沈蘭 王婷婷

摘要：透明質(zhì)酸是一種存在于生物體內(nèi)的大分子聚合物，化學(xué)成分為粘多糖，廣泛存在于動物和人體結(jié)締組織及細(xì)胞外基質(zhì)中，具有特殊的生理作用和極強(qiáng)的保濕能力?？蓮V泛應(yīng)用于醫(yī)藥、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。本文對魷魚眼透明質(zhì)酸的提取方法進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉、等電點(diǎn)法脫蛋白質(zhì)與超濾相結(jié)合的加工工藝，運(yùn)用正交試驗(yàn)法對提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并對產(chǎn)品的質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行了檢驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：透明質(zhì)酸;魷魚眼;提取工藝;鑒定

1 前言

透明質(zhì)酸（Hyaluranic acid，簡稱HA），廣泛存在于動物結(jié)締組織，是一種由β-D-N-乙酰基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸為結(jié)構(gòu)單元以β-1，4-糖苷鍵縮合而成的一種酸性粘多糖，屬于糖胺聚糖。1934年，Meyer 和Palmer [1]從牛眼中最先分離出此種物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸是由相同的二糖單體重復(fù)排列而形成的無支鏈的直鏈多聚物，無定型固體，無臭、無味，溶于水而不溶于有機(jī)溶劑，水溶液比旋度為-70°～80°[2]。

透明質(zhì)酸兼具有高分子和大分子體積的特性，由葡萄糖醛酸-乙酞氨基葡萄糖為雙糖單位組成的直鏈高分子多糖，除了親水性外，透明質(zhì)酸較強(qiáng)的保濕性和粘彈性，在眼科、外科手術(shù)中有特殊的功效和較高的醫(yī)學(xué)臨床價值，。經(jīng)過半個多世紀(jì)的研究，人們對透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生理功能已有了明確的認(rèn)識，其研究領(lǐng)域不斷擴(kuò)展，透明質(zhì)酸已成為細(xì)胞生物、病理、免疫學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。

本研究以魷魚（illex argentinus）加工下腳料--魚眼為原料，研究了魷魚眼透明質(zhì)酸的提取工藝，并對產(chǎn)品的理化性質(zhì)進(jìn)行了初步分析鑒定，使魷魚資源得以合理開發(fā)利用，利于提高其加工的綜合效益及經(jīng)濟(jì)附加值，變廢為寶。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 工藝流程

魷魚眼→預(yù)處理→浸提→鹽析→脫蛋白質(zhì)→離心→濃縮→乙醇沉淀→超濾→干燥→成品

2.2 操作要點(diǎn)

魷魚眼預(yù)處理

將冷凍著的魷魚眼睛放置在實(shí)驗(yàn)容器中溶解。

浸提

準(zhǔn)確稱取50 g魷魚眼置于DS-1型高速組織搗碎機(jī)中進(jìn)行組織搗碎，用去離子水浸提1-3次，將浸提液合并貯存于容器內(nèi)待用。

鹽析

向浸提液中加入去離子水配制成500 mL溶液，再加入5.85 g氯化鈉攪拌至溶解，使其溶液最終NaCl濃度為0.2 mol/L，靜置半小時。

脫蛋白質(zhì)

根據(jù)等電點(diǎn)法除蛋白質(zhì)法，用1：10的稀鹽酸加入溶液中，并輕微攪拌，使溶液pH調(diào)節(jié)至4.0左右，達(dá)到沉淀量最大。

脫蛋白工藝確定：等電點(diǎn)法、三氯乙酸法[4]、Sevage法[4]

離心

脫蛋白的溶液通過DL-5低速大容量離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速5000 r/min，離心時間為45 min，去沉淀取上清液。

濃縮

上清液通過A-1000S水循環(huán)真空泵進(jìn)行真空濃縮，溫度控制在40～50℃最后使溶液濃縮到適宜濃度即可。

乙醇沉淀

在濃縮后的溶液中加入其3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，然后離心取沉淀，復(fù)溶置于容器中。

超濾

用截留分子量為10000 Da的millipore labscale TFF system 超濾膜裝置超濾。

干燥

將超濾后的溶液進(jìn)行冷凍后，通過LGJ-10冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空冷凍干燥得到的白色粉末即為透明質(zhì)酸粉末。

3 透明質(zhì)酸的分析

3.1 理化分析

3.1.1葡萄糖醛酸含量的測定[5]

實(shí)驗(yàn)步驟：

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9、1 mL葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于帶塞試管中，各管加水至1 mL，在冰水浴中各管加入3 mL試劑A，搖勻后，于沸水浴中保持10 min，取出后冷至室溫，各管加0.2 mL試劑B，于沸水浴中保持15 min，取出冰水浴中冷卻。在室溫下，測定光吸收值（530 nm），以濃度對光吸收作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：準(zhǔn)確稱取15.0mg的樣品，定量于50 mL的容量瓶中，取1 mL樣品溶液于帶塞試管中，在冰水浴中各管加入3 mL試劑A，其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線制備操作。由所測得的光吸收值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)葡萄糖醛酸量。

3.1.2 氨基葡萄糖含量的測定[6，7，8]

實(shí)驗(yàn)步驟：

氨基葡萄糖的鑒定

精取樣品加適量4 moL/L鹽酸使成為8 mg/mL封安瓶中于100℃烘箱中水解14 h。取0.75 mL稀釋至10 mL。

低溫乙酰丙酮反應(yīng)：測光吸收（530 nm）為AL。

高溫乙酰丙酮反應(yīng)：測吸光度（530 nm）為AH。

AH/AL≈1，為半乳糖胺 AH/AL﹥1，為葡糖糖胺

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分取鹽酸葡萄糖胺0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL于帶塞試管中，各加水至5mL，加1 mL乙酰丙酮試液（B），置沸水中25 min，用迅速冷卻后，各管加無水乙醇3 mL及對二氨基苯甲醛試液1 mL，強(qiáng)力振搖，20～25 ℃下放置1 h，以0 mL為空白，測吸光度（530 nm）。

樣品測定：取樣品2 mg左右，置50 mL容量瓶中，加6 moL/L鹽酸1.5 mL，沸水浴中水解1 h，冷卻后用NaOH中和至中性，用水稀釋至刻度，取2 mL樣液，加水至5 mL其他操作同上。

3.2 光譜分析

3.2.1紫外光譜分析[9]

樣品配成1 mg/mL透明質(zhì)酸溶液，UV-240紫外可見分光光度計掃描，掃描范圍為190～300 nm。

3.2.2紅外光譜分析[10]

透明質(zhì)酸微量樣品KBr壓片后，用Nicolet Nexus 5DXC FT-IR紅外光譜儀在4000-500 cm-1區(qū)域內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

3.3 透明質(zhì)酸提取率和得率的計算

透明質(zhì)酸提取率=透明質(zhì)酸含量（g）/魷魚眼睛質(zhì)量（g）×100%，以干基（扣除魷魚眼睛原料水含量）計。葡萄糖醛酸測量值除以46.32%[13]，即可得到HA的含量。

透明質(zhì)酸得率=提取的透明質(zhì)酸質(zhì)量（g）/魷魚眼睛質(zhì)量（g）×100%，以干基計。

4 結(jié)果與分析

4.1透明質(zhì)酸提取的正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇浸提次數(shù)、浸提時間、料液比三因素，采用L9（33）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的范圍內(nèi)，最佳方案為A2B3C2，即提取3次，浸提時間3 h，料水比1：6。

在以上得到的優(yōu)化工藝參數(shù)條件下，重復(fù)多次，透明質(zhì)酸的平均提取率為3.58%，。

4.2脫蛋白工藝的確定

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，從魷魚眼睛中提取的透明質(zhì)酸溶液含有較多的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，因此，脫蛋白成為整個提取工藝的關(guān)鍵之處。當(dāng)pH值為4時脫蛋白效果最好，同時，在實(shí)驗(yàn)過程中，也發(fā)現(xiàn)pH值=4時上清液澄清。所以，用等電點(diǎn)法除蛋白質(zhì)，適宜pH值應(yīng)取4。

4.3透明質(zhì)酸的質(zhì)量指標(biāo)

根據(jù)上述工藝，所制備的產(chǎn)品主要為透明質(zhì)酸，每千克魷魚眼睛干原料可獲29.6g產(chǎn)品，產(chǎn)品的總得率達(dá)2.96%，產(chǎn)品純度為72.21%。

4.4紫外光譜分析

從紫外吸收光譜（見圖1）分析得，樣品在201～207 nm有很強(qiáng)的多糖吸收峰，而在280、260 nm處無強(qiáng)烈的吸收峰，說明制品透明質(zhì)酸中蛋白質(zhì)和核酸含量極少。

4.5紅外光譜分析

如圖2的紅外光譜圖譜所示，3407.95 cm-1出現(xiàn)強(qiáng)烈的O-H伸縮振動，表明存在多羥基結(jié)構(gòu);在2922.72 cm-1處出現(xiàn)的-CH伸縮振動，1613.19 cm-1和1409.33 cm-1強(qiáng)銳峰為羧基的反對稱及對稱伸縮振動峰;1409.33 cm-1和1322.42 cm-1有-C-O-的伸縮振動和-OH的彎曲振動偶合產(chǎn)生的兩個吸收峰，表明存在著糖醛酸上解離羧基和多羥基結(jié)構(gòu);1148.79 cm-1、1043.86 cm-1、945.52 cm-1左右的吸收峰為糖的特征吸收峰。以上情況與文獻(xiàn)[11]報道的標(biāo)準(zhǔn)品譜圖相吻合，表明產(chǎn)品樣呈較典型的透明質(zhì)酸紅外光吸收。

5 結(jié)論

魷魚眼睛中透明質(zhì)酸的最佳提取工藝參數(shù)：浸提次數(shù)為3次，浸提時間為3 h，料液比為1：6;等電點(diǎn)除蛋白質(zhì)的最佳pH值為4。在此提取條件下，產(chǎn)品的總得率為2.96%，純度為72.21%。

本實(shí)驗(yàn)采用等電點(diǎn)法脫雜蛋白，操作簡單，污染較少，成本較低，效果較佳。

參考文獻(xiàn)：

[1] Meyer K， Palmer J W. The polysaccharide of the vitreous houmor[J].J Biol Chem，1934，107： 629～633.

[2] 潘紅梅.透明質(zhì)酸的研究現(xiàn)狀綜述[J].四川食品與發(fā)酵，2003，2（1）：5～9.

[3] 閻家麒，賈定武，趙敏.透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌菌種誘變選育及發(fā)酵工藝研究[J].中國醫(yī)藥工業(yè)志，1994，25（4）：145～147.

[4] 虞菊萍，高向東.透明質(zhì)酸精制方法的比較[J].藥學(xué)與臨床研究，2007，15（4）：300～302.

[5] 李薇，佟愛東，鄧兆勇.透明質(zhì)酸化學(xué)定量分析方法的研究[J].中國生化藥物雜志，1994，15（2）：96～99.

[6] 張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1987：283～290.

[7] 肖凱軍，李琳.鯊魚軟骨粘多糖及其分離純化和應(yīng)用[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報， 1999，11（2）：163～169.

[8] 李建武.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M].第二版.北京：北京大學(xué)出版社，1994：125～165.

[9] 羅曼，蔣立科，奚俊.牛眼透明質(zhì)酸的分離及性質(zhì)測定[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1999，26（6）：596～600.

[10] 樊東輝，吳蓓蓓，徐政，等.透明質(zhì)酸鈉的光譜學(xué)分析[J].中國生化藥物雜志，2006，27（01）：22～25.

[11] 史鵬. 發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸下游提取工藝方法的研究[D].西北大學(xué)，2005.

杭州市余杭區(qū)食品藥品監(jiān)測中心 浙江杭州 311199