白羽，馬旭，張艷華

·技術(shù)與方法·

腫瘤患者數(shù)字熒光分子雜交技術(shù)基因檢測(cè)復(fù)測(cè)原因分析

白羽，馬旭，張艷華

100142 北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所藥劑科，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

藥物基因組學(xué)（pharmacogenomics，PGx）是基于人類遺傳多樣性，在藥物治療中具有預(yù)測(cè)藥物療效和不良反應(yīng)的作用。通過(guò)檢測(cè)特定的 PGx 生物標(biāo)志物，臨床醫(yī)生能夠更好地預(yù)測(cè)哪些患者可能發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)和（或）療效不佳治療，為醫(yī)生臨床決策提供參考依據(jù)[1-3]。對(duì)于多數(shù)基因檢測(cè)研究，研究者多采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）聯(lián)合 Sanger 法或焦磷酸對(duì)藥物代謝酶或藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）檢測(cè)[4]。但是進(jìn)行 PCR 對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高，需要相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)和認(rèn)證。此外，傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)存在著處理量低、成本高、操作困難等缺點(diǎn)，限制了其在實(shí)驗(yàn)室診斷中的廣泛應(yīng)用[5]。然而雜交測(cè)序不需要高通量測(cè)序，也不受 PCR 實(shí)驗(yàn)室條件的限制，數(shù)字熒光分子雜交技術(shù)（digital fluorescence molecular hybridization，DFMH）是基于熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)。熒光團(tuán)偶聯(lián)特異的脫氧核糖核酸（DNA）作為探針雜交到互補(bǔ)序列上。FISH 探針的設(shè)計(jì)包括兩個(gè)熒光團(tuán)，一個(gè)作用于染色體靶區(qū)特定的 SNP，另一個(gè)作用于同源染色體的特定 SNP，其分別對(duì)兩個(gè)染色體進(jìn)行差異性標(biāo)記，通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行分析[6]。目前國(guó)內(nèi)大部分醫(yī)院采用 DFMH 進(jìn)行 SNP 檢測(cè)。

DFMH 進(jìn)行 SNP 檢測(cè)過(guò)程中需要收集白細(xì)胞，部分患者會(huì)因出現(xiàn)信號(hào)低或峰型差而進(jìn)行復(fù)測(cè)。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)復(fù)測(cè)原因分析文獻(xiàn)，而我院屬于腫瘤?？漆t(yī)院，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的放化療等腫瘤常規(guī)治療方案后會(huì)導(dǎo)致骨髓抑制，降低白細(xì)胞數(shù)量，因此本研究旨在探索患者體內(nèi)白細(xì)胞水平或患者基本特征是否是導(dǎo)致 DFMH 復(fù)測(cè)的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例收集 收集 2015 年 4 月 – 2019 年 6 月在我院接受藥物代謝酶 SNP 檢測(cè)的患者。篩選因檢測(cè)信號(hào)低或峰型差難以判斷基因型的患者?；仡櫺允占颊咴诨驒z測(cè)前后 5 日內(nèi)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，若在 5 日內(nèi)未進(jìn)行白細(xì)胞檢測(cè)則不納入研究。患者基本信息缺失的也不納入研究。

1.1.2 試劑與儀器 核酸純化試劑、NH4Cl 預(yù)處理液、測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒均為北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。D2012 離心機(jī)購(gòu)自美國(guó) Scilogex 公司；L988A 熒光檢測(cè)儀購(gòu)自西安天隆科技有限公司。

1.2 方法

在 1.5 ml 離心管中加入 1.2 ml 1 × NH4Cl 預(yù)處理液，取 200 μl 全血加入到 1 × NH4Cl 預(yù)處理液中。上下顛倒 10 次，室溫下靜置 5 min。將靜置后的離心管放入離心機(jī)中，室溫下 3000 r/min 離心 5 min，將上層透明紅色液體吸取干凈，注意避免吸走管底的白細(xì)胞。再向離心管中加入1 ml 1 × NH4Cl 重懸白細(xì)胞，室溫下 3000 r/min 離心 5 min，將上層液體吸取干凈。向富集有白細(xì)胞的離心管中加入 50 μl 核酸純化試劑，反復(fù)吹打混勻。

根據(jù)需檢測(cè)的基因位點(diǎn)，取出相對(duì)應(yīng)的測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒，向相應(yīng)的試劑盒中加入 1.5 μl 處理后的白細(xì)胞樣本混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般資料

2015 年 4 月 – 2019 年 6 月，我院共檢測(cè)患者3713 例，其中需要復(fù)測(cè)的患者有 225 例，占總病例數(shù)的 6.03%。其中 12 例患者無(wú)相關(guān)白細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果，20 例患者因門診就診無(wú)住院病歷信息，未能采集患者相關(guān)信息。最終 193 例患者納入本次研究，其中需復(fù)測(cè)位點(diǎn)數(shù) 230 個(gè)，涉及純合型基因型 109 個(gè)（47.39%），雜合型基因型 121 個(gè)（52.61%）?；颊咭话阗Y料見(jiàn)表 1。

2.2 基因位點(diǎn)復(fù)測(cè)情況

193 例患者中總共復(fù)測(cè)基因位點(diǎn) 230 個(gè)，其中復(fù)測(cè)次數(shù)最多的基因?yàn)锳BCB1，共復(fù)測(cè) 68 次，占復(fù)測(cè)總數(shù)的 29.57%。其次為MTHFR 和GSTP1基因，分別復(fù)測(cè) 36 和 35 次，占復(fù)測(cè)總數(shù)的15.65% 和 15.22%。具體基因位點(diǎn)復(fù)測(cè)情況見(jiàn)表 2。

表1 患者的一般資料

表2 基因位點(diǎn)復(fù)測(cè)情況統(tǒng)計(jì)

表3 基因檢測(cè)復(fù)測(cè)情況與患者基本特征的關(guān)系

2.3 基因檢測(cè)復(fù)測(cè)情況與患者基本特征的關(guān)系

根據(jù)患者復(fù)測(cè)位點(diǎn)個(gè)數(shù)及復(fù)測(cè)原因進(jìn)行分組。①按位點(diǎn)數(shù)：需復(fù)測(cè)一個(gè)位點(diǎn)的共 161 例患者，復(fù)測(cè)位點(diǎn)數(shù)≥ 2 的共 32 例患者；②按復(fù)測(cè)原因：由于檢測(cè)信號(hào)低需要復(fù)測(cè)的患者共 171 例，由于檢測(cè)峰型不好，無(wú)法判斷具體基因型的患者共 22 例。根據(jù)患者的基本情況如性別、年齡、身高、體重、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、基因型和癌種進(jìn)行考察。根據(jù)復(fù)測(cè)位點(diǎn)個(gè)數(shù)分組，未發(fā)現(xiàn)其與患者基本特征的相關(guān)性；而根據(jù)復(fù)測(cè)原因分組，在肝癌患者中，峰型異常的發(fā)生率較信號(hào)低的發(fā)生率高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 0.03）；男性患者多因峰型異常而復(fù)測(cè)，女性患者多因信號(hào)低而復(fù)測(cè)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（= 0.06），其他各組均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。基因檢測(cè)復(fù)測(cè)情況與患者基本特征的相關(guān)性見(jiàn)表 3。

2.4 基因檢測(cè)復(fù)測(cè)位點(diǎn)個(gè)數(shù)與復(fù)測(cè)原因的相關(guān)性

根據(jù)患者的復(fù)測(cè)位點(diǎn)個(gè)數(shù)與復(fù)測(cè)原因進(jìn)行分析，但各組間均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。具體情況見(jiàn)表 4。

表4 基因檢測(cè)復(fù)測(cè)位點(diǎn)個(gè)數(shù)與復(fù)測(cè)原因的相關(guān)性

2.5 不同采血時(shí)間白細(xì)胞計(jì)數(shù)與基因檢測(cè)復(fù)測(cè)原因的相關(guān)性

根據(jù)不同的采血時(shí)間分組，分為化療周期內(nèi)采血及非化療周期內(nèi)采血，復(fù)測(cè)位點(diǎn)數(shù) N ≥ 2 中，化療周期內(nèi)采血白細(xì)胞計(jì)數(shù)為（5.67 ± 3.27）× 109/L，較非化療周期內(nèi)采血低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 0.04）。在非化療周期內(nèi)采血，復(fù)測(cè)位點(diǎn)數(shù) N = 1 中，白細(xì)胞計(jì)數(shù)為（7.94 ± 3.41）× 109/L 較 N ≥ 2 低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 0.03）。各組白細(xì)胞計(jì)數(shù)處于正常水平，其他各組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)差異性。具體情況見(jiàn)表 5。

3 討論

目前我院主要利用 DFMH 進(jìn)行藥物代謝酶相關(guān)基因檢測(cè)，6.03% 的患者會(huì)出現(xiàn)基因檢測(cè)復(fù)測(cè)情況，其中可能還會(huì)有多次復(fù)測(cè)的情況，這將使得醫(yī)院付出更多的人力物力，導(dǎo)致醫(yī)院的直接經(jīng)濟(jì)損失，目前國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)研究報(bào)道，為了探索其失敗原因我們進(jìn)行了此項(xiàng)研究。

根據(jù)單個(gè)患者需要進(jìn)行基因檢測(cè)復(fù)測(cè)位點(diǎn)個(gè)數(shù)進(jìn)行分組，無(wú)論復(fù)測(cè)位點(diǎn)數(shù)是 1 個(gè)還是≥ 2 個(gè)，其與患者的基本特征都沒(méi)有明顯的相關(guān)性。根據(jù)患者復(fù)測(cè)的原因分為低信號(hào)組和峰型異常組，其在肝癌患者中，由于峰型異常導(dǎo)致復(fù)測(cè)的原因明顯高于低信號(hào)組（= 0.03），其原因可能與肝臟的功能降低有關(guān)，但由于此類患者樣本數(shù)較少，僅有 3 例患者，后續(xù)還需擴(kuò)大樣本量加以證實(shí)。其他患者基本特征與復(fù)測(cè)原因沒(méi)有明顯相關(guān)性。

根據(jù)患者的采血時(shí)間進(jìn)行分組，分為化療周期內(nèi)采血及非化療周期內(nèi)采血，其中在復(fù)測(cè)位點(diǎn)數(shù)≥ 2 個(gè)時(shí)，化療周期內(nèi)采血的白細(xì)胞水平較非化療周期內(nèi)采血的白細(xì)胞水平偏低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 0.04）。非化療周期內(nèi)采血，復(fù)測(cè)位點(diǎn)數(shù)為 1 個(gè)時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)較復(fù)測(cè)位點(diǎn)數(shù)≥ 2 個(gè)時(shí)低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 0.03），這提示雖然白細(xì)胞計(jì)數(shù)處于正常水平，但是仍可能影響復(fù)測(cè)結(jié)果，其原因可能為術(shù)中患者輸血，或化療后常規(guī)使用升白藥物導(dǎo)致，其具體原因有待后續(xù)探索。

本研究存在一定的局限性，僅對(duì)復(fù)測(cè)患者病例進(jìn)行了分析，而沒(méi)有與非復(fù)測(cè)患者進(jìn)行比較，無(wú)法明確患者的基本特征是否與復(fù)測(cè)相關(guān)。復(fù)測(cè)患者中白細(xì)胞計(jì)數(shù)水平雖然維持正常水平，但也對(duì)復(fù)測(cè)產(chǎn)生了一定的影響，其具體原因還有待后續(xù)探索。此外，由于部分門診患者無(wú)需入院治療，無(wú)法收集患者基本信息，因此對(duì)這部分基因檢測(cè)復(fù)測(cè)的患者排除在外，可能存在一定的偏倚。

表5 化療周期與基因檢測(cè)復(fù)測(cè)原因的相關(guān)性

綜上，腫瘤患者雖然白細(xì)胞計(jì)數(shù)水平維持在正常范圍內(nèi)，但仍對(duì)基因檢測(cè)復(fù)測(cè)產(chǎn)生影響，其原因尚不明確，后續(xù)還需與非復(fù)測(cè)患者進(jìn)行比較來(lái)探索更多的可能性。因基因檢測(cè)均由同一人完成，暫時(shí)忽略人為因素，同時(shí)也考慮試劑的自身原因可能是導(dǎo)致基因檢測(cè)復(fù)測(cè)的原因。

[1] Relling MV, Evans WE. Pharmacogenomics in the clinic. Nature, 2015, 526(7573):343-350.

[2] Wellmann R, Borden BA, Danahey K, et al. Analyzing the clinical actionability of germline pharmacogenomic findings in oncology. Cancer, 2018, 124(14):3052-3065.

[3] Wang B, Canestaro WJ, Choudhry NK. Clinical evidence supporting pharmacogenomic biomarker testing provided in US food and Drug Administration drug labels. JAMA Intern Med, 2014, 174(12):1938- 1944.

[4] Yang LY, Yang X, Fan DM, et al. Common gene-related polymorphisms of drug metabolism in Chinese population and their detection methods. J Mol Diagn Ther, 2017, 9(5):358-363. (in Chinese)

楊琳艷, 楊旭, 范冬梅, 等. 中國(guó)人群常見(jiàn)的藥物代謝相關(guān)基因多態(tài)位點(diǎn)及其檢測(cè)方法. 分子診斷與治療雜志, 2017, 9(5):358-363.

[5] Yang Y, Xie B, Yan J. Application of next-generation sequencing technology in forensic science. Genomics Proteomics Bioinformatics, 2014, 12(5):190-197.

[6] Cui C, Shu W, Li P. Fluorescence in situ hybridization: cell-based genetic diagnostic and research applications. Front Cell Dev Biol, 2016, 4:89.

[7] Wang NN, Bai Y, Liu H, et al. Characteristics of adverse reactions of antineoplastic drugs in 787 cases and the prognosis analysis. Anti-Tumor Pharm, 2019, 9(1):143-148. (in Chinese)

王娜娜, 白羽, 劉紅, 等. 787例抗腫瘤藥物不良反應(yīng)特點(diǎn)及預(yù)后因素分析. 腫瘤藥學(xué), 2019, 9(1):143-148.

張艷華，Email：zyh8812@163.com

2021-01-07

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.015