崔笑，廖正凱

·論著·

非小細(xì)胞肺癌中免疫相關(guān)基因的預(yù)后作用

崔笑，廖正凱

430071 湖北，武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤放化療科

構(gòu)建非小細(xì)胞肺癌免疫基因預(yù)后模型，驗(yàn)證其與預(yù)后的相關(guān)性。通過(guò) ssGSEA 對(duì) TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中非小細(xì)胞肺癌樣本進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性的分析，將腫瘤樣本分為高免疫組和低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組，并經(jīng)過(guò) ESTIMATE 算法、免疫基因相關(guān)性分析及 CIBERSORT 算法進(jìn)一步驗(yàn)證分組效果。使用 R 軟件“l(fā)imma”包篩選高、低免疫組及癌和癌旁各自的差異基因，取交集基因進(jìn)行功能聚類(lèi)分析。應(yīng)用單因素 Cox 回歸分析與預(yù)后相關(guān)的基因，通過(guò) Lasso 回歸和多因素 Cox 回歸分析構(gòu)建預(yù)后模型，并使用 Kaplan-Meier 驗(yàn)證模型與患者生存的預(yù)后相關(guān)性。單因素 Cox 分析和多因素 Cox 分析驗(yàn)證了免疫基因預(yù)后相關(guān)模型為獨(dú)立預(yù)后因素，ROC 分析進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)生存預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果將所有樣本分為高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組和低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組，不同組別間 HLA 家族基因和 PD-L1 表達(dá)量有顯著差異。對(duì)篩選出的免疫相關(guān)差異基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析和細(xì)胞功能聚類(lèi)分析，并構(gòu)建免疫基因預(yù)后模型。Kaplan-Meier 驗(yàn)證了該模型與患者生存具有預(yù)后相關(guān)性。ROC 曲線驗(yàn)證該模型為預(yù)后相關(guān)因素。非小細(xì)胞肺癌中差異表達(dá)基因與免疫相關(guān)基因的交集可用于構(gòu)建免疫預(yù)后模型，確認(rèn)其具有免疫預(yù)后功能。

非小細(xì)胞肺癌； TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)；免疫相關(guān)基因；預(yù)后模型

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，而且具有高度的侵襲性。2018 年全球肺癌的新發(fā)確診病例約 210 萬(wàn)例，而死亡病例約 180 萬(wàn)例，是癌癥相關(guān)死亡的主要類(lèi)型[1]。肺癌的病理類(lèi)型可大致分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）。其中，NSCLC 約占原發(fā)性肺癌的 80% ～ 85%，且大多數(shù)患者在診斷時(shí)已發(fā)展至中晚期[2]。盡管 NSCLC 的治療方法正在不斷改善，但其預(yù)后仍然不容樂(lè)觀，生存率仍然很低[3]。近年來(lái)，大量研究表明，腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸、腫瘤血管生成等生物學(xué)行為均受腫瘤微環(huán)境調(diào)控。據(jù)報(bào)道，與 UICC/AJCC TNM 分類(lèi)等對(duì)比，免疫應(yīng)答相關(guān)的指標(biāo)與預(yù)后的相關(guān)性更強(qiáng)，是更好的提示預(yù)后的指標(biāo)，也提示了免疫生物學(xué)標(biāo)志物在肺癌預(yù)后中的重要意義?；诖?，本項(xiàng)研究深入探討了腫瘤組織及癌旁組織中的免疫應(yīng)答基因和相應(yīng)的臨床預(yù)后因素等相關(guān)內(nèi)容，為腫瘤免疫標(biāo)志物的臨床應(yīng)用和免疫治療提供了理論依據(jù)。

腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)會(huì)影響癌癥免疫治療的預(yù)后和結(jié)果[4-7]。肺癌微環(huán)境中的免疫細(xì)胞主要由 T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、少量漿細(xì)胞、NK 細(xì)胞和髓樣來(lái)源的細(xì)胞組成[8-11]。薈萃分析表明腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）在癌癥中的預(yù)后特征是 CD3+和 CD8+TILs 與較好的預(yù)后相關(guān)。最近更多的研究表明，通過(guò)細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞（CD8 T），記憶 T 細(xì)胞（CD45RO+）和 T 輔助細(xì)胞等積極因素，更強(qiáng)的 TIL 浸潤(rùn)可以改善總生存期[12]。其中，TIL 是重要的免疫微環(huán)境的組成成分，有望成為治療效果的預(yù)后指標(biāo)和預(yù)測(cè)性生物指標(biāo)。

本研究中，將 TCGA（https://portal.gdc.cancer. gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中的肺癌病例分為高和低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組（簡(jiǎn)稱高免疫組和低免疫組），然后對(duì)其評(píng)分并比較各組之間的差異。人白細(xì)胞抗原（HLA）家族基因和程序性死亡配體 1（PD-L1），在癌癥組織中顯示出差異。通過(guò)篩選與預(yù)后相關(guān)的免疫基因構(gòu)建免疫預(yù)后模型，并使用多種方法進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的預(yù)后作用。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集與整理

從 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得肺癌患者臨床病例數(shù)據(jù)和 HTSeq-FPKM 數(shù)據(jù)。通過(guò) R 軟件分析肺癌的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫相關(guān)基因等數(shù)據(jù)，構(gòu)建免疫相關(guān)基因的預(yù)后模型，并進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的有效性。本研究收集了535 份肺腺癌（LUAD）腫瘤組織和 59 份癌周正常組織樣本，502 例肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）組織和49 例癌周正常組織樣本。通過(guò)“GSVA”軟件包對(duì)每例樣本 FPKM 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和評(píng)分，根據(jù)單樣本基因富集分析（ssGSEA）結(jié)果，使用“hclust”包對(duì)結(jié)果處理并將腫瘤樣本分為高免疫組和低免疫組[13]?；颊叩目偵嫣鞌?shù)應(yīng)≥ 30 d，以進(jìn)行與預(yù)后相關(guān)的進(jìn)一步分析。

1.2 免疫指標(biāo)評(píng)分與分組驗(yàn)證

基于 FPKM 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)，使用 R 軟件中的 ESTIMATE 算法，以腫瘤組織中的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞為基礎(chǔ)計(jì)算每個(gè)樣本的基質(zhì)、免疫、ESTIMATE 評(píng)分和腫瘤純度評(píng)分，以驗(yàn)證 ssGSEA 分組的準(zhǔn)確性。同時(shí)分析各組免疫相關(guān)基因如HLA家族基因和PD-L1的基因表達(dá)水平，以再次驗(yàn)證分組結(jié)果。

1.3 篩選差異表達(dá)基因

根據(jù)每個(gè)樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果使用維恩分析篩選出差異表達(dá)基因（DEGs），并通過(guò) R 軟件“l(fā)imma”包[14]進(jìn)行高免疫組和低免疫組的比較。|logFC| > 0.5 且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）< 0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 GO 富集分析

通過(guò) ImmPort 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.immport. org/home）獲得免疫相關(guān)基因（IRG）。使用多個(gè)軟件包（Bioconductor 的“colorspace”“stringi”“ggplot2”“DOSE”“clusterprofiler”“enrichplot”）對(duì)免疫相關(guān)基因進(jìn)行功能富集分析，以根據(jù) GO 類(lèi)別對(duì)基因進(jìn)行解釋生物過(guò)程，分子功能和細(xì)胞成分等功能。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)由 STRING 網(wǎng)站（https://string-db.org/）和 Cytoscape 軟件[15]建立。其中，使用 Metascape（http:// metascape.org）[16]進(jìn)行 PPI 分析，應(yīng)用分子復(fù)合物檢測(cè)（MCODE）算法來(lái)識(shí)別蛋白質(zhì)在 PPI 網(wǎng)絡(luò)中緊密連接的鄰域相關(guān)蛋白。

1.5 篩選預(yù)后標(biāo)記的免疫相關(guān)基因

1.6 生存分析

根據(jù)預(yù)后模型中免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平計(jì)算每個(gè)樣品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并通過(guò)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將所有樣品分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。使用 Kaplan-Meier 生存分析評(píng)估不同組患者的OS。通過(guò) R 軟件“survminer”包選擇最佳的 cut-off 值，進(jìn)行 Kaplan-Meier 生存分析以比較高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組別間的總生存期差異。

2 結(jié)果

2.1 免疫相關(guān)群體的構(gòu)建和確證

從 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了腫瘤組織和癌旁組織的免疫相關(guān)數(shù)據(jù)。根據(jù)免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)水平，將所有 LUAD 和 LUSC 樣本分為高免疫組和低免疫組。ESTIMATE（使用表達(dá)數(shù)據(jù)估計(jì)惡性腫瘤組織中的基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞）算法驗(yàn)證了上述分組結(jié)果的可靠性。正如預(yù)期的那樣，低免疫細(xì)胞組的腫瘤純度更高，而高免疫組的 ESTIMATE 得分、免疫得分和基質(zhì)分?jǐn)?shù)更高，箱形圖顯示了兩個(gè)免疫相關(guān)組之間得分的顯著差異（圖 1）（< 0.001）。

2.2 免疫相關(guān)基因與免疫細(xì)胞之間的差異分析

為驗(yàn)證上述分組的準(zhǔn)確性，對(duì)高免疫組和低免疫組的HLA家族基因和 PD-L1 的表達(dá)水平進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)與低免疫浸潤(rùn)組相比，高免疫浸潤(rùn)組的HLA家族基因（圖 2A）和 PD-L1（圖 2B）的表達(dá)水平明顯更高（均< 0.001）。此外，不同組別中 TIICs 亞型的富集水平也不同（圖 2C，< 0.05）。

2.3 篩選DEG 和功能特征分析

分析 LUAD 的 535 個(gè)樣本和癌旁 59 個(gè)樣本，以及 LUSC 502 個(gè)樣本和癌旁 49 個(gè)樣本之間的差異表達(dá)基因（|log2FC| > 2 且FDR < 0.05），發(fā)現(xiàn)分別有2748 和 3633 個(gè)基因存在差異表達(dá)。比較高免疫組和低免疫組后，分別在 LUAD 和 LUSC 中篩選出 3952 和 1808 個(gè)差異表達(dá)的免疫相關(guān)基因。根據(jù)以上結(jié)果，借助雙向 Venn 分析，重疊部分包括LUAD 中 749 個(gè)（12.6%）基因和LUSC 中 578 個(gè)（11.9%）基因（圖 3A）。在 LUAD 中，GO 分析顯示差異基因主要與吞噬作用、體液免疫反應(yīng)、蛋白激活級(jí)聯(lián)、補(bǔ)體激活、基于免疫球蛋白家族結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的免疫受體重組的適應(yīng)性免疫反應(yīng)、淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、免疫球蛋白復(fù)合物和抗原結(jié)合有關(guān)（圖 3B）。LUSC 中最重要的功能包括白細(xì)胞遷移、免疫反應(yīng)等的中性粒細(xì)胞激活、細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)等（圖 3C）。LUAD 中上調(diào)基因包括 CCL25、CCL23、SAA1、FPR2、EDN2，下調(diào)基因包括 MMP7、MMP3、MMP1、CCL7。LUSC 中，上調(diào)基因包括 PPBP、CXCR1、CXCL2、FPR2、FPR1、S1PR1、AGTR2、P2RY14、S1PR4、C5AR1、CCL25、CCL23，下調(diào)基因包括 CYP27B1、CYP27A1、CYP4B1、CYP2B6、CYP2W1。此外，通過(guò) Metascape 和 Cytoscape 軟件分析 DEG，建立PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3D，E）。

圖1 根據(jù)免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)水平對(duì) LUAD（A）和 LUSC（B）免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分組并驗(yàn)證（低免疫組的腫瘤純度更高，而高免疫組的免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和 ESTIMATE 評(píng)分更高，***P < 0.001）

Figure 1 According to the expression levels of immune cells and stromal cells, LUAD (A) and LUSC (B) samples divided into a high immune cell infiltration group and a low immune cell infiltration group (Tumor purity of the low-immune group was higher, while the immune score, stromal score and ESTIMATE score of the high-immune group were higher,***< 0.001)

圖2 HLA 家族基因和PD-L1 在免疫細(xì)胞中具有顯著差異[在高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組（紅色）中，HLA 家族基因和PD-L1 的表達(dá)在CIBERSORT 圖（A）和箱圖（B）中均較高；高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組（紅色）和低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組（藍(lán)色）之間各類(lèi)免疫細(xì)胞的比例不同（C）]

Figure 2 HLA family genes and PD-L1 shows a significant difference in immune cells [The expression of HLA family genes and PD-L1 in high immune cell infiltration group (red) were all accordingly higher, both in CIBERSORT chart (A) and box-plot (B); It also meaningfully showed the different proportion of each immune cell between the high immune cell infiltration group (red) and the low immune cell infiltration group (blue) (C)]

圖3 差異基因和功能聚類(lèi)分析（A：通過(guò)雙向 Venn 分析篩選出差異表達(dá)基因；B：GO 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 LUAD 中差異基因功能；C：GO 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 LUSC 中差異基因功能；D：LUAD 核心基因PPI 網(wǎng)絡(luò)分析；E：LUSC 核心基因PPI 網(wǎng)絡(luò)分析）

Figure 3 Identification of the DEGs and functional analysis (A: Differentially expressed genes were determined in the tumor group in LUAD and LUSC; B: GO analyses of the DEGs of LUAD; C: GO analyses of the DEGs of LUSC; D: Protein-protein interaction network of LUAD; E: Protein-protein interaction network ofLUSC)

2.4 篩選預(yù)后相關(guān)免疫基因并構(gòu)建預(yù)后模型

根據(jù)以上所有研究結(jié)果和數(shù)據(jù)，在 LUAD 中，通過(guò)單變量 Cox 回歸分析從所有 749 個(gè) DEG 中選擇了 18 個(gè)（< 0.01），并通過(guò) Lasso Cox 回歸分析選取了 17 個(gè)基因。最后，經(jīng)過(guò)多變量 Cox 回歸分析后，使用 9 個(gè)關(guān)鍵基因（MYBPC1、AC005291.2、KRT6A、AL606489.1、SFTPA2、SPN、NT5E、INSL4 和 RAB3B）構(gòu)建了預(yù)后模型。在 LUSC 中，通過(guò)單變量 Cox 回歸分析從 578 個(gè) DEG 中篩選出 19 個(gè) DEG（< 0.01），通過(guò) Lasso Cox 回歸分析篩選出 11 個(gè)基因，最后6 個(gè)關(guān)鍵基因?yàn)镸MP12、TUBA3E、PTGIS、PLA2G1B、SLC16A4 和 ODAPH 構(gòu)建預(yù)后模型（圖 4A）。以上均通過(guò) 10 輪交叉驗(yàn)證（圖 4B）。根據(jù)這些基因的表達(dá)水平計(jì)算每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并通過(guò)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將所有樣品分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。使用 Kaplan-Meier 生存分析評(píng)估不同組患者的OS。低風(fēng)險(xiǎn)組（藍(lán)色）患者的OS高于高風(fēng)險(xiǎn)組（紅色），表明篩選出的關(guān)鍵基因具有預(yù)后功能（< 0.001）（圖 4C）。

Figure 4 Analysis of the correlation between survival and prognosis in lung cancer [A: The Lasso Coxshows 17 genes of LUAD and 11 genes of LUSC genes most correlated with prognostics; B: The optimal values of the penalty parameter were determined by 10-round cross-validation; C: In survival probability observation high-risk group (red) got a much worse overall survival (OS) than the low-risk group (blue)]

2.5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)的預(yù)后模型構(gòu)建及評(píng)估

LUAD 和 LUSC 患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布（圖5A，B）及相應(yīng)的生存狀態(tài)（圖5C，D），提示高風(fēng)險(xiǎn)組患者的總生存期更短。圖 5E 和圖 5F 分別展示了 LUAD 和 LUSC 中不同風(fēng)險(xiǎn)分組的各個(gè)預(yù)后模型基因的表達(dá)熱圖。

單因素和多因素 Cox 回歸分析用于驗(yàn)證上述免疫基因構(gòu)建的預(yù)后模型是肺癌的獨(dú)立預(yù)后因素，而與年齡、性別、臨床分期和病理分級(jí)等臨床特征無(wú)關(guān)。無(wú)論是在 LUAD 中還是在 LUSC 中，在高表達(dá)和低表達(dá)組中，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分免疫基因預(yù)后相關(guān)模型都是肺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。在單變量 Cox 回歸分析中，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和 95%CI 的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）分別為 1.235 和 1.090 ～ 1.400（< 0.001），在多變量 Cox 回歸分析中，風(fēng)險(xiǎn)得分和 95%CI 的風(fēng)險(xiǎn)比（< 0.05）為 1.204 和 1.048 ～ 1.384（圖 6A，C）。在 LUSC 中，風(fēng)險(xiǎn)變量和 95%CI 的危險(xiǎn)比（HR）在單變量 Cox 回歸分析中（< 0.001）為 1.022 和 1.013 ～ 1.031，在多變量 Cox 回歸分析中（< 0.001）為 1.019 和 1.009 ～ 1.029（圖 6B，D）。為了驗(yàn)證敏感性和特異性，進(jìn)行了時(shí)間依賴性受體工作特征（ROC）分析，并且風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的 ROC 曲線下面積（）分別為 0.75 和 0.629（圖 6E，F(xiàn)），提示預(yù)后特征是高度可靠的。

Figure 5 Analysis of risk score in lung cancer [Synthesize the information of each sample of observer, perform their risk scores, and make a risk score chart (A, B); The scatter plot of the sample survival overview of both LUAD (C) and LUSC (D); The green and red dots represent survival and death, respectively. With view of the Heatmap, the gene expression levels of the high- and low-risk groups are divided into 14 levels. The high- and low-risk groups can be distinguished by the color bar at the top, pink or blue. The gene expression levels can be observed through the example from green to red on the right (E, F)]

Figure 6 Analysis of the heterogeneity of the characteristics of different cases in lung cancer [The univariate (A, B) and multivariate (C, D) Cox regression evaluated the independent prognostic of the risk score value except for age, gender, stage, and TNM stage. Calculate thefor the above items of the total survival risk score according to the ROC curve (E, F)]

3 討論

NSCLC 是全球最具侵略性的癌癥之一，具有高發(fā)病率和致死率。近年來(lái)，包括化學(xué)療法、放射療法、靶向療法和免疫療法在內(nèi)的治療方法的創(chuàng)新并未從根本上改善 NSCLC 的療效，預(yù)后仍然很差。面對(duì)這種情況，個(gè)體化治療的概念變得越來(lái)越重要，選出特定的生物學(xué)特性或生物標(biāo)記物迫在眉睫。因此，我們使用 TCGA 進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，篩選可以預(yù)測(cè) NSCLC 患者預(yù)后的免疫相關(guān)基因。

研究表明，癌癥的惡性取決于腫瘤細(xì)胞的固有特征以及腫瘤微環(huán)境中的成分，包括免疫細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、炎性介質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)分子。腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞是非腫瘤細(xì)胞的兩種主要類(lèi)型，已被證明是診斷和預(yù)后評(píng)估的關(guān)鍵因素[4, 18-21]。TILs 在多種癌癥中表現(xiàn)良好，尤其是細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞、記憶 T 細(xì)胞和 T 輔助 1 細(xì)胞與多種癌癥的臨床預(yù)后呈正相關(guān)，包括黑色素瘤、頭頸癌、乳腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、腎癌、前列腺癌和肺癌[5-7]。TILs的類(lèi)型和密度已成為大腸癌和肺癌臨床分期和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物[12-13]。因此，腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞（TIIC）和基質(zhì)細(xì)胞在診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)以及個(gè)體治療策略中都至關(guān)重要。每種 TIIC 都有特定的功能，具體取決于細(xì)胞中成千上萬(wàn)基因的表達(dá)，為此，TIIC 中的基因表達(dá)為進(jìn)一步研究提供了更準(zhǔn)確的基礎(chǔ)。在本研究中，通過(guò)使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，特別是關(guān)于基因的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)以及從 TCGA 獲得的 NSCLC 的臨床病理特征，我們分別篩選和驗(yàn)證了與 LUAD 和 LUSC 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)的預(yù)后標(biāo)志基因。

基于肺癌的 TCGA 數(shù)據(jù)集，我們首先構(gòu)建并驗(yàn)證了按免疫細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)程度分類(lèi)的兩個(gè)免疫相關(guān)組，并通過(guò) HLA 和 PD-L1 的表達(dá)驗(yàn)證了 NSCLC 中免疫微環(huán)境的異質(zhì)性，比較兩組中 HLA 家族基因和 PD-L1 的不同表達(dá)，驗(yàn)證了兩個(gè)免疫相關(guān)組的可靠性。我們?cè)?TCGA 數(shù)據(jù)集中獲得并篩選了具有預(yù)后價(jià)值的 DEG，然后進(jìn)行功能分析，并為這些基因構(gòu)建了 PPI 網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)免疫相關(guān)的差異基因應(yīng)用單因素和多因素 Cox 回歸分析等方法構(gòu)建預(yù)后分析模型，并使用 Kaplan-Meier 等多種方法驗(yàn)證預(yù)后模型是肺癌的獨(dú)立且穩(wěn)定的預(yù)后指標(biāo)。LUAD 中的 9 個(gè)基因和 LUSC 中的6 個(gè)基因作為肺癌的預(yù)后標(biāo)志物，它們?cè)谀[瘤免疫應(yīng)答中具有特定作用，例如 NT5E 下調(diào)了體內(nèi)和體外膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)，并作為分子診斷和預(yù)后的血清學(xué)指標(biāo)臨床上結(jié)腸癌的發(fā)生具有相關(guān)性[22]。SPN 的過(guò)表達(dá)會(huì)引起抑癌蛋白 p53 和 ARF 的激活，它也是肺癌的潛在治療靶點(diǎn)[23]。同樣，我們確定包括 MMP12 和 SLC16A4 在內(nèi)的 6 個(gè)基因作為 LUSC 的預(yù)后標(biāo)志。MMP12 促進(jìn)腫瘤在肺組織中的增殖[24]，MMP12 的高表達(dá)與胃癌有關(guān)，而SLC16A4 是胰腺癌細(xì)胞代謝和存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，與侵襲性腫瘤生物學(xué)特征有關(guān)，并預(yù)示著尿路上皮癌不良預(yù)后[25]。

簡(jiǎn)而言之，我們首先在 LUAD 和 LUSC 中篩選了與免疫浸潤(rùn)密切相關(guān)的差異表達(dá)基因，然后使用這些差異基因構(gòu)建并驗(yàn)證了與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的免疫預(yù)后模型，可作為肺癌的潛在免疫預(yù)測(cè)因子。該研究還需要進(jìn)一步的前瞻性研究來(lái)支持結(jié)果并優(yōu)化我們的預(yù)后模型?？傊?，本研究為肺癌的預(yù)后提供了一系列新的免疫相關(guān)生物標(biāo)志物，以補(bǔ)充傳統(tǒng)的臨床預(yù)后因素并改善治療效果。

[1] Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin, 2018, 68(6):394-424.

[2] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin, 2019, 69(1):7-34.

[3] Herbst RS, Morgensztern D, Boshoff C. The biology and management of non-small cell lung cancer. Nature, 2018, 553(7689):446-454.

[4] Becht E, Giraldo NA, Germain C, et al. Immune contexture, immunoscore, and malignant cell molecular subgroups for prognostic and theranostic classifications of cancers. Adv Immunol, 2016, 130: 95-190.

[5] Petitprez F, Vano YA, Becht E, et al. Transcriptomic analysis of the tumor microenvironment to guide prognosis and immunotherapies. Cancer Immunol Immunother, 2018, 67(6):981-988.

[6] Fridman WH, Zitvogel L, Sautès-Fridman C, et al. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nat Rev Clin Oncol, 2017, 14(12):717-734.

[7] Ladányi A. Prognostic and predictive significance of immune cells infiltrating cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Res, 2015, 28(5):490-500.

[8] Bremnes RM, Al-Shibli K, Donnem T, et al. The role of tumor-infiltrating immune cells and chronic inflammation at the tumor site on cancer development, progression, and prognosis: emphasis on non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol, 2011, 6(4):824-833.

[9] Ishibashi Y, Tanaka S, Tajima K, et al. Expression of foxp3 in non-small cell lung cancer patients is significantly higher in tumor tissues than in normal tissues, especially in tumors smaller than 30 mm. Oncol Rep, 2006, 15(5):1315-1319.

[10] Kataki A, Scheid P, Piet M, et al. Tumor infiltrating lymphocytes and macrophages have a potential dual role in lung cancer by supporting both host-defense and tumor progression. J Lab Clin Med, 2002, 140(5):320-328.

[11] Salgaller ML. The development of immunotherapies for non-small cell lung cancer. Expert Opin Biol Ther, 2002, 2(3):265-278.

[12] Fridman WH, Pagès F, Sautès-Fridman C, et al. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.Nat Rev Cancer, 2012, 12(4):298-306.

[13] Newman AM, Liu CL, Green MR, et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nat Methods, 2015, 12(5): 453-457.

[14] Ritchie ME, Phipson B, Wu D, et al. Limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res, 2015, 43(7):e47.

[15] Shannon P, Markiel A, Ozier O, et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res, 2003, 13(11):2498-2504.

[16] Zhou Y, Zhou B, Pache L, et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nat Commun, 2019, 10(1):1523.

[17] Zhang M, Wang X, Chen X, et al. Novel immune-related gene signature for risk stratification and prognosis of survival in lower-grade glioma. Front Genet, 2020, 11:363.

[18] Keung EZ, Gershenwald JE. Clinicopathological features, staging, and current approaches to treatment in high-risk resectable melanoma.J Natl Cancer Inst, 2020, 112(9):875-885.

[19] Galon J, Pagès F, Marincola FM, et al. The immune score as a new possible approach for the classification of cancer. J Transl Med, 2012, 10:1.

[20] Galon J, Lugli A, Bifulco C, et al. World-wide immunoscore task force: meeting report from the "melanoma bridge", Napoli, November 30th-December 3rd, 2016. J Transl Med, 2017, 15(1):212.

[21] Ros-Martínez S, Navas-Carrillo D, Alonso-Romero JL, et al. Immunoscore: a novel prognostic tool. Association with clinical outcome, response to treatment and survival in several malignancies. Crit Rev Clin Lab Sci, 2020, 57(7):432-443.

[22] Korda? T, Osen W, Eichmüller SB. Controlling the immune suppressor: transcription factors and microRNAs regulating CD73/NT5E. Front Immunol, 2018, 9:813.

[23] Manne U, Gary BD, Oelschlager DK, et al. Altered subcellular localization of suppressin, a novel inhibitor of cell-cycle entry, is an independent prognostic factor in colorectal adenocarcinomas. Clin Cancer Res, 2001, 7(11):3495-3503.

[24] Roman J. On the "TRAIL" of a killer: MMP12 in lung cancer. Am J Respir Crit Care Med, 2017, 196(3):262-264.

[25] McDonald PC, Chafe SC, Brown WS, et al. Regulation of pH by carbonic anhydrase 9 mediates survival of pancreatic cancer cells with activated KRAS in response to hypoxia. Gastroenterology, 2019, 157(3):823-837.

Prognostic role of immune related genes in non-small cell lung cancer

CUI Xiao, LIAO Zheng-kai

Author Affiliation: Department of Radiation and Medical Oncology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Hubei 430071, China

To explore the prognostic value of immune-related genes in non-small cell lung cancer.The non-small cell lung cancer samples in the TCGA database were analyzed for the correlation of immune cell infiltration through ssGSEA and divided into the high and low immune cell infiltration group which further verified by ESTIMATE algorithm, immune gene correlation analysis and CIBERSORT algorithm. The differential genes of the high and low immune groups, the tumor and its surrounding normal tissues were screened by the R software "limma" package and the intersection genes were performed by functional cluster analysis. Univariate Cox regression analysis was used to analyze genes related to prognosis, Lasso regression and multivariate Cox regression analysis were used to construct a prognostic model, and Kaplan-Meier was used to verify the prognostic correlation between the model and patients’ survival. Univariate Cox analysis and multivariate Cox analysis verified that the immune gene prognosis-related model is an independent prognostic factor, and ROC analysis further verified its accuracy of survival prediction.According to the results of transcriptome sequencing, all cases were divided into the high immune cell infiltration group and the low immune cell infiltration group. There were significant differences in the expression of HLA family genes and PD-L1 between the groups. The selected immune-related differential genes were performed by protein interaction network analysis and cell function cluster analysis, and a prognostic model of immune genes was constructed. Kaplan-Meier verified that the model possessed a prognostic correlation with patient survival. The ROC curve verified that the model was a prognostic-related factor.The intersection of differentially expressed genes and immune-related genes in non-small cell lung cancer can be used to construct an immune prognostic model to confirm that it has immune prognostic function.

NSCLC; TCGA; immune related genes; prognostic signature

LIAO Zheng-kai, Email: zliao@whu.edu.cn

廖正凱，Email：zliao@whu.edu.cn

2021-03-10

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.006