曲守方，黃傳峰，孫楠，于婷，黃杰

·論著·

測(cè)序儀性能評(píng)價(jià)用脫氧核糖核酸國家參考品的建立

曲守方*，黃傳峰*，孫楠，于婷，黃杰

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院非傳染病診斷試劑室（曲守方、孫楠、于婷、黃杰），理化檢測(cè)室（黃傳峰）

建立測(cè)序儀性能評(píng)價(jià)用脫氧核糖核酸國家參考品。分別將擴(kuò)增培養(yǎng)后的永生化的人細(xì)胞系、培養(yǎng)達(dá)到 108數(shù)量級(jí)的轉(zhuǎn)染 HPV11 質(zhì)粒的細(xì)菌、大腸桿菌和歐陸森氏菌高 GC 菌株收集后提取基因組 DNA，然后進(jìn)行 DNA 濃度測(cè)定。接著將人基因組 DNA、HPV 病毒基因組 DNA、大腸桿菌基因組 DNA 和高 GC 菌株基因組 DNA 分別按照 20、5、50、50 ng/μl 終濃度要求，進(jìn)行分裝，制備國家參考品。在不同的基因測(cè)序儀進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，包括 BGISEQ-500、NextSeq CN500、NovaSeq 6000 和 BioelectronSeq 4000等。構(gòu)建人全基因組變異標(biāo)準(zhǔn)集和一致性序列。采用不同測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，評(píng)價(jià)變異標(biāo)準(zhǔn)集和一致性序列的適用性。制備的國家參考品經(jīng)不同平臺(tái)測(cè)序后構(gòu)建了人全基因組變異標(biāo)準(zhǔn)集和一致性序列。經(jīng)過不同測(cè)序平臺(tái)標(biāo)定，結(jié)果符合人全基因組變異標(biāo)準(zhǔn)集和一致性序列的要求。測(cè)序儀性能評(píng)價(jià)用脫氧核糖核酸國家參考品可以用于高通量基因測(cè)序儀的性能評(píng)價(jià)，為產(chǎn)品注冊(cè)檢定及上市后監(jiān)督管理提供依據(jù)。

高通量基因測(cè)序儀； 測(cè)序通量； 標(biāo)準(zhǔn)集； 一致性序列； 單核苷酸多態(tài)性； 插入缺失

高通量測(cè)序技術(shù)在臨床上已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于遺傳病、腫瘤和傳染病的診斷、預(yù)后和治療選擇等[1-3]。隨著測(cè)序成本降低，越來越多患者受益于這些基于高通量測(cè)序的檢測(cè)技術(shù)。

目前國內(nèi)市場(chǎng)上存在著多種二代測(cè)序儀。Illumina 公司的測(cè)序平臺(tái)采用邊合成邊測(cè)序（sequencing by synthesis，SBS）技術(shù)原理，是基于 DNA 簇（DNA cluster）、橋式 PCR 和可逆阻斷等核心技術(shù)[4]。Thermo Fisher 公司擁有 Solid 測(cè)序平臺(tái)、Ion PGM 和 Ion Proton 平臺(tái)，采用的是半導(dǎo)體測(cè)序原理，在半導(dǎo)體芯片孔中的微球上固定 DNA 鏈，隨后依次摻入堿基（A 腺嘌呤、C 胞嘧啶、G 鳥嘌呤、T 胸腺嘧啶），每加入一個(gè)堿基就釋放出氫離子，反應(yīng)池中的酸堿度（pH）發(fā)生改變，離子感受器就會(huì)感受到化學(xué)信號(hào)，從而讀出 DNA 序列[5]。華大基因公司收購了美國 Complete Genomics 公司并改進(jìn)其技術(shù)，推出了 BGISEQ-500、BGISEQ-50、MGISEQ-200、MGISEQ-2000 和 MGISEQ-T7 測(cè)序儀，測(cè)序原理是以改進(jìn)的 DNA 納米球技術(shù)來擴(kuò)增 DNA 序列，并使用聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)（combinatorial probe-anchor synthesis，cPAS）進(jìn)行測(cè)序[6-7]。

不同測(cè)序平臺(tái)之間存在系統(tǒng)性差異，Illumina 測(cè)序平臺(tái)在讀取高 AT 或高 GC 富集片段的時(shí)候錯(cuò)誤率差強(qiáng)人意；Ion Torrent 測(cè)序平臺(tái)對(duì)于檢測(cè)同一堿基連續(xù)出現(xiàn)時(shí)的數(shù)量可能會(huì)有所誤差；華大測(cè)序平臺(tái)在敏感性與特異性之間做到平衡優(yōu)化方面存在不足[8-10]。隨著精準(zhǔn)臨床診斷的興起，基因測(cè)序準(zhǔn)確性也面臨著巨大的挑戰(zhàn)。因此對(duì)測(cè)序平臺(tái)的性能進(jìn)行綜合評(píng)估，能夠有效規(guī)范臨床上平臺(tái)使用和其應(yīng)用開發(fā)。中國食品藥品檢定研究院研制測(cè)序儀性能評(píng)價(jià)用脫氧核糖核酸國家參考品，包括4 種基因組 DNA 樣本，分別是人基因組 DNA 樣本、大腸桿菌基因組 DNA 樣本、高 GC 含量細(xì)菌基因組 DNA 樣本、人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）11 型基因組DNA 樣本，用于一代、二代測(cè)序儀的測(cè)序準(zhǔn)確率、重復(fù)性等性能評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正常男性外周血白細(xì)胞構(gòu)建永生化細(xì)胞系樣本、感受態(tài)大腸桿菌（ATCC 8739）、高 GC 含量的歐陸森氏菌（Olsenella）、HPV11重組質(zhì)粒均由中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）提供。

QIAsymphony DNA Midi Kit 購自美國 Qiagen公司；Axygen?AxyPrep Easy-96 Plasmid Kit 購自美國Corning 公司；MGI Easy 微生物 DNA 提取試劑盒（磁珠法）購自深圳華大智造科技股份有限公司；Qubit?dsDNA HS Assay Kit 和Qubit?ssDNA Assay Kit 均購自美國 Invitrogen 公司；KAPA Library Quantification Kits 購自美國 Roche 公司；文庫構(gòu)建試劑盒分別購自深圳華大智造科技股份有限公司、杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司、美國Illumina 公司和博奧生物集團(tuán)有限公司；BGISEQ-500RS 高通量測(cè)序試劑套裝均購自深圳華大智造科技股份有限公司；NextSeq CN500 測(cè)序儀反應(yīng)通用試劑盒購自杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司；NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit（300 cycles）高通量測(cè)序試劑購自美國Illumina 公司；測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒（半導(dǎo)體法）購自博奧生物集團(tuán)有限公司。

Qubit?3.0 熒光定量儀和 Applied Biosystems StepOnePlus 均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；超聲波破碎儀購自比利時(shí)Diagenode 公司；Covaris E210 超聲波破碎儀購自美國 Covaris 公司；BGISEQ-500 基因測(cè)序儀購自深圳華大智造科技股份有限公司；NextSeq CN500 基因測(cè)序儀購自杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司；NovaSeq 6000 基因測(cè)序儀購自美國Illumina 公司；BioelectronSeq 4000 基因測(cè)序儀購自博奧生物集團(tuán)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制備 按照試劑盒說明書，采用 QIAsymphony DNA Midi Kit 提取正常男性外周血白細(xì)胞構(gòu)建的永生化細(xì)胞系樣本，獲得人基因組 DNA；轉(zhuǎn)染 HPV11 質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)達(dá)到 108的數(shù)量級(jí)，采用 Axygen?AxyPrep Easy-96 Plasmid Kit獲得 HPV 病毒基因組 DNA；大腸桿菌細(xì)菌數(shù)培養(yǎng)達(dá)到 108的數(shù)量級(jí)，采用十六烷基三甲基溴化銨法獲得大腸桿菌基因組 DNA；Olsenella 高 GC 菌株，經(jīng)厭氧培養(yǎng)后，細(xì)菌數(shù)量級(jí)達(dá)到 108，采用 MGI Easy 微生物 DNA 提取試劑盒（磁珠法），獲得高 GC 菌株基因組 DNA。用 Qubit?3.0 熒光定量儀通過 Qubit?dsDNA HS Assay Kit 進(jìn)行 DNA 濃度測(cè)定，每個(gè)樣本進(jìn)行 5 次濃度檢測(cè)取平均值。將人基因組 DNA、HPV11 病毒基因組 DNA、大腸桿菌基因組 DNA 和 Olsenella 高 GC 菌基因組 DNA 分別按照 20、5、50、50 ng/μl終濃度要求，進(jìn)行樣本稀釋和分裝，制備國家參考品。

1.2.2 測(cè)序 采用文庫構(gòu)建試劑盒對(duì)基因組樣本進(jìn)行文庫制備。先使用酶切打斷或者超聲打斷，將國家參考品 DNA 片段化處理。經(jīng)過接頭連接和文庫擴(kuò)增等步驟，獲得待測(cè)序分析的文庫。使用Qubit?3.0 熒光定量儀通過 Qubit?dsDNA HS Assay Kit 或者 Applied Biosystems StepOnePlus 通過 KAPA Library Quantification Kit測(cè)定各個(gè)文庫的濃度，按照測(cè)定的濃度混合文庫。采用上述的測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒并按照試劑盒說明書在不同基因測(cè)序儀進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，包括 BGISEQ-500、NextSeq CN500、NovaSeq 6000 和BioelectronSeq 4000 基因測(cè)序儀等。

1.2.3 人全基因組變異標(biāo)準(zhǔn)集和一致性序列構(gòu)建 在參考序列為 hs37d5 的人基因組區(qū)域，使用不同的全外顯子芯片選擇 27.1 Mb 的外顯子區(qū)域，包括安捷倫公司的 Agilent V6 捕獲芯片、NimbleGen 公司的Nimblegen Human Exome v3 芯片，IDT 公司芯片以及 BGI 公司 V4 芯片。使用軟件 SOAP nuke 對(duì)所有原始數(shù)據(jù)進(jìn)行低質(zhì)量過濾得到有效數(shù)據(jù)，使用軟件 BWA 和 GATK Haplotype Caller 對(duì)各數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行變異檢測(cè)，獲得兩類文件：文件 gVCF，用于生成候選變異區(qū)間；文件 VCF，用軟件 GATK VQSR 處理初步過濾得到候選變異集。然后合并各平臺(tái)的候選變異集，使用軟件 vcf annotate 將各候選變異區(qū)間注釋到合并的變異集上。對(duì)于每一個(gè)候選變異集，隨機(jī)取 40000 個(gè)在候選變異區(qū)間內(nèi)的變異位點(diǎn)作為訓(xùn)練集，使用 R 語言中“e1071”軟件包的“one-classSVM”進(jìn)行分類，得到各候選變異集的極端變異閾值，用于變異篩選。對(duì)于未通過篩選的變異，在其兩側(cè)加減 50 堿基對(duì)，生成低置信變異區(qū)間。最后合并候選變異區(qū)間，與低置信變異區(qū)間取補(bǔ)集，再與參考基因組非 N 區(qū)間取交集，建立高置信單核苷酸多態(tài)性和插入缺失（single nucleotide polymorphism/insertion-deletion，SNP/Indel）位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)集。

1.2.4 一致性序列構(gòu)建 大腸桿菌基因組數(shù)據(jù)來源于美國國家生物技術(shù)信息中心。Olsenella 高 GC 菌的原始數(shù)據(jù)使用 BGISEQ-500 測(cè)序后進(jìn)行 de novo 組裝獲得。HPV11 基因組數(shù)據(jù)使用 Sanger測(cè)序進(jìn)行拼接組裝。使用軟件 BWA + SamTools +GATK Haplotype Caller 對(duì)各數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行比對(duì)、排序和變異檢測(cè)得到 gVCF 文件，將所有樣本的 gVCF 合并；進(jìn)行 vcf 文件過濾，最后產(chǎn)生一致性序列。

1.2.5 協(xié)作標(biāo)定 分別使用 BGISEQ-500、NovaSeq 6000、NextSeq CN500 和 BioelectronSeq 4000 基因測(cè)序儀，對(duì)這 4 個(gè)基因組 DNA 進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定。與人基因組樣本的全基因組變異標(biāo)準(zhǔn)集進(jìn)行比對(duì)，并與大腸桿菌、Olsenella 高 GC 菌和 HPV 11 基因組樣本的一致性序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 變異標(biāo)準(zhǔn)集和一致性序列

將各個(gè)平臺(tái)的人全基因組變異集參考集進(jìn)行匯總，得到不同區(qū)域的人類全基因組變異標(biāo)準(zhǔn)集，包括全基因組 2.7 Gb 區(qū)域和 1 Gb 區(qū)域，外顯子27 Mb 區(qū)域以及乳腺癌易感基因1_2（breast cancer susceptibility gene1_2，BRCA1_2）17 Kb 區(qū)域。每個(gè)區(qū)域的大小以及包含 SNP 和 Indel 的數(shù)量（表 1），并產(chǎn)生一致性序列（Human.consensus.fa，HighGC.consensus.fa，HPV11.consensus.fa，. consensus.fa）。

2.2 協(xié)作標(biāo)定

采用 BGISEQ-500、NovaSeq 6000、NextSeq CN500 和 BioelectronSeq 4000 基因測(cè)序儀等不同測(cè)序平臺(tái)對(duì)國家參考品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)人基因組 DNA 參考品，對(duì)人全基因組（2.7 Gb 區(qū)域）變異標(biāo)準(zhǔn)集的比對(duì)結(jié)果表明，不同測(cè)序儀對(duì)SNP、Indel檢測(cè)的準(zhǔn)確率和靈敏度存在著差別，尤其是 BioelectronSeq 4000 測(cè)序儀對(duì) Indel 檢測(cè)的準(zhǔn)確率和靈敏度僅為 33.57% 和47.85%，但是對(duì) SNP 檢測(cè)的準(zhǔn)確率和靈敏度均超過 86%；而其他 3 個(gè)測(cè)序儀對(duì) SNP、Indel 檢測(cè)的準(zhǔn)確率和靈敏度均超過 89%（表 2）。檢測(cè)人基因組 DNA 參考品，將結(jié)果與指定的全基因組 1 Gb 參考序列、指定的全外顯子27 Mb 區(qū)域和指定的 BRCA1_2 基因 17 Kb 區(qū)域序列進(jìn)行比對(duì)；檢測(cè)細(xì)菌和病毒 DNA參考品，將結(jié)果與對(duì)應(yīng)的參考序列進(jìn)行比對(duì)，4 個(gè)測(cè)序儀的測(cè)序一致序列準(zhǔn)確率均不低于 99.0%（表 3）。

表1 人全基因組變異標(biāo)準(zhǔn)集

表2 人全基因組（2.7 Gb 區(qū)域）變異標(biāo)準(zhǔn)集的比對(duì)結(jié)果

表3 一致性序列比對(duì)結(jié)果

3 討論

二代測(cè)序儀主要的質(zhì)控參數(shù)包括比對(duì)到基因組上唯一位置的 base 比率（unique map rate）、重復(fù)的 reads 所占比例（duplication）、測(cè)序深度（average sequencing depth）和覆蓋率（coverage）等。不同平臺(tái)的測(cè)序儀有各自特異性的參數(shù)，對(duì)其性能評(píng)價(jià)應(yīng)關(guān)注于測(cè)序通量、測(cè)序讀長、堿基識(shí)別質(zhì)量百分比、測(cè)序覆蓋率、測(cè)序平均深度、測(cè)序準(zhǔn)確率和重復(fù)性等指標(biāo)。高通量測(cè)序儀的測(cè)序通量不同，臨床的用途也有區(qū)別。體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)于保證檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化具有重要的意義[11-12]。為了對(duì)高通量測(cè)序儀進(jìn)行有效的性能評(píng)估，中檢院建立測(cè)序儀性能評(píng)價(jià)用脫氧核糖核酸國家參考品。根據(jù)測(cè)序儀檢測(cè)不同類型樣本的臨床用途，在設(shè)計(jì)國家參考品時(shí)，要求參考品的組成包括人基因組、細(xì)菌基因組以及病毒基因組樣本，同時(shí)也增加干擾性的高 GC 細(xì)菌樣本。

單核苷酸變異（SNV）和插入/缺失突變（Indel）是生物 DNA 常見的突變類型。小長度范圍內(nèi)的變異以及較長的缺失突變，目前都能夠較好地檢測(cè)出來。但對(duì)于大多數(shù)較長的插入突變和更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)性變異（structural variation，SV），由于二代測(cè)序的 reads 很短，難以定位在基因組上，所以難以檢測(cè)出。在測(cè)序儀性能評(píng)價(jià)時(shí)，其測(cè)序準(zhǔn)確率（包括對(duì) SNP/Indel 和一致性序列）是非常重要的指標(biāo)。在檢測(cè)人基因組 DNA 國家參考品時(shí)，與 SNP、Indel 的參考數(shù)據(jù)集比較后，對(duì)測(cè)序儀的 SNP、Indel 檢測(cè)的準(zhǔn)確率和靈敏度有相應(yīng)的要求。從國家參考品協(xié)作標(biāo)定數(shù)據(jù)可以看出，對(duì) SNP、Indel 檢測(cè)的準(zhǔn)確率和靈敏度在不同測(cè)序平臺(tái)上有不同的表現(xiàn)，反映了不同平臺(tái)性能上的差異，這個(gè)差異主要由平臺(tái)本身的技術(shù)原理和技術(shù)性能決定[13]。因此對(duì)測(cè)序平臺(tái)的 SNP、Indel 檢測(cè)的準(zhǔn)確率和靈敏度應(yīng)有要求，但并未進(jìn)行統(tǒng)一要求，只是要求制造商應(yīng)給出各自平臺(tái)的具體要求。這種評(píng)價(jià)方式和國際上評(píng)價(jià)測(cè)序儀的方式是一致的。在檢測(cè)人基因組 DNA 國家參考品，結(jié)果與指定的全基因組 1 Gb 參考序列、指定的全外顯子27 Mb 區(qū)域和指定的 BRCA1_2 基因 17 Kb 區(qū)域序列進(jìn)行比對(duì)；在檢測(cè)細(xì)菌和病毒 DNA 國家參考品，結(jié)果與對(duì)應(yīng)參考序列進(jìn)行比對(duì)，要求測(cè)序儀的測(cè)序一致序列準(zhǔn)確率應(yīng)均不低于 99.0%。結(jié)果表明各個(gè)測(cè)序儀的測(cè)序一致序列準(zhǔn)確率均≥ 99.0%，能夠滿足國家參考品的要求。建立的國家參考品可以用于二代測(cè)序儀的測(cè)序準(zhǔn)確率等性能評(píng)價(jià)，它采用實(shí)物檢測(cè)和與參考序列比對(duì)的兩種方式進(jìn)行評(píng)價(jià)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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Development of the DNA reference sequence control materials for sequencing performance evaluation

QU Shou-fang, HUANG Chuan-feng, SUN Nan, YU Ting, HUANG Jie

Author Affiliation: Division of Diagnostic for Non-infectious Disease (QU Shou-fang, SUN Nan, YU Ting, HUANG Jie), Division of Physical and Chemical Testing (HUANG Chuan-feng), National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

To establish the DNA reference sequence control materials for sequencing performance evaluation.Immortalized human cell line was amplified and the 108bacterias were captured, including plasmid transfected by HPV11,and Olsenella high GC strain. Then genomic DNA was extracted, and the concentration was determined. Human genomic DNA, HPV genomic DNA,genomic DNA and high GC genomic DNA were packaged respectively according to the final concentration requirements of 20, 5, 50 and 50 ng/μl as national reference materials, followed by detection on different next-generation sequencing platforms, including BGISEQ-500, NextSeq CN500, NovaSeq 6000, BioelectronSeq 4000, and so on. The standard variation set of human genome and consensus sequence of national reference materials were constructed. Different sequencing platforms were used for collaborative calibration to evaluate the applicability.The standard variation set of human genome and consensus sequence was established. After calibration by different sequencing platforms, the results meet the requirements of the standard set of human genome variation and the consensus sequence.The national reference materials can be used for the performance evaluation of high-throughput gene sequencer, which provides the basis for product registration, verification and post-marketing supervision and management.

high-throughput gene sequencer; throughput of gene sequencing; standard set; consensus sequence; single nucleotide polymorphism; insertion-deletion

s: YU Ting, Email: yuting@nifdc.org.cn; HUANG Jie, Email: jhuang5522@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.002

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFC0906500）

于婷，Email：yuting@nifdc.org.cn；黃杰，Email：jhuang5522@ 126.com

2021-01-20

*同為第一作者