、總生存率(overall survival，OS)、無進(jìn)展生存率(progression-free survival，PFS)和無復(fù)發(fā)生存(recurrence-free survival，RFS)分別有9、15、7、6項(xiàng)研究報(bào)道。納入研究的評(píng)估質(zhì)量和基本信息見表1。

1.2 數(shù)據(jù)分析采用危險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)及其95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)的危險(xiǎn)比描述CA9表達(dá)高低對(duì)患者生存的影響。當(dāng)研究中提供HR和95%CI時(shí)，直接提取這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。如果文獻(xiàn)沒有提供數(shù)據(jù)，則使用EngaugeDigitizer軟件(4.1版)從Kaplan-Meier生存曲線中估計(jì)HR值和95%CI，并從曲線中提取存活率，得到HR(SE)值[41]。數(shù)據(jù)分析采用Stata11.0軟件。此外，Q檢驗(yàn)和I2指數(shù)被用于評(píng)估研究的異質(zhì)性。當(dāng)被分析的數(shù)據(jù)具有明顯的異質(zhì)性時(shí)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型[24]，反之采用固定效應(yīng)模型。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 質(zhì)量評(píng)價(jià)所有納入分析的研究都是由2位獨(dú)立的評(píng)審員進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，使用Newcastle-Ottawa質(zhì)量評(píng)估量表進(jìn)行評(píng)估(http:∥www.ohri.ca/programs/clinical_epidemiology/oxford.asp)。研究質(zhì)量評(píng)估主要分為3部分：①隊(duì)列的選擇；②隊(duì)列的可比性；③結(jié)果的準(zhǔn)確性。評(píng)價(jià)表共有8個(gè)項(xiàng)目。當(dāng)研究在第1和第3部分中具有較高質(zhì)量時(shí)，得1分。在第2部分中，文獻(xiàn)有較高質(zhì)量得2分。然后將總分加在一起，得出總評(píng)分進(jìn)而比較文獻(xiàn)質(zhì)量。

1.4 發(fā)表偏倚用Egger檢驗(yàn)，Begg檢驗(yàn)和漏斗圖來評(píng)估發(fā)表偏倚的風(fēng)險(xiǎn)。

1.5 TCGA數(shù)據(jù)集RCC的臨床信息來源于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)門戶。包括588例具有可用臨床信息的病例和72例正常組織樣本。

2 結(jié) 果

2.1Meta分析結(jié)果

2.1.1在RCC中CA9表達(dá)水平與DSS無關(guān) 首先，我們先進(jìn)行了包括所有研究在內(nèi)的分析，結(jié)果表明CA9的表達(dá)水平與DSS無關(guān)(HR=1.18，95%CI：0.82～1.70，I2=79.3%，P<0.05，圖1A)。然而，異質(zhì)性較為明顯，因此我們通過排除低質(zhì)量文獻(xiàn)后再進(jìn)行亞組分析，在只包括高質(zhì)量文章的亞組分析中結(jié)果仍然和前述分析類似(HR=1.40，95%CI：0.89～2.18，I2=39.0%，P=0.161，圖1B)。最后，我們又進(jìn)行了一次只包含較新研究的亞組分析(HR=0.95，95%CI=0.51～1.78，I2=1.1%，P=0.364，圖1C)，結(jié)果也顯示CA9的表達(dá)高低與DSS沒有關(guān)系。

表1 納入研究的27項(xiàng)研究的基本信息和質(zhì)量評(píng)估

A：納入所有研究；B：排除低質(zhì)量研究后；C:只包含較新研究。

2.1.2CA9表達(dá)水平不能預(yù)測(cè)RCC患者的術(shù)后OS 按照前述的方法，我們對(duì)CA9表達(dá)與OS之間進(jìn)行了幾個(gè)亞組分析，共包括15項(xiàng)研究來評(píng)估CA9表達(dá)與OS之間的相關(guān)性。結(jié)果表明CA9表達(dá)與OS無關(guān)(HR=1.13，95%CI：0.82～1.56，I2=79.8%，P<0.05，圖2A)。顯著的異質(zhì)性使我們也需要有像圖1B這樣的亞組分析。在排除低質(zhì)量研究后，結(jié)果仍然沒有變(HR=0.90，95%CI：0.75～1.07，I2=23.1%，P=0.246，圖2B)。正如預(yù)期的那樣，數(shù)據(jù)支持CA9表達(dá)與OS沒有相關(guān)性。在只包括新研究的亞組分析中也有相同的結(jié)果(HR=0.94，95%CI：0.63～1.40，I2=80.9%，P<0.05，圖3A)，但結(jié)果存在顯著的異質(zhì)性，因此我們有一個(gè)額外的分析，低質(zhì)量的研究(質(zhì)量評(píng)分≤6)被刪除，以減少異質(zhì)性。得出了與之前相同的結(jié)果(HR=0.83，95%CI：0.68～1.01，I2=33.1%，P=0.201，圖3B)。

A：包括所有研究；B：排除低質(zhì)量研究后。

A：包括所有新研究；B：只包括高質(zhì)量新研究。

2.1.3RCC中CA9表達(dá)水平與PFS無關(guān) 由于缺乏新研究(只有2項(xiàng)2015年后的研究)，CA9和PFS之間的分析比以前的分析更簡(jiǎn)單，因此我們只進(jìn)行了包括所有研究在內(nèi)的分析，不包括低質(zhì)量的研究。分析共包括7項(xiàng)研究(HR=1.73，95%CI：0.97～3.09，I2=82.4%，P<0.05，圖4A)，結(jié)果表明高CA9表達(dá)與PFS升高有關(guān)。這些結(jié)果可能與納入較少的新文獻(xiàn)有關(guān)。隨后我們進(jìn)行了亞組分析來減少異質(zhì)性，在排除低質(zhì)量研究后，發(fā)現(xiàn)結(jié)果仍然與前面幾項(xiàng)分析的結(jié)果類似(HR=1.04，95%CI：0.79～1.36，I2=0.0%，P=0.465，圖4B)。

2.1.4RCC中CA9表達(dá)水平與RFS無關(guān) 我們還比較了CA9和RFS之間的關(guān)系。與其他分析一樣，我們也沒有發(fā)現(xiàn)CA9和RFS之間的關(guān)系。因?yàn)橹挥休^新的研究有相關(guān)的數(shù)據(jù)，所以只進(jìn)行了包括新研究的分析(HR=0.99，95%CI：0.95～1.02，I2=57.8%，P=0.050，圖5A)。該項(xiàng)分析的異質(zhì)性也很顯著，所有納入研究質(zhì)量評(píng)價(jià)均在6分以上，其中5項(xiàng)評(píng)為8分，只有1項(xiàng)研究評(píng)為7分。因此，進(jìn)行了一個(gè)不包括最低質(zhì)量研究的亞組分析(HR=1.01，95%CI：0.99～1.03，I2=0.00%，P=0.704，圖5B)。無論是圖6A還是圖6B，CA9表達(dá)與RFS沒有相關(guān)性的結(jié)果仍然是穩(wěn)定的。

A：包括所有研究；B：只包含高質(zhì)量研究。

2.1.5發(fā)表偏倚 本研究的發(fā)表偏倚使用漏斗圖和Egger檢驗(yàn)、Begg檢驗(yàn)評(píng)價(jià)。對(duì)于OS的分析，漏斗圖顯示存在發(fā)布偏倚(圖6A)。發(fā)表偏倚通過Egger檢驗(yàn)和Begg檢驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定(Egger’stest=0.040,Begg’stest=0.921)，排除低質(zhì)量研究后，發(fā)表偏倚明顯減少(Egger’stest=0.160,Begg’stest=0.902，圖6B)。其余各項(xiàng)分析結(jié)果均與前述結(jié)果相似，圍繞CA9與OS，僅包括新研究(Egger’stest=0.328,Begg’stest=0.536，圖6C)，排除低質(zhì)量文獻(xiàn)后(Egger’stest=0.844,Begg’stest=1.000，圖6D)；圍繞CA9與PFS的發(fā)表偏倚檢驗(yàn)(Egger’stest=0.308,Begg’stest=0.764，圖6E)，排除低質(zhì)量文獻(xiàn)后(Egger’stest=0.183,Begg’stest=1.000，圖6F)；圍繞CA9與RFS的發(fā)表偏倚檢驗(yàn)(Egger’stest=0.225,Begg’stest=0.462，圖6G)，排除低質(zhì)量文獻(xiàn)后(Egger’stest=0.710,Begg’stest=1.000，圖6H)；圍繞CA9與DSS的發(fā)表偏倚檢驗(yàn)(Egger’stest=0.771,Begg’stest=0.466，圖6I)，排除低質(zhì)量文獻(xiàn)后(Egger’stest=0.262,Begg’stest=0.548，圖6J)；只包括新研究(Egger’stest=0.666,Begg’stest=1.000，圖6K)。CA9與不同生存指標(biāo)的分析結(jié)果均可接受。

2.2 TCGA生物信息學(xué)分析為了驗(yàn)證上述結(jié)果，我們對(duì)CA9與各種生存率相關(guān)性進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。其結(jié)果與前述的分析一致。圖7A～C顯示，所有生存率均有相似的結(jié)果，即低CA9表達(dá)與高CA9表達(dá)之間的生存率沒有差異。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)的分析表明，腎癌CA9的表達(dá)水平高于正常組織。在核分級(jí)和病理分期方面也未發(fā)現(xiàn)各組之間有顯著差異。再進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)CA9的表達(dá)與無疾病生存率(disease-free survival，DFS)(P=0.3，圖7A)、OS(P=0.073，圖7B)、DSS(P=0.204，圖7C)無關(guān)。

A:CA9的表達(dá)與患者DFS的生存曲線；B:CA9的表達(dá)與患者OS的生存曲線；C:CA9的表達(dá)與患者DSS的生存曲線。

3 討 論

CA9的表達(dá)在腫瘤診斷、治療和臨床結(jié)果預(yù)測(cè)方面已有多種應(yīng)用。有些疾病如乳腺癌，可以通過檢查HER2在根治性手術(shù)后的表達(dá)來有效地預(yù)測(cè)預(yù)后[42]。因此很多研究者正在尋找類似的生物標(biāo)志物來預(yù)測(cè)RCC患者的生存情況。

納入的27篇論文中可供分析的數(shù)據(jù)包括CA9的表達(dá)與DSS、OS、PFS、RFS的相關(guān)性。我們的分析表明CA9的表達(dá)高低與不同的生存率均無相關(guān)性。CA9表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性在其他的腫瘤中已被證實(shí)：如CA9在頭頸部[10]、乳腺[43]、食管[44]、胰腺[45]和軟組織腫瘤[46]中表達(dá)，且這些腫瘤預(yù)后差均與CA9的高表達(dá)有關(guān)。腎腫瘤中CA9的表達(dá)則有所不同。除了癌細(xì)胞林島綜合征(von-hippel-lindau，VHL)基因及其所產(chǎn)生蛋白影響CA9的表達(dá)外，也有報(bào)道稱PI3K和未折疊蛋白反應(yīng)也有調(diào)節(jié)作用[47]，這增加了CA9的表達(dá)和RCC預(yù)后的不確定性。除RCC外，在卵巢癌[48]、膀胱癌[49]和宮頸癌[50]的研究中也顯示CA9水平與患者預(yù)后無相關(guān)性。除了上述腫瘤，還有一些存在爭(zhēng)議的，如腦腫瘤，不同的研究中CA9與腦腫瘤的OS和PFS結(jié)果存在矛盾[51-52]。

在大多數(shù)RCC中，特別是腎透明細(xì)胞癌(clear cell RCC，ccRCC)有個(gè)獨(dú)特的特征，即癌細(xì)胞VHL基因突變頻繁發(fā)生[53]。有研究表明，在低氧條件下，CA9表達(dá)對(duì)HIF-1α有依賴性[54]。HIF-1反應(yīng)元件HRE定位于CA9轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)旁邊[11]，提示CA9是HIF-1下游靶基因。當(dāng)腫瘤處于低氧條件時(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-induced factor-1α，HIF-1α)(HIF有2個(gè)部分，一個(gè)固有型β-亞基和一個(gè)氧敏感的α亞基[55])不能被脯氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白羥化，且由于VHL基因突變而被異常的VHL蛋白包圍[56]，HIF-1α不能被26S蛋白酶體降解而持續(xù)存在[57]。這一情況導(dǎo)致HIF-1α的持續(xù)積累和激活[58]。在低氧狀態(tài)和酸性條件下，CA9的表達(dá)由HIF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物介導(dǎo)[59]。在文獻(xiàn)中，由于VHL基因突變導(dǎo)致HIF-1α非氧濃度依賴性積累導(dǎo)致CA9異常增加，使其不能反映真實(shí)的低氧狀態(tài)，這可能使CA9表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)性出現(xiàn)偏差。CA9在RCC中的表達(dá)可歸因于VHL蛋白阻止CA9在常氧時(shí)的蛋白酶體降解，并在無氧或缺氧[60]的情況下表達(dá)。綜上所述，VHL基因突變導(dǎo)致VHL蛋白缺失，不能降解HIF-1α致使HIF-1α的異常積累。在正?；虻脱鯒l件下，HIF-1α可調(diào)節(jié)CA9過表達(dá)，通過檢測(cè)CA9表達(dá)水平無法反映腫瘤缺氧，也無法預(yù)測(cè)患者預(yù)后。

目前還沒有研究表明CA9表達(dá)在腎癌不同治療方式中是否有顯著差異。我們沒有評(píng)估CA9表達(dá)與T、N、M和Furhman核分級(jí)之間的關(guān)聯(lián)，因?yàn)?014年后沒有新的研究報(bào)告關(guān)于它們的完整數(shù)據(jù)，并且在2014年的一項(xiàng)研究中CA9水平與T之間的關(guān)聯(lián)已經(jīng)被證明無關(guān)[7]。在我們的分析中，納入所有研究的分析和只包括高質(zhì)量研究的亞組分析均得出結(jié)論認(rèn)為CA9不能作為預(yù)測(cè)RCC預(yù)后的生物標(biāo)志物。

與幾年前的Meta分析相比，我們納入了更多的文獻(xiàn)，得出了更科學(xué)的結(jié)論。除了DSS、OS和PFS之外，我們還評(píng)估了CA9與RFS的相關(guān)性。為了使結(jié)論更可靠，我們采用生物信息學(xué)分析來驗(yàn)證結(jié)論。

本研究也有局限性，例如觀察性研究低于隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)提供的證據(jù)水平。我們的Meta分析中包含的大多數(shù)研究都是回顧性研究。本研究中，27項(xiàng)納入的研究之間存在顯著的異質(zhì)性。與以往的Meta分析[7]相比，我們沒有限制文獻(xiàn)語言，因此得到了更完整的文獻(xiàn)檢索[41]。異質(zhì)性可能是由以下因素引起的，如來自不同國(guó)家的患者具有不同的腫瘤分期和組織學(xué)類型，對(duì)CA9表達(dá)高低的定義，使用的治療方法，隨訪時(shí)間，不同來源和稀釋的抗體等。為了盡量減少異質(zhì)性，只選擇用IHC測(cè)量CA9表達(dá)水平的研究。此外，我們需要注意發(fā)表偏倚。對(duì)于OS，結(jié)果存在發(fā)表偏差(圖6A、C)。但當(dāng)排除低質(zhì)量的研究后，發(fā)表偏倚明顯降低(圖6B、D)。此外，RFS和DSS沒有顯著的發(fā)表偏倚(圖6H、K)，這表明分析結(jié)果是可信的。另一個(gè)限制是數(shù)據(jù)提取的過程，當(dāng)文獻(xiàn)中不直接提供HR和SE時(shí)，使用生存曲線計(jì)算所需數(shù)據(jù)。該過程不可避免的引入了潛在的異質(zhì)性來源。估計(jì)的HR和SE可能不如研究直接提供的準(zhǔn)確。當(dāng)我們使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生信分析時(shí)，由于數(shù)據(jù)庫(kù)中缺乏患者RFS和CA9的相關(guān)數(shù)據(jù)，我們只能使用DFS。

我們的Meta分析表明，IHC檢測(cè)到的低CA9和高CA9表達(dá)之間沒有發(fā)現(xiàn)各種生存率的差異。