石桃雄 汪燕 梁成剛 韋春玉 關志秀 黃娟 朱麗偉

摘要：植物二磷酸尿核苷-半乳糖轉運蛋白（UDP-galactose transporter，UTR）參與介導UDP-半乳糖的跨膜運輸，對于高爾基體內非纖維素多糖和糖蛋白合成至關重要。為了給苦蕎糖運輸及調控機制研究提供科學參考，本研究基于基因功能注釋與同源基因比對，鑒定到9個苦蕎FtUTR基因，其序列長度在1 920～5 975 bp間，氨基酸殘基在 81～352個間。FtUTR氨基酸序列的一致性為19.14%，說明苦蕎不同F(xiàn)tUTR蛋白間序列保守性較低。但多個苦蕎FtUTR可分別與同源的擬南芥AtUTR聚在一起，說明不同物種間UTR蛋白的進化關系較為緊密。基于莖的轉錄組測序鑒定到5個差異表達基因（DEGs），其中FtPinG0001931200.01在出苗后5 d高表達;FtPinG0001901300.01和FtPinG0002689200.01在出苗后10 d高表達;FtPinG0001931400.01和FtPinG0001052700.01在出苗后15 d高表達，推測它們可能在幼苗的特定發(fā)育階段發(fā)揮作用。另外，幼苗發(fā)育過程中苦蕎DEGs的表達量存在多個顯著正相關或負相關關系。本研究結果可為下一步深入探索苦蕎FtUTR調控UDP-半乳糖運輸以及生長發(fā)育提供基礎。

關鍵詞：苦蕎;二磷酸尿核苷-半乳糖轉運體;蛋白序列分析;基因表達

中圖分類號：S517.01?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）15-0053-05

收稿日期：20201-04-14

基金項目：國家自然科學基金 （編號：32060511）;貴州省科技支撐計劃 （編號：黔科合ZC[2019]2298）;貴州省高層次創(chuàng)新型人才“千層次人才”項目;貴州省蕎麥種質資源保育及創(chuàng)新重點實驗室建設基金（編號：黔教合KY[2017]002）;貴州省研究生教育創(chuàng)新計劃 （編號：黔教合YJSCXJH[2020]100）。

作者簡介：石桃雄（1980—），女，寧夏石嘴山人，博士，副教授，研究方向為蕎麥數(shù)量遺傳學，E-mail：shitaoxiong@126.com;共同第一作者：汪 燕（1985—），女，重慶人，博士，副教授，研究方向為蕎麥種質資源創(chuàng)新與遺傳育種，E-mail：yanwanguf@163.com。

通信作者：梁成剛，博士，副教授，研究方向為蕎麥遺傳育種。E-mail：jesselcg@163.com。

二磷酸尿核苷-半乳糖（UDP-galactose）是植物高爾基體內非纖維素多糖和糖蛋白合成的重要前體物質[1-2]。UDP-半乳糖轉運蛋白（UDP-galactose transporter，UTR）則是介導UDP-半乳糖進行跨膜運輸?shù)闹匾d體，對于植物的生長發(fā)育具有重要作用[3-4]。Khalil等將人類的UDP-半乳糖轉運體基因hUGT1導入煙草，結果發(fā)現(xiàn)轉基因煙草植株表現(xiàn)出類似于外源赤霉素噴施的形態(tài)特征[5]。Reyes等研究指出，擬南芥中UDP-半乳糖轉運體AtUTr1定位于內質網(wǎng)，體外試驗證實AtUTr1能夠參與UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖運輸[6]。此外，Bakker等鑒定獲得2個擬南芥UDP-半乳糖轉運體基因（UDP-GalT1和UDP-GalT2），互補試驗證實它們具有UDP-半乳糖底物特異性[7]。Rollwitz等則在擬南芥中鑒定到一個新的UDP-半乳糖蛋白AtNST-KT1[8]。Handford等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtUTr7調控了UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖的運輸，進而影響側根的發(fā)育[9]。Seino等基于擬南芥UDP-galactose transporter序列比對，鑒定到水稻同源基因，并克隆了4個OsUGT基因，分別編碼350、337、345和358個氨基酸殘基[10];互補試驗證實OsUGT1、OsUGT2、OsUGT3可參與介導UDP-半乳糖的運輸，而OsUTG4則介導了UDP-葡萄糖的運輸。蘇瑩等基于同源比對鑒定到具有UDP-半乳糖和UDP-鼠李糖轉運活性的水稻OsURGT1，氨基酸殘基數(shù)為331個，可能參與多種激素調控途徑和逆境脅迫調控途徑[11]。

苦蕎是我國的特色雜糧作物，主要種植于西南高寒地區(qū)[12]。苦蕎生育期短，同時具有耐貧瘠、耐冷涼、耐干旱等特性，加之其營養(yǎng)保健功能突出，深受人們的喜愛[13-14]。不過，作為一種小宗作物，苦蕎栽培馴化時間短，基礎研究開展較為滯后，開展與苦蕎糖運輸及調控機制的相關研究工作，可為探索苦蕎生長發(fā)育與產量形成提供科學參考。本研究首次對苦蕎UDP-半乳糖轉運基因家族FtUTR基因進行篩選、鑒定與生物信息學分析，明確FtUTR基因信息及編碼蛋白理化特性、系統(tǒng)發(fā)育關系，并結合轉錄組測序分析苦蕎FtUTR的表達模式等，為苦蕎糖類運輸?shù)姆肿诱{控機制等相關研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

基于擬南芥TAIR基因庫（https：//www.arabidopsis.org/about/datasources.jsp）中查詢獲得的AtUTR基因序列和苦蕎轉錄組測序數(shù)據(jù)庫的基因功能注釋，進行序列同源比對，篩選并鑒定苦蕎FtUTR基因。

1.2 苦蕎FtUTR基因及編碼蛋白的序列分析

登陸NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進行苦蕎FtUTR基因的最長開放閱讀框編碼蛋白（MaxORF）及編碼蛋白的氨基酸序列預測。登陸Expasy網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）進行苦蕎FtUTR編碼蛋白的氨基酸殘基數(shù)、蛋白分子質量、等電點、疏水性和脂肪族氨基酸指數(shù)的預測。登陸蛋白結構預測網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進行苦蕎FtUTR蛋白的跨膜結構功能域預測。利用DNAman軟件分析FtUTR氨基酸序列的保守位點。利用MEGA 5.0軟件Cluster W進行FtUTR氨基酸序列多重序列比對分析，使用Neighbor-joining法進行蛋白聚類分析，重復次數(shù)設置為1 000次。

1.3 苦蕎FtUTR基因的表達與相關性分析

試驗于2018年在貴州省蕎麥工程技術研究中心基地進行，在苦蕎出苗后5、10、15 d對基部莖進行轉錄組測序和基因表達分析，并鑒定差異表達基因（DEGs）。利用MeV軟件制作FtUTR基因的表達量熱圖，SPSS 19.0進行FtUTR基因表達量的相關性分析。

2 結果與分析

2.1 苦蕎FtUTR基因及蛋白序列分析

基于轉錄組測序的基因功能注釋與擬南芥AtUTR序列比對篩選到9個同源苦蕎FtUTR基因。如表1所示，苦蕎FtUTR序列在1 920～5 975 bp間，MaxORF的氨基酸殘基在81～352個間，分子量在8 780.03～39 287.30 u間，等電點在4.88～980間，疏水性在-0.200～0.728間，脂肪族氨基酸指數(shù)在72.35～111.03間。跨膜結構域預測發(fā)現(xiàn)6個FtUTR的MaxORF跨膜結構域在2～8個間，3個FtUTR的MaxORF蛋白不含有跨膜結構域。

對苦蕎FtUTR的MaxORF蛋白序列進行比對分析，結果發(fā)現(xiàn)9個苦蕎FtUTR的MaxORF蛋白序列一致性僅為19.14%。如圖1所示，9個蛋白間不存在完全共同保守位點，僅存在19個相對保守位點，說明FtUTR間氨基酸序列差異較大。

2.2 苦蕎FtUTR蛋白序列分析

利用擬南芥AtUTR蛋白序列與苦蕎FtUTR蛋白序列進行聚類分析，由圖2可知，擬南芥UTR1、UTR3與苦蕎FtPinG0001052700.01、FtPinG0001901300.01被聚為一小類;擬南芥UTR2與苦蕎FtPinG0001931400.01、FtPinG0006716700.01被聚為一小類;擬南芥UTR6與苦蕎FtPinG0006904300.01被聚為一小類;擬南芥UTR7與苦蕎FtPinG0003694100.01被聚為一小類;另外，苦蕎FtPinG0007731500.01、FtPinG0002689200.01和FtPinG0001931200.01被聚為一小類。

2.3 苦蕎莖發(fā)育過程中FtUTR基因的表達分析

基于轉錄組測序，檢測到9個FtUTR基因在苦蕎出苗后5、10、15 d莖中均有表達，DEGs鑒定發(fā)現(xiàn)5個FtUTR基因在不同時期莖中差異表達。由圖 3-A 可知，不同時期莖FtUTR基因的表達量變化趨勢不一致，主要存在表達量逐漸升高、逐漸降低、先升高后降低以及相對變化幅度較小的4種變化類型。由圖3-B可知，1個苦蕎FtUTR差異表達基因（FtPinG0001931200.01）在出苗后5 d高表達;2個苦蕎FtUTR差異表達基因（FtPinG0001901300.01和FtPinG0002689200.01）在出苗后10 d高表達;2個苦蕎FtUTR差異表達基因（FtPinG0001931400.01和FtPinG0001052700.01）在出苗后15 d高表達，推測不同F(xiàn)tUTR基因可能在莖的特定發(fā)育階段發(fā)揮功能。

2.4 苦蕎FtUTR基因的相關性分析

對不同時期苦蕎莖FtUTR基因的表達量進行

相關性分析，由表2可知，F(xiàn)tPinG0001931200.01與FtPinG0001052700.01、FtPinG0001931400.01呈顯著或極顯著負相關關系;FtPinG0002689200.01與FtPinG0001901300.01呈極顯著正相關關系，與FtPinG0001052700.01、FtPinG0001931400.01呈顯著或極顯著負相關關系;FtPinG0001901300.01與FtPinG0001052700.01、FtPinG0001931400.01呈極顯著負相關關系;FtPinG0001052700.01與FtPinG0001931400.01呈極顯著正相關關系。

3 討論與結論

植物UTR蛋白介導的UDP-半乳糖跨膜運輸對非纖維素多糖和糖蛋白合成具有重要作用[1-3，15]?；跀M南芥UTR序列，在作物中陸續(xù)開展了同源基因的相關研究。例如Seino等克隆得到了水稻OsUGT1、OsUGT2、OsUGT3、OsUGT4，分別編碼350、337、345、358個氨基酸殘基[10]。本研究基于轉錄組測序的基因功能注釋與擬南芥UTR同源基因進行比對，篩選到9個苦蕎FtUTR基因。其中，F(xiàn)tPinG0001052700.01、FtPinG0003694100.01、FtPinG0001931400.01FtUTR基因分別編碼332、339、352個氨基酸殘基，其余6個FtUTR基因的最長開放閱讀框編碼氨基酸序列較短?？缒そY構預測發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列較長的FtUTR蛋白含有多個跨膜結構域，雖然3個FtUTR基因的MaxORF不存在跨膜結構域，不過它們的其他ORF編碼蛋白含有跨膜結構域，因此，推測9個苦蕎FtUTR基因均能介導跨膜運輸。

Seino等指出植物中存在多個UDP-半乳糖轉運基因，但相互間進化關系并不緊密[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎9個FtUTR蛋白間序列一致性僅為1914%，且不存在完全共同保守位點，僅含19個相對保守位點，說明苦蕎不同F(xiàn)tUTR蛋白間序列保守性較低。不過，多個擬南芥AtUTR與苦蕎FtUTR被聚在一起，例如擬南芥AtUTR2與苦蕎FtPinG0001931400.01、FtPinG0006716700.01被聚為一小類，說明不同物種間UTR蛋白的進化關系較為緊密。

本研究發(fā)現(xiàn)苦蕎莖不同發(fā)育時期9個FtUTR基因表達量變化趨勢不一致，基于轉錄組差異基因分析共鑒定到5個DEGs，其中FtPinG0001931200.01在出苗后5 d高表達;FtPinG0001901300.01和FtPinG0002689200.01在出苗后10 d高表達;FtPinG0001931400.01和FtPinG0001052700.01在出苗后15 d高表達?？嗍w出苗后5 d，幼苗正處于子葉期，營養(yǎng)物質由地下種子向地上部分運輸，10 d時幼苗正逐步完成由子葉期向真葉期的過渡，而 15 d時植株則完全進入真葉期，因此，推測這些FtUTR可能在幼苗的特定發(fā)育階段發(fā)揮作用。另外，4個FtUTR基因在莖不同發(fā)育時期表達量無明顯變化，表明它們可能在幼苗發(fā)育過程中持續(xù)發(fā)揮作用。相關性研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎中FtUTR基因中5個DEGs間存在多個顯著正相關或負相關的關系，而其余4個FtUTR基因與其他FtUTR基因間不存在顯著性相關，說明這些DEGs間可能協(xié)調發(fā)揮功能或相互間存在功能互補現(xiàn)象。本研究為下一步深入探索苦蕎FtUTR調控UDP-半乳糖運輸以及生長發(fā)育提供了基礎。

參考文獻：

[1]Zimowski J. Characterization of UDP-galactose：tomatidine galactosyltransferase from tomato （Lycopersicon esculentum） leaves[J]. Acta Biochimica Polonica，1994，41（2）：202-204.

[2] Bergenstrahle A，Tillberg E，Jonsson L. Characterization of UDP-glucose：solanidine glucosyltransferase and UDP-galactose：solanidine galactosyltransferase from potato tuber[J]. Plant Science，1992，84（1）：35-44.

[3]Norambuena L. Transport of UDP-galactose in plants[J]. Journal of Biological Chemistry，2002，277（36）：32923-32929.

[4]Sprong H，Degroote S，Nilsson T，et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose：ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum[J]. Molecular Biology of the Cell，2003，14（8）：3482-3493.

[5]Khalil M F，Kajiura H，F(xiàn)ujiyama K，et al. The impact of the overexpression of human UDP-galactose transporter gene hUGT1 in tobacco plants[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2010，109（2）：159-169.

[6]Reyes F，Marchant L，Norambuena L，et al. AtUTr1，a UDP-glucose/UDP-galactose transporter from Arabidopsis thaliana，is located in the endoplasmic reticulum and up-regulated by the unfolded protein response[J]. The Journal of Biological Chemistry，2006，281（14）：9145-9151.

[7]Bakker H，Routier F，Oelmann S，et al. Molecular cloning of two Arabidopsis UDP-galactose transporters by complementation of a deficient Chinese hamster ovary cell line[J]. Glycobiology，2005，15（2）：193-201.

[8]Rollwitz I，Santaella M，Hille D，et al. Characterization of AtNST-KT1，a novel UDP-galactose transporter from Arabidopsis thaliana[J]. FEBS Letters，2006，580（17）：4246-4251.

[9]Handford M，Rodríguez-Furlán C，Marchant L，et al. Arabidopsis thaliana AtUTr7 encodes a golgi-localized UDP-glucose/UDP-galactose transporter that affects lateral root emergence[J]. Molecular Plant，2012，5（6）：1263-1280.

[10]Seino J，Ishii K，Nakano T，et al. Characterization of rice nucleotide sugar transporters capable of transporting UDP-galactose and UDP-glucose[J]. Journal of Biochemistry，2010，148（1）：35-46.

[11]蘇 瑩，杜 強，郭崇炎，等. 水稻OsURGT1基因的生物信息學及表達譜分析[J]. 華北農學報，2020，35（5）：1-10.

[12]梁詩涵，李 境，周 達，等. 中國苦蕎主產區(qū)苦蕎種質形態(tài)性狀的遺傳多樣性分析[J]. 分子植物育種，2020，18（21）：7254-7266.

[13]國旭丹，王超楠，張 婧，等. 苦蕎抗氧化性與生長條件的相關性[J]. 中國糧油學報，2019，34（3）：19-23，37.

[14]李 俊，盧 揚，趙 剛，等. 苦蕎芽苗茶飲料發(fā)酵前后營養(yǎng)、風味及抗氧化活性的變化[J]. 食品與機械，2019，35（7）：187-192.

[15]Reyes F，León G，Donoso M，et al. The nucleotide sugar transporters AtUTr1 and AtUTr3 are required for the incorporation of UDP-glucose into the endoplasmic reticulum，are essential for pollen development and are needed for embryo sac progress in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal，2010，61（3）：423-435.