章毅，陳侃俊，伍婷，李品宙，胡肖希，孔凡瑞，祁成，陳亮

·論著·

不同存儲溫度的huMSC-exo對UVB輻照HaCaT細胞的修復作用研究

章毅*，陳侃俊*，伍婷，李品宙，胡肖希，孔凡瑞，祁成，陳亮

200051 上海，中國干細胞集團有限公司/中國干細胞集團上海生物科技有限公司/中國干細胞集團海南博鰲附屬干細胞醫(yī)院有限公司/上海市臍帶血造血干細胞庫/上海市干細胞技術有限公司

探究了不同存儲溫度的 huMSC-exo 對 UVB 輻照 HaCaT 細胞的修復作用，為外泌體存儲選擇適宜的溫度條件提供理論依據(jù)。采用超速離心法從 huMSC 培養(yǎng)基上清中提取外泌體，用 Western blot、納米顆粒跟蹤分析技術和透射電鏡技術進行表征，并置于–80、–20、4、25 和 45 ℃存儲 1、3、7、14、30、50、100 和 150 d。構建 UVB 輻照 HaCaT光老化細胞模型，用 huMSC-exo 處理 24 h 后觀察細胞形態(tài)、檢測細胞存活率、SA-β-gal 活性、T-SOD 活性、MDA 和 LDH 含量。huMSC-exo 呈具有清晰膜的茶托樣結構，尺寸中位數(shù)為 114 nm，30 ～ 150 nm 囊泡數(shù)量占比約61.42%，表達外泌體表面標記蛋白 CD9、CD63 和 CD81。–80 ℃和25 ℃存儲 1 ～ 150 d 的 huMSC-exo 能顯著提高 UVB 輻照 HaCaT 細胞存活率、恢復細胞形態(tài)、降低 SA-β-gal 活性、部分恢復細胞 T-SOD、MDA 和 LDH 水平；–20 ℃存儲的 huMSC-exo 對 HaCaT 的增殖活性、細胞形態(tài)和SA-β-gal 活性有恢復作用；4 ℃存儲的 huMSC-exo 能減輕細胞老化水平；45 ℃存儲的 huMSC-exo 無顯著修復作用。–80 ℃、25 ℃存儲的 huMSC-exo 能夠顯著恢復 UVB 輻照引起的 HaCaT 損傷，–20 ℃、4 ℃ huMSC-exo 作用效果次之，45 ℃的 huMSC-exo 無顯著影響，提示–80 ℃和 25 ℃能夠較好地維持huMSC-exo 的生物學功能。

外泌體； 間充質(zhì)干細胞； HaCaT 細胞； UVB 輻照

皮膚老化可以分為內(nèi)在老化和外在老化兩種類型，后者又稱光老化。陽光照射，尤其是暴露于紫外線 B（ultraviolet B，UVB）是導致皮膚光老化的主要因素，其還會引起機體活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）積聚、TNF-α、IL-1α、IL-16、IL-10 和 IL-8 等炎癥因子激活及皮膚慢性炎癥[1]。外泌體是細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）的主要類型之一，直徑 30 ～ 150 nm，含有多種生物大分子，包括編碼 RNA、非編碼 RNA、DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，可由幾乎所有類型的細胞分泌。研究表明，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）或皮膚細胞來源的外泌體能夠延緩皮膚光老化[2]、加速創(chuàng)傷皮膚愈合[3]、激活角質(zhì)細胞并提升皮膚防御能力[4-7]，是皮膚老化及創(chuàng)傷修復的極具潛力的無細胞活性組分。

研究指出，外泌體的物理性質(zhì)因存儲條件的不同而改變，如尺寸減小、膜電位升高、蛋白質(zhì)含量降低等，其中存儲溫度是影響外泌體物理性質(zhì)的關鍵因素[8]。然而，目前關于存儲條件對外泌體生物學活性和穩(wěn)定性的影響鮮有報道。探究優(yōu)化外泌體存儲條件以維持其在存儲過程中的生物活性，是保障外泌體臨床前研究結果的可重復性、臨床應用的有效性、建立標準化和規(guī)?；耐饷隗w制備、存儲及應用產(chǎn)業(yè)鏈的重要前提和關鍵。

本研究通過 UVB 輻照 HaCaT 細胞構建了人表皮光老化損傷模型，探究并比較不同存儲溫度條件下人臍帶間充質(zhì)干細胞源外泌體（human umbilical cord MSC-derived exosome，huMSC-exo）對 HaCaT 的潛在修復作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 采集足月產(chǎn)健康新生兒臍帶，經(jīng)產(chǎn)婦或家屬簽署知情同意書后獲得，符合國家相關法律和倫理委員會規(guī)定。CCK8 試劑盒購自碧云天公司；BCA 檢測試劑盒、β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性檢測試劑盒購自美國 Sigma 公司；CD9、CD63、CD81 抗體購自 Abcam 公司；FBS、DMEM、0.25% Typsin-EDTA、L-谷氨酰胺購自美國 Gibco 公司；青霉素-鏈霉素溶液購自德國 PAN-biotech 公司；0.22 μm 無菌濾器、細胞培養(yǎng)瓶、24 孔板購自美國Corning 公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒購自南京建成公司。

1.1.2 儀器 Varioskan LUX 多功能酶標儀、ST-16R 低溫離心機、MTX 150 超速離心機、ULTS1368 低溫冰箱購自美國 Thermo 公司；1800 系列-190 氣相液氮罐購自美國 MVE 公司；自動細胞計數(shù)儀購自美國 Invitrogen 公司；預制膠凝膠蛋白電泳系統(tǒng)、iblot2 干式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)等購自美國 Life 公司；ChemiDoc 化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)購自美國 Bio-Rad 公司；FYL-YS-150L 溫控干燥孵育箱購自福意公司；TS100 倒置相差顯微鏡、DS-U3 顯微鏡相機控制器購自日本 Nikon 公司；納米顆粒跟蹤分析儀 ZetaView PMX 110 購自德國 Particle Metrix 公司；透射電子顯微鏡購自德國 Leica 公司。

1.2 方法

1.2.1 huMSC 的分離培養(yǎng)與上清收集 取臍帶華通膠剪碎成約 2 mm3的組織塊，加入 II 型膠原酶 37 ℃恒溫消化 1.5 h，收集濾液室溫 2000 r/min 離心 10 min，收集細胞沉淀加入含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基重懸，置于 37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，待細胞融合度達到 85% ～ 90% 時，用 0.25% 胰酶消化傳代，接種密度為 5 × 104/ml，每 2 天為細胞全量換液，每 3 ～ 4 天傳代 1 次。取 P3 ～ P6 代次 huMSC，接種 24 h 后換無血清培養(yǎng)基，待細胞融合度達到 85% ～ 90% 時，用無菌瓶收集細胞上清。

1.2.2 huMSC-exo 的制備、存儲與復溫 取 P3 ～ P6 代 huMSC 培養(yǎng)基上清，分裝于 50 ml 離心管中，室溫 2500 r/min 離心 10 min，去除細胞碎片；收集上清，置于新的 50 ml 離心管中，室溫10 000 r/min 離心 20 min；收集上清，過 0.22 μm 無菌濾器，濾液置于超速離心管中，4 ℃ 100 000 ×離心 270 min；離心結束后，用少量 PBS（3 ～ 5 ml）輕輕沖洗沉淀 1 次，最后用 PBS（約 2 ml，pH = 7.4）溶解、混勻沉淀，得到 huMSC-exo。按照 BCA 試劑盒說明書測定總蛋白濃度。外泌體分裝后置于–80、–20、4、25 和 45 ℃冰箱或孵育箱中存儲。同時，應按照 1 ～ 150 d 的凍存時長間隔，取同一個體來源的 P3 ～ P6 代次 huMSC 上清進行 huMSC-exo 制備，并確保各存儲溫度、同一存儲時長的 huMSC-exo 均制備來自同一批次、同一代次 huMSC 上清。復溫時，將 huMSC-exo 從冰箱或孵育箱中取出，室溫靜置，待完全溶解后，用無血清 DMEM 配制成 huMSC-exo 終濃度為 44 μg/ml的培養(yǎng)體系，可避免 huMSC-exo 反復凍融。

1.2.3 HaCaT UVB 輻照損傷模型的建立與huMSC-exo 處理 將 HaCaT 細胞接種于 24 孔板中，接種密度為 1 × 105/ml，待細胞融合度達到 30%，換成無血清 DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞融合度達到 50%，棄去 DMEM 培養(yǎng)基，每孔加入 500 μl PBS，將 UVB 輻照組、huMSC-exo 組置于 UVB 光源正下方 6 cm 處，輻照強度為 2.85 μW/cm2，輻照時間 30 s，累計輻照劑量 8.55 mJ/cm2。隨后，立即棄去 PBS，加入含不同存儲條件 huMSC-exo 的培養(yǎng)基，對照組和 UVB 輻照組添加等體積 PBS。

1.2.4 納米顆粒跟蹤分析技術檢測 huMSC-exo 粒徑 取 PBS 稀釋的 huMSC-exo，根據(jù)操作手冊檢測樣本粒徑大小及分布，使用 110 nm 聚苯乙烯顆粒進行校準，測定溫度為25 ℃。

1.2.5 Western blot 檢測 huMSC-exo 表面標志性蛋白 按照試劑盒說明書進行細胞裂解和總蛋白抽提，BCA 法測定總蛋白濃度。huMSC-exo 樣本上樣量為 10 μg，經(jīng)過 12% SDS-PAGE 凝膠電泳后通過 iblot2 干式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，封閉液封閉 1 h，采用 ECL 法進行抗體孵育和顯色，孵育條件為CD9（1:1000）、CD63（1:1000）和CD81（1:1000）4 ℃搖床孵育過夜。孵育結束后 PBS 漂洗 2 次，加入 HRP 工作液，室溫振蕩孵育 10 min，PBS 漂洗 2 次，加入檢測液孵育 5 min，通過 ChemiDoc 化學發(fā)光成像分析儀進行顯影分析。

1.2.6 透射電鏡鑒定 huMSC-exo 形態(tài) 取 PBS 重懸的 huMSC-exo 100 μl，室溫靜置 5 min，加入染色劑醋酸鈾水溶液（2%，pH = 4.0）進行陰性染色，混勻后用移液槍將樣本滴加到 200 目復膜銅網(wǎng)上，自然干燥后置于透射電子顯微鏡下觀察，拍攝 huMSC-exo 電鏡照片。

1.2.7 CCK8 法檢測 HaCaT 細胞增殖 按照 1.2.3 所述方法于 24 孔板培養(yǎng)和處理HaCaT 細胞。huMSC-exo 處理 24 h 后，每孔加入 100 μlCCK8 工作液，37 ℃孵育 3 h，酶標儀檢測 450 nm吸光值。

1.2.8 SA-β-gal活性檢測 按照 1.2.3 所述方法培養(yǎng)和處理 HaCaT 細胞。huMSC-exo 處理 24 h 后，按照試劑盒說明書檢測細胞 SA-β-gal 活性，倒置相差顯微鏡下隨機選取 10 個視野，每個視野細胞數(shù)約 100 個，計數(shù)陽性染色細胞數(shù)。

1.2.9 T-SOD、MDA 和 LDH 含量檢測 按照 1.2.3 所述方法培養(yǎng)和處理 HaCaT 細胞，24 h 后收集培養(yǎng)基上清液，按照試劑盒說明書檢測 T-SOD、MDA 和 LDH 水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 huMSC-exo 鑒定結果

本研究制備的 huMSC-exo 具有清晰膜輪廓，呈茶托樣結構（圖 1A），粒徑分布范圍 30 ～ 590 nm，中位數(shù) 114 nm，30 ～ 150 nm的囊泡數(shù)量占比約 61.42 %（圖 1B），表達 CD9、CD63 和 CD81（圖 1C）。根據(jù)國際細胞外囊泡協(xié)會對外泌體的判定標準[9]，本研究huMSC-exo 是以外泌體為主的細胞外囊泡。

2.2 huMSC-exo 對 UVB 輻照 HaCaT 增殖與形態(tài)的影響

未經(jīng) UVB 輻照的 HaCaT 細胞聯(lián)結成片，呈扁平鋪路石狀排列，UVB 輻照后細胞貼壁能力降低，呈梭形或不規(guī)則形狀，細胞間隙增加（圖 2A），細胞存活率降低至對照組的 0.31倍（圖 2B，< 0.001）。25 ℃和–80 ℃存儲 1 ～ 150 d 的 huMSC-exo 處理均能顯著提高輻照后 HaCaT 細胞存活率，改善細胞形態(tài)和貼壁能力；–20 ℃存儲的huMSC-exo 恢復作用次之，4 ℃和45 ℃huMSC-exo 處理對細胞存活率無顯著影響，提示存儲溫度是huMSC-exo 的活性和生物學功能的影響因素（圖 2C）。不同溫度下存儲 150 d 的存活率結果顯示，–80 ℃、–20 ℃和25 ℃ huMSC-exo 處理組 HaCaT 細胞存活率分別顯著提高至 UVB 輻照組的 1.17 倍（< 0.001）、1.10 倍（< 0.05）和 1.21 倍（< 0.001）（圖 2D），與形態(tài)學觀察結果一致。

圖1 huMSC-exo 鑒定結果（A：形態(tài)觀察；B：粒徑分布；C：標志性蛋白表達）

Figure 1 Characteristics of huMSC-exo (A: Morphology; B: Particle size distribution; C: Expression of CD9, CD63 and CD81)

圖2 huMSC-exo 對 UVB 輻照 HaCaT 存活率的影響（A：不同溫度存儲 150 d 的 huMSC-exo 對 HaCaT 形態(tài)的影響，40 ×，其中，a：采用 UVB 輻照，b ～ f：在接受輻照后分別用–80 ℃、–20 ℃、4 ℃、25 ℃和 45 ℃存儲的 huMSC-exo 處理；B：UVB 輻照顯著降低 HaCaT 存活率；C：不同溫度存儲 1 ～ 150 d的 huMSC-exo 對 HaCaT 存活率的影響；D：不同溫度下存儲 150 d 的 huMSC-exo 對 HaCaT 存活率的影響；*P < 0.05，***P < 0.001）

Figure 2 Effects of huMSC-exo treatment on UVB irradiated HaCaT cells (A: Effects of huMSC-exo stored at different temperature for 150 days on HaCaT cell morphology, 40 ×, a: cells were treated with equal volume of PBS after UVB irradiation, b - f: cells were treated with huMSC-exo stored at –80 ℃, –20 ℃, 4 ℃, 25 ℃and 45 ℃ after UVB irradiation; B: UVB irradiation significantly reduced cell viability; C: Effects of huMSC-exo stored at different temperature for 1 to 150 days on HaCaT cell viability; D: Effects of huMSC-exo stored at different temperature for 150 days on HaCaT cell viability;*< 0.05,***< 0.001)

2.3 huMSC-exo 對 UVB 輻照 HaCaT 細胞衰老的影響

SA-β-gal 是反映細胞衰老水平的重要指標，其活性隨著細胞衰老而增加。本研究檢測了不同溫度下存儲 1、7、50 和 150 d 的 huMSC-exo 對 UVB 輻照 HaCaT 細胞 SA-β-gal活性的影響（圖 3）。UVB 對照組的陽性染色面積為 41%，各存儲時長條件下–80 ℃、–20 ℃、4 ℃、25 ℃和 45 ℃ huMSC-exo 處理組的平均陽性染色面積分別為8%、16%、29%、11% 和 43%，–80、25 和–20 ℃存儲的 huMSC-exo 能顯著降低 UVB 輻照引起的細胞 SA-β-gal 活性升高，4 ℃存儲 huMSC-exo 作用效果次之，45 ℃存儲 huMSC-exo 對SA-β-gal活性無影響，表明在適宜溫度條件下存儲的 huMSC-exo 具有光老化修復作用。

圖3 huMSC-exo 對 UVB 輻照 HaCaT 細胞 SA-β-gal 活性的影響（A：SA-β-gal 染色情況；B：計算隨機視野下 100 個細胞著色情況，估算 SA-β-gal 染色陽性面積百分比）

Figure 3 SA-β-gal activity of HaCaT treated with huMSC-exo (A: SA-β-gal staining in the different groups; B: Estimation of positive area percentage of SA-β-gal staining by analyzing random 100 cells in each group)

圖4 不同溫度存儲 150 d huMSC-exo 對 UVB 輻照 HaCaT T-SOD（A）、MDA（B）和 LDH（C）的影響（*P < 0.05，**P < 0.01）

Figure 4 Effects of huMSC-exo stored at different temperatures for 150 d on T-SOD (A), MDA (B) and LDH (C) levels of UVB irradiated HaCaT cells (*< 0.05,**< 0.01)

2.4 huMSC-exo 對 UVB 輻照HaCaT T-SOD、MDA 和 LDH 水平的影響

–80 ℃和 25 ℃存儲的 huMSC-exo 處理能不同程度地提高 UVB 輻照 HaCaT 細胞 T-SOD 活力、降低 MDA 和 LDH 分泌量（< 0.05 或< 0.01）；–20 ℃和 4 ℃存儲的 huMSC-exo 也具有降低細胞 LDH 分泌的作用（< 0.05），對 T-SOD 活性和 MDA 含量無顯著影響；45 ℃存儲的huMSC-exo 對 UVB 輻照后 HaCaT T-SOD、MDA 和 LDH 都無顯著影響（圖 4）。這些結果與細胞存活率及 SA-β-gal 活性檢測結果一致，提示huMSC-exo 對 UVB 輻照損傷的修復作用可能與修復細胞氧化還原狀態(tài)并降低細胞毒性損傷有關。

3 討論

紫外線，尤其是 UVB（290 ～ 320 nm）輻照是引起皮膚光老化的主要原因，會導致皮膚細胞產(chǎn)生過量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），包括單線態(tài)氧、超氧陰離子和過氧化氫，并引起皮膚細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的異常合成與降解，最終導致皮膚老化[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，以往被認為是“細胞排泄物”的外泌體不僅在細胞及組織間通訊中扮演關鍵角色[11]，_ENREF_3_ENREF_7 具有免疫調(diào)節(jié)作用[12]和為難治性疾病提供早期診斷生物標志物的潛力[13]，在皮膚學領域也有著廣泛的應用前景，例如：能夠調(diào)控細胞衰老并減輕皮膚老化[14]、促進皮膚創(chuàng)傷修復[15]、緩解皮膚炎癥[16]、減少皮膚瘢痕形成[17]等。人真皮細胞來源 EVs 能夠向人表皮細胞遷移并促進細胞劃痕愈合，通過 miR-23a-3p 改善皮膚細胞衰老相關分泌表型[18]。Deng 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，huMSC-exo 預處理能夠顯著降低 UVB 輻照人真皮成纖維細胞的 ROS 水平，提高谷胱甘肽過氧化物酶 1（glutathione peroxidase 1，GPX-1）、T-SOD 和過氧化氫酶（catalase，CAT）的活性及 mRNA 表達水平，預防人真皮成纖維細胞光老化。本研究用 huMSC-exo 處理 UVB 輻照后的 HaCaT 細胞，發(fā)現(xiàn)能夠顯著改善其細胞形態(tài)、促進細胞增殖，增加細胞 T-SOD 活力，降低 SA-β-gal 水平和 MDA、LDH 含量，與文獻研究結果一致，提示 huMSC-exo可能通過調(diào)節(jié)皮膚細胞氧化還原狀態(tài)發(fā)揮光老化修復作用。

盡管外泌體的生物學作用外沿被不斷拓寬，但人們對如何保存外泌體以最大程度維持其活性功能卻并未十分明確。研究指出，制備后的外泌體在保存過程中，會出現(xiàn)囊泡粒徑縮小、囊泡數(shù)量增加、膜電位降低、完整性破壞和內(nèi)容物析出等改變，影響外泌體的生物學功能[19]，但 Bosch 等[20]卻發(fā)現(xiàn)隨著存儲時間的延長，囊泡會發(fā)生聚集，從而引起數(shù)量減少。影響外泌體存儲活性、尺寸及亞型濃度的可能因素眾多，包括：存儲溫度、時長、溶劑及其 pH、外泌體來源及樣本新鮮程度、制備方法等，其中溫度被認為是影響外泌體尺寸、形態(tài)和內(nèi)容物完整性的關鍵因素[21-23]。

在本研究中，–80 ℃和 25 ℃存儲的 huMSC-exo 均能顯著修復 UVB 輻照引起的HaCaT 損傷，表明深低溫和常溫保存均能較好地維持外泌體的光老化修復活性。有趣的是，–20 ℃和 4 ℃存儲的 huMSC-exo 的恢復作用不及–80 ℃或 25 ℃存儲的 huMSC-exo，提示這并不是維持 huMSC-exo 生物學功能的最佳存儲溫度。盡管本研究用于處理細胞的 huMSC-exo 不存在反復凍融情況，但–20 ℃和–80 ℃均不可避免地存在一次 huMSC-exo 凍融，4 ℃存儲雖然未經(jīng)凍融但降溫幅度較大，提示外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等內(nèi)容物在該溫度下并不穩(wěn)定，25 ℃則是最接近 huMSC-exo 原料收集、制備和后續(xù)實驗的操作溫度。這些結果提示降溫、凍融和凍存后應用狀態(tài)等復合因素都可能影響 huMSC-exo 的生物學活性，對于 huMSC-exo 存儲應盡可能減少制備到應用全過程的溫度變化，選擇能夠較好地維持其膜結構和內(nèi)容物完整性及穩(wěn)定性的存儲溫度以幫助維持其功能活性。Oosthuyzen 等[24]在常溫儲存 28 h 的血清

外泌體中檢測發(fā)現(xiàn) CD63 和 TSG101 表達不變；Jin 等[25]發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體在常溫儲存實驗周期內(nèi)（0 ～ 48 h）RNA 含量不變，然而，尿液常溫儲存1 周，外泌體產(chǎn)量隨著存儲時間的延長而降低[26]，表明外泌體經(jīng)過制備及其來源的不同在常溫條件下的存儲穩(wěn)定性可能存在差異。目前，外泌體通常于–80 ℃存儲，盡管對外泌體存儲的最適溫度依然缺乏足夠證據(jù)支持，但苛刻的深低溫存儲無疑也成為限制外泌體應用的重要因素。本研究結果支持了 huMSC-exo 常溫存儲、運輸和應用的可行性。

本研究結果也表明，huMSC-exo 不適宜在高溫條件下存儲。Schulz 等[27]提取了 B 淋巴細胞源 EV 并測試其在 37 ℃、50 ℃、70 ℃、100 ℃和高壓蒸汽處理條件下的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)隨著高溫處理時間的延長，EV 粒徑尺寸和顆粒濃度降低、蛋白濃度升高，100 ℃ EV的粒徑比 37 ℃ EV 更小，表明高溫會造成囊泡縮小或裂解。Park 等[8]通過蛋白免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，外泌體在 4 ℃、–20 ℃和–70 ℃保存 25 d 依然表達外泌體標志性蛋白 CD63 和CD81，37 ℃條件下保存 16 d 開始不表達 CD63 和 CD81。本研究中，45 ℃存儲 1 ～ 150 d 的 huMSC-exo 對 UVB 輻照 HaCaT 的細胞形態(tài)、增殖活性、老化水平等均沒有明顯修復作用，表明即使是短時間較高溫存儲也會破壞 huMSC-exo 的生物學活性，如對表皮細胞的光老化修復作用，提示在外泌體的存儲、運輸、應用制劑制備等環(huán)節(jié)均應避免高溫。

我們在制備 huMSC-exo 后 1 ～ 150 d 的存儲周期內(nèi)選取了多個時間點對其生物學功能進行研究，存活率檢測結果顯示，各相同存儲溫度下 huMSC-exo 對 HaCaT 存活率的促進作用均隨著存儲時間的延長先下降后升高，這可能是由于同一存儲時長的 huMSC-exo 均同時制備自同一代次huMSC，而存儲 150 d 的 huMSC-exo 來源 huMSC代次最低，提示huMSC-exo 的功能和來源細胞的代次有關。HuMSC-exo 對 SA-β-gal 活性的影響則未隨著存儲時間延長顯示出明顯規(guī)律。這些結果提示在外泌體相關產(chǎn)品開發(fā)和臨床應用時應注重來源質(zhì)量、制備工藝及批次一致性，以保障功效穩(wěn)定性[8]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn) huMSC-exo 在 –80 ℃、25 ℃存儲長達 150 d 后對 HaCaT 細胞依然具有 UVB 損傷修復功能，–20 ℃保存的 huMSC-exo 作用效果次之，45 ℃ huMSC-exo 無修復作用，提示外泌體制備、存儲和應用各環(huán)節(jié)應避免高溫，同時，在適宜的溫度條件下 huMSC-exo 或可長期存儲并維持其功能活性。然而，我們從功效角度探究了不同存儲溫度 huMSC-exo 的光老化修復作用，未明確相應條件下其內(nèi)容物組成及含量、囊泡結構等改變。接下來，我們將利用熒光標記、RNA 測序等技術進一步分析不同存儲條件下 huMSC-exo 的改變及光老化修復作用機制，為 huMSC-exo 的存儲、運輸和產(chǎn)業(yè)化應用提供理論支持。

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The recovery effects of huMSC-exo stored at different temperatures on UVB irradiated HaCaT cells

ZHANG Yi, CHEN Kan-jun, WU Ting, LI Pin-zhou, HU Xiao-xi, KONG Fan-rui, QI Cheng, CHEN Liang

Author Affiliation: China Stem Cell Group Co., Ltd. / China Stem Cell Group Shanghai Biotechnology Co., Ltd. / China Stem Cell Group Affiliated Stem Cell Hospital Boao Hainan Co., Ltd. / Shanghai Cord Blood Bank/Shanghai Stem Cell Technology Co., Ltd, 200051 Shanghai, China

To investigate the recovery effects of huMSC-exo stored at different temperatures on UVB irradiated HaCaT cells.Exosomes were extracted from the medium supernatant of huMSC by ultracentrifugation and characterized by Western blot, nanoparticle tracking analysis and transmission electron microscopy. huMSC-exo were separated and stored at –80 ℃, –20 ℃,4 ℃, 25 ℃ and 45 ℃ for 1 day, 3 days, 7 days, 14 days, 30 days, 50 days, 100 days and 150 days. huMSC-exo was then added to UVB irradiated HaCaT cells. After 24 h incubation, cell viability of haCaT was measured by CCK8 assay and cell morphology was photographed. The activities of SA-β-gal and T-SOD, the contents of MDA and LDH were detected by commercial kit.The huMSC-exo showed a typical saucer-like structure with clear membrane. The median particle size was 114 nm, and the proportion of vesicles within the size range of 30 - 150 nm was about 61.42%. Besides, huMSC-exo expressed marker proteins CD9, CD63 and CD81. huMSC-exo stored at –80 ℃ and 25 ℃ for 1 - 150 d significantly improved the cell viability of UVB irradiated HaCaT cells, reduced the activity of SA-β-gal, and restored cell morphology, T-SOD, MDA and LDH levels. huMSC-exo stored at –20 ℃ also showed beneficial effects on the cell proliferation, morphology and cell aging of HaCaT cells. huMSC-exo stored at 4 ℃ decreased SA-β-gal activity. However, huMSC-exo stored at 45 ℃ could not recover UVB induced damage of HaCaT cells.huMSC-exo stored at –80 ℃ and 25 ℃ shows a significant repair effect on UVB irradiated HaCaT cells, followed by huMSC-exo stored at –20 ℃ and 4 ℃, while huMSC-exo stored at 45 ℃ exerts no significant recovery effect on HaCaT cells. These results suggests that the biological functions of huMSC-exo can be relatively well maintained at –80 ℃ and 25 ℃.

exosome; mesenchymal stem cells; HaCaT cells; UVB irradiation

WU Ting, Email: wuting@shanghaicordblood.org

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.004

伍婷，Email：wuting@shanghaicordblood.org

2020-12-24

*同為第一作者