何雪怡 羅曉霞 陶德琴 杜振雄

摘要：研究不同光照度對異養(yǎng)鞭毛蟲Paraphysomonas sp.攝食及抑制銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）的影響，探討鞭毛蟲在不同光照條件下的生長狀況。共設6個光照度，分別是0、500、1 200、2 500、5 000、10 000 lx。結果表明，不同光照度對異養(yǎng)鞭毛蟲種群生長率、微囊藻抑制率均有顯著影響（P<0.05）。在光照度為0～10 000 lx時，鞭毛蟲均能顯著抑制微囊藻種群生長，抑制率達88%～94%，每個鞭毛蟲攝食率高達32～49個/d。伴隨著銅綠微囊藻數(shù)量的減少，不同光照度下的鞭毛蟲種群數(shù)量均呈先增加后減少的趨勢，鞭毛蟲種群數(shù)量高達（18～35）×104個/mL，比初始濃度增加了3.6～7倍。光照度最高組（10 000 lx）的異養(yǎng)鞭毛蟲數(shù)量增長緩慢且快速下降，在試驗的第3、4 天，生長率出現(xiàn)負增長。因此，過高的光照度會抑制異養(yǎng)鞭毛蟲數(shù)量的增長。異養(yǎng)鞭毛蟲可生長的光照度范圍為0～10 000 lx，最佳生長光照度為0～5 000 lx。

關鍵詞：異養(yǎng)鞭毛蟲;微囊藻;光照度;生長率;抑制率;攝食率

中圖分類號： X174;X52? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）15-0215-06

收稿日期：2020-12-18

基金項目：廣東省自然科學基金（編號：2018A030313212）;廣東省湛江市科技計劃（編號：2020B01055）;廣東海洋大學博士啟動項目（編號：R17039）;大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（編號：S201910566045）;廣東海洋大學第六屆優(yōu)秀本科生進實驗室項目。

作者簡介：何雪怡（1999—），女，廣東英德人，主要從事生物科學研究。E-mail：1923243136@qq.com。

通信作者：羅曉霞，博士，試驗師，主要從事水體生態(tài)修復研究。E-mail：xialemon@126.com。

目前，我國許多大型湖泊和水庫頻繁暴發(fā)藍藻水華，水體生態(tài)平衡遭受嚴重破壞，生態(tài)環(huán)境惡化。微囊藻水華是常見的藍藻水華種類，在全世界廣泛分布，已被分離出的微囊藻毒素達60多種[1]。藍藻水華釋放的藻毒素是導致我國南方肝癌發(fā)病率高的主要原因[2-4]。因此，水體環(huán)境的生態(tài)修復已是迫在眉睫。

許多研究表明原生動物是微囊藻水華中的主要消費者。Nishibe在富營養(yǎng)化池塘中分離出一種變形蟲Penardochlamys sp.，發(fā)現(xiàn)其食物泡中含有大量微囊藻顆粒，表明其可以吞噬自然環(huán)境下的群體微囊藻[5]。Kim等在室內研究發(fā)現(xiàn)鞭毛蟲Diphylleia sp.對微囊藻的攝食率高達30個/d[6-7]。Zhang等發(fā)現(xiàn)鞭毛蟲Poterioochromonas malhamensis既能通過光合作用進行群體增殖，也能通過吞噬銅綠微囊藻進行種群增長[8-9]。草履蟲可有效清除微囊藻種群數(shù)量[10]。因此，富營養(yǎng)化水體中，原生動物被認為是藍藻水華碳流途徑中的關鍵環(huán)節(jié)[11-14]。異養(yǎng)鞭毛蟲是原生動物中的重要組成部分[15-16]，它不含色素體，具有鞭毛進行運動，以有機物作為食物來源[17]。已有研究報道異養(yǎng)鞭毛蟲可以吞噬有機碎屑、細菌、綠藻、硅藻及藍藻等[9，18-21]。因此，培養(yǎng)利用鞭毛蟲清除藍藻水華是一種新的探索。

筆者前期在腐爛的銅綠微囊藻中分離出一種具有吞噬微囊藻能力的異養(yǎng)鞭毛蟲，當銅綠微囊藻濃度為（0～2 000）×104 個/mL時，它對微囊藻的抑制率達98%～99.69%[22]。目前，光照度對銅綠微囊藻及異養(yǎng)鞭毛蟲兩者相互作用的動態(tài)變化影響缺乏研究數(shù)據(jù)，而了解理化因子對異養(yǎng)鞭毛蟲吞噬微囊藻能力的影響，將有助于揭示鞭毛蟲參與自然界微囊藻水華調控的作用機制。因此，本試驗研究不同光照度對異養(yǎng)鞭毛蟲Paraphysomonas sp.生長及其抑制銅綠微囊藻的影響，旨在找到鞭毛蟲吞噬微囊藻的適宜光照度范圍，為應用鞭毛蟲生物控藻提供基礎理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從腐爛的銅綠微囊藻培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)一種異養(yǎng)鞭毛蟲Paraphysomonas sp.，經單個分離，擴大培養(yǎng)于3 000 mL錐形瓶，以銅綠微囊藻（M. aeruginosa）為餌料，每隔4～5 d投喂1次。培養(yǎng)溫度25～30 ℃、光照度1 500～1 700 lx。

銅綠微囊藻由廣東海洋大學藻種室提供，為產毒種（FACHB-905）。微囊藻用BG11配方培養(yǎng)，選取指數(shù)增長期的藻類進行試驗。

1.2 試驗方法

試驗于2018年7月14—17日在廣東海洋大學實驗室進行。光照度設置為0、500、1 200、2 500、5 000、10 000 lx共6個梯度，每個光照梯度設3個平行試驗組、2個對照組。往30個錐形瓶（規(guī)格為 250 mL）中分別加入濃度為500×104 個/mL的銅綠微囊藻180 mL。其中，試驗組加入離心濃縮后的異養(yǎng)鞭毛蟲培養(yǎng)液20 mL[23-24];對照組則不添加異養(yǎng)鞭毛蟲，加入20 mL BG11培養(yǎng)液。錐形瓶放置在光照培養(yǎng)箱（FPG3，寧波萊福）進行培養(yǎng)，設置溫度25 ℃，光—暗周期為12 h—12 h。試驗共進行4 d，每天用移液槍采集10 mL樣品，添加魯哥試劑固定，用血球計數(shù)板分別計算銅綠微囊藻及異養(yǎng)鞭毛蟲密度。

1.3 計算方法

異養(yǎng)鞭毛蟲的生長率（μ）的計算公式[8]：

μ=lnNt-lnN0t。（1）

式中：N0表示異養(yǎng)鞭毛蟲的初始密度（個/mL），t表示試驗時間（d），Nt表示異養(yǎng)鞭毛蟲在試驗結束時的密度（個/mL）。

異養(yǎng)鞭毛蟲對銅綠微囊藻的抑制率IR：

IR=1-MtMc×100%。（2）

式中：Mt表示試驗結束時試驗組銅綠微囊藻的密度（個/mL），Mc表示試驗結束時對照組銅綠微囊藻的密度（個/mL）。

異養(yǎng)鞭毛蟲對銅綠微囊藻的攝食率[8]：

Ic=Mt0-MtNt-N0lnNt-lnN0×t。（3）

式中：Mt0表示處理組銅綠微囊藻的初始密度（個/mL），Mt表示處理組銅綠微囊藻在試驗結束時的密度（個/mL），N0表示異養(yǎng)鞭毛蟲的初始密度（個/mL），Nt表示異養(yǎng)鞭毛蟲在試驗結束時的密度（個/mL），t表示試驗時間（d）。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)運用SPSS17.0 軟件進行單因素多重均值（Duncans）比較，顯著性水平α=0.05。

2 結果與分析

2.1 不同光照度下異養(yǎng)鞭毛蟲及銅綠微囊藻數(shù)量變化趨勢

在對照組中，不同光照度下的微囊藻密度在試驗期間內持續(xù)上升（圖1），最終密度增長至初始密度的1.6～2.6倍。反之，試驗組中，隨著異養(yǎng)鞭毛蟲密度的增長，銅綠微囊藻的數(shù)量持續(xù)下降。因此，當光照度為0～10 000 lx時，異養(yǎng)鞭毛蟲均能抑制微囊藻密度的增長。隨著試驗組中銅綠微囊藻密度減少，異養(yǎng)鞭毛蟲密度呈先上升后下降趨勢。

2.2 不同光照度下異養(yǎng)鞭毛蟲的生長

各光照度下的鞭毛蟲種群數(shù)量分別在試驗的第2、3天達到高峰值，隨后逐漸下降（圖2）。2 500、5 000 lx組的異養(yǎng)鞭毛蟲生長速度較快，種群數(shù)量在第2天顯著高于低光照組（0、500 lx）及最高光照組（10 000 lx），鞭毛蟲數(shù)量由初始的5×104 個/mL

增長至（31～35）×104個/mL，其數(shù)量是低光照組及最高光照組的2倍。全黑暗組（0 lx）的鞭毛蟲增長速度較其他光照組慢，在第3天才開始快速增長，并顯著高于其他試驗組。光照度過高不利于鞭毛蟲數(shù)量的增長，光照度最高組（10 000 lx）的異養(yǎng)鞭毛蟲數(shù)量增長緩慢且快速下降，在第3、4天，鞭毛蟲數(shù)量顯著低于其他光照組。因此，光照度對異養(yǎng)鞭毛蟲密度增長有顯著影響（P<0.05），鞭毛蟲在光照度0～10 000 lx范圍內均能生長，但最適生長光照度為0～5 000 lx。

光照度對鞭毛蟲的生長率有顯著影響（P<0.05）（圖3）。當光照度為500～10 000 lx時，鞭毛蟲的生長率在第1 天即達到最高峰，生長率高達0.94～1.37 d-1，表明鞭毛蟲在試驗初期即進入旺盛生長期;在第2天時，2 500、5 000 lx光照組的鞭毛蟲生長率明顯高于其他光照組;黑暗組的鞭毛蟲生長率在試驗過程中保持相對穩(wěn)定，在第3、4天時顯著高于其他光照組。最高光照組（10 000 lx）中的鞭毛蟲生長率在第3、4天出現(xiàn)負值，顯著低于其他光照組。因此，光照度過大時，不利于鞭毛蟲種群的持續(xù)生長。

2.3 不同光照度下異養(yǎng)鞭毛蟲對銅綠微囊藻的抑制作用

在0～10 000 lx 光照度范圍內，異養(yǎng)鞭毛蟲對銅綠微囊藻均具有明顯抑制作用（圖4），其抑制率高達88%～94%。光照度較低的0、500 lx組的異養(yǎng)鞭毛蟲對微囊藻數(shù)量抑制能力較低，在試驗的第3天才達到最高峰。光照度最高的10 000 lx組的抑制率在試驗的第3、4 天出現(xiàn)明顯下降，表明光照度過高不利于抑制銅綠微囊藻。

2.4 不同光照度下異養(yǎng)鞭毛蟲對銅綠微囊藻的攝食作用

不同光照度對異養(yǎng)鞭毛蟲的攝食率無顯著影響（P>0.05）（圖5）。光照度為0～10 000 lx時，異養(yǎng)鞭毛蟲對銅綠微囊藻的攝食率達32～49個/d。

3 討論

3.1 不同光照度對異養(yǎng)鞭毛蟲生長的影響

有學者發(fā)現(xiàn)，光照是吞噬型鞭毛蟲生長過程中不可缺少的生長要素[8-9，25-26]。Caron等發(fā)現(xiàn)鞭毛蟲Dinobryon cylindricum在具有光照、并且持續(xù)提供食物的情況下保持旺盛生長，然而在黑暗中卻停止對食物的吞噬作用，且生物量不斷減少，在黑暗中存活時間不超過1 d[26]。Zhang等發(fā)現(xiàn)鞭毛蟲在全黑暗的情況下，第2天生物量急劇下降，超過5 d時鞭毛蟲即無法生存[8-9]。然而，本試驗篩選的異養(yǎng)鞭毛蟲Paraphysomonas sp.在全黑暗條件下，種群數(shù)量逐漸增長，比初始濃度增長了5.6倍，且最高種群密度與正常光照組密度相似。該鞭毛蟲在持續(xù)7 d的全黑暗條件中均能生存，證明本試驗所篩選的異養(yǎng)鞭毛蟲適應能力強，不僅在光照中生長，也可以在黑暗中生存，并以吞噬微囊藻進行種群增長。

Caron等發(fā)現(xiàn)鞭毛蟲Poterioochromonas malhamensis在不同光照度（500～25 000 lx）下生長率無顯著差異，生長率達1.5～1.7 d-1[27]。Zhang等也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，鞭毛蟲P. malhamensis在光照度1 000～2 500 lx內生長無明顯差異[8-9]。然而，郭勝娟等發(fā)現(xiàn)在光照度 0～10 000 lx 范圍內，鞭毛蟲Poterioochromonas sp.的生長與光照表現(xiàn)出強的正相關關系[28]。本試驗結果也表明不同光照度對異養(yǎng)鞭毛蟲種群數(shù)量有顯著影響（P<0.05）（圖2）。光照度為 2 500、5 000 lx的異養(yǎng)鞭毛蟲數(shù)量在第2天顯著高于低光照組（0、500 lx）及最高光照組（10 000 lx）。全黑暗組（0 lx）的鞭毛蟲增長速度較其他光照組慢，在第3天才開始快速增長，增長速度顯著高于其他試驗組。但是，光照度過高不利于鞭毛蟲種群的增長，最高光照組（10 000 lx）的異養(yǎng)鞭毛蟲數(shù)量增長較少且下降快，在第3、4天，鞭毛蟲數(shù)量顯著低于其他光照組，且出現(xiàn)負生長率。因此，本試驗中鞭毛蟲生長的較適光照度為0～5 000 lx。

3.2 不同光照度對異養(yǎng)鞭毛蟲對銅綠微囊藻抑制作用的影響

已有研究報道鞭毛蟲在光照條件下能有效抑制微囊藻的生長，但是在黑暗中鞭毛蟲對微囊藻的抑制作用下降，微囊藻的數(shù)量保持不變甚至有輕微上升[9]。但是也有結論相反的研究，Yan等發(fā)現(xiàn)在 24 h 內，鞭毛蟲Paraphysomonas sp.在黑暗環(huán)境下對微囊藻的抑制率高于光照條件下[29]。本試驗表明，在0～10 000 lx 光照度范圍內，異養(yǎng)鞭毛蟲對銅綠微囊藻均具有抑制作用，其抑制率高達88%～94%，但是黑暗組的異養(yǎng)鞭毛蟲對微囊藻數(shù)量抑制率上升較慢，在第3天達到高峰值。Skovgaard發(fā)現(xiàn)甲藻Fragilidium subglobosum在低光照條件下會起吞噬微囊藻作用，但強光照會抑制這種行為的發(fā)生[30]。本試驗也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，最高光照組（10 000 lx）的抑制率在試驗的第3、4 天顯著低于其他光照組，表明過高或過低光照都會影響異養(yǎng)鞭毛蟲抑制微囊藻的能力。

3.3 不同光照度對異養(yǎng)鞭毛蟲攝食銅綠微囊藻作用的影響

Holen發(fā)現(xiàn)鞭毛蟲Poterioochromonas malhamensis的攝食率受光照的影響，光照度與攝食率呈負相關，光照度越高（0～6 250 lx），攝食率越低，黑暗中鞭毛蟲對食物的吞噬率是高光照組的3倍、低光照組的2倍[31]。然而，也有學者提出了相反的結論。郭勝娟等發(fā)現(xiàn)在光照度 0～10 000 lx 范圍內，光照度對鞭毛蟲Peterioochromonas sp.對銅綠微囊藻的攝食率無顯著影響[28]。Zhang等也發(fā)現(xiàn)在持續(xù)光照或黑暗中，鞭毛蟲對食物的攝食率相接近[9]。本試驗結果表明，光照度（0～10 000 lx）對異養(yǎng)鞭毛蟲的攝食率無顯著影響，異養(yǎng)鞭毛蟲對銅綠微囊藻的攝食率高達32～49個/d。

4 結論

綜上所述，由于不同種類的異養(yǎng)鞭毛蟲對光照的適應能力不同，因此光照對不同種類的異養(yǎng)鞭毛蟲生長及其抑制銅綠微囊藻效率的影響也不同。本試驗篩選的鞭毛蟲具有較強的光照耐受能力，既能在黑暗環(huán)境中生存，也能在高光照度中生長及吞噬銅綠微囊藻，在0～10 000 lx光照度范圍內，其生長率達0.94～1.37 d-1，對銅綠微囊藻的攝食率高達 32～49個/d，抑制率達88%～94%。為藍藻水華的控制提供了一種新的原生動物品種。

參考文獻：

[1]Park H D，Sasaki Y，Maruyama T，et al. Degradation of the cyanobacterial hepatotoxin microcystin by a new bacterium isolated from a hypertrophic lake[J]. Environmental Toxicology，2001，16（4）：337-343.

[2]俞順章，趙寧，資曉林，等. 飲水中微囊藻毒素與我國原發(fā)性肝癌關系的研究[J]. 中華腫瘤雜志，2001，23（2）：8-11.

[3]王朝暉，林秋奇，胡韌，等. 廣東省水庫的藍藻污染狀況與水質評價[J]. 熱帶亞熱帶植物學報，2004，12（2）：117-123.

[4]劉正文.湖泊生態(tài)系統(tǒng)恢復與水質改善[J]. 中國水利，2006（17）：30-33.

[5]Nishibe Y，Manage P M，Kawabata Z，et al. Trophic coupling of a testate amoeba and Microcystis species in a hypertrophic pond[J]. Limnology，2004，5（2）：71-76.

[6]Kim B R，Nakano S I，Kim B H，et al. Grazing and growth of the heterotrophic flagellate Diphylleia rotans on the cyanobacterium Microcystis aeruginosa[J]. Aquatic Microbial Ecology，2006，45（2）：163-170.

[7]Mohamed Z A，Al-Shehri A M. Grazing on Microcystis aeruginosa and degradation of microcystins by the heterotrophic flagellate Diphylleia rotans[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2013，96：48-52.

[8]Zhang X，Hu H Y，Men Y J，et al. Feeding characteristics of a golden alga （Poterioochromonas sp.） grazing on toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa[J]. Water Research，2009，43（12）：2953-2960.

[9]Zhang X，Watanabe M M. Grazing and growth of the mixotrophic chrysomonad Poterioochromonas malhamensis（Chrysophyceae） feeding on algae[J]. Journal of Phycology，2001，37（5）：738-743.

[10]閔 智，吳睿若，張 琨，等. 草履蟲對銅綠微囊藻的吞噬能力研究[J]. 中國給水排水，2011，27（13）：63-66.

[11]De K A，Yu J，Houtekamer M，et al. Cyanobacteria as a Carbon source for zooplankton in eutrophic Lake Taihu，China，measured by 13C labeling and fatty acid biomarkers[J]. Limnology and Oceanography，2012，57（4）：1245-1254.

[12]Luo X L Z，Gulati R D. Cyanobacterial Carbon supports the growth and reproduction of Daphnia：an experimental study[J]. Hydrobiologia，2015，743（1）：211-220.

[13]Yu J L，Li Y M，Liu X L，et al. The fate of cyanobacterial detritus in the food web of Lake Taihu：a mesocosm study using 13C and 15N labeling[J]. Hydrobiologia，2013，710（1）：39-46.

[14]Ger K A，Urrutia-Cordero P，F(xiàn)rost P C，et al. The interaction between cyanobacteria and zooplankton in a more eutrophic world[J]. Harmful Algae，2016，54：128-144.

[15]Azam F，F(xiàn)enchel T，F(xiàn)ield J，et al. The ecological role of water-column microbes in the sea[J]. Marine Ecology Progress Series.Oldendorf，1983，10（3）：257-263.

[16]Li J，Li R，and Li J. Current research scenario for microcystins biodegradation-a review on fundamental knowledge，application prospects and challenges [J]. Science of the Total Environment，2017，595：615-632.

[17]李鳳超，曹衛(wèi)榮，康現(xiàn)江. 自由生活的異養(yǎng)鞭毛蟲多樣性及生態(tài)功能[J]. 生態(tài)學報，2009，29（9）：5023-5029.

[18]Daley R J M G，Brown S. Phagotrophic ingestion of a blue-green alga by Ochromonas[J]. The Journal of Protozoology，1973，20（1）：58-61.

[19]Cole G T，Wynne M J. Endocytosis of Microcystis aeruginosa by Ochromonas danica[J]. Journal of Phycology，1974，10（4）：397-410.

[20]Ma M，Gong Y，and Hu Q. Identification and feeding characteristics of the mixotrophic flagellate Poterioochromonas malhamensis，a microalgal predator isolated from outdoor massive Chlorella culture [J]. Algal Research，2018，29：142-153.

[21]Wei C，Wang H，Ma M，et al. Factors affecting the mixotrophic flagellate Poterioochromonas malhamensis grazing on Chlorella cells[J]. The Journal of Eukaryotic Microbiology，2020，67（2）：190-202.

[22]羅曉霞，李長玲，何雪怡，等. 異養(yǎng)鞭毛蟲對銅綠微囊藻的生長影響[J]. 廣東海洋大學學報，2019，39（3）：38-45.

[23]黃凌風，潘 科，郭 豐，等. 我國海洋微型異養(yǎng)鞭毛蟲研究：現(xiàn)狀與展望[J]. 廈門大學學報（自然科學版），2006（S2）：62-67.

[24]Basu B，Pick F. Factors related to heterotrophic bacterial and flagellate abundance in temperate rivers[J]. Aquatic Microbial Ecology，1997，12（2）：123-129.

[25]Rottberger J，Gruber A，Boenigk J，et al. Influence of nutrients and light on autotrophic，mixotrophic and heterotrophic freshwater chrysophytes[J]. Aquatic Microbial Ecology，2013，71（2）：179-191.

[26]Caron D，Sanders R W，Lim E L，et al. Light-dependent phagotrophy in the freshwater mixotrophic chrysophyte Dinobryon cylindricum[J]. Microbial Ecology，1993，25（1）：93-111.

[27]Caron D A P K，Sanders R W. Carbon，Nitrogen，and Phosphorus budgets for the mixotrophic phytoflagellate Poterioochromonas malhamensis （Chrysophyceae） during bacterial ingestion[J]. Limnology and Oceanography，1990，35（2）：433-443.

[28]郭勝娟，甘南琴，鄭凌凌，等. 環(huán)境因子對金藻生長和噬藻速率的影響[J]. 水生生物學報，2010，34（1）：1-8.

[29]Yan C，Li J H，Li J J，et al. A heterotrophic nanoflagellate grazing on the toxic Cyanobacterium Microcystis aeruginosa[J]. Ann. Limnol.-Int. J. Lim.2009，45（1）：23-28.

[30]Skovgaard A. Mixotrophy in Fragilidium subglobosum （Dinophyceae）：growth and grazing responses as functions of light intensity [J]. Marine Ecology Progress Series，1996，143：247-253.

[31]Holen D A. Effects of prey abundance and light intensity on the mixotrophic chrysophyte Poterioochromonas malhamensis from a mesotrophic lake[J]. Freshwater Biology，1999，42（3）：445-455.