熊 雷，易 茜，許明芳，陳 健

1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院門診手術(shù)室，重慶 401120；2.重慶佑佑寶貝婦兒醫(yī)院兒內(nèi)科，重慶 401120；3.陸軍特色醫(yī)療中心腫瘤科，重慶 400042

在中國乃至全世界肺癌都是發(fā)病率最高的癌癥，2018年全球新增肺癌病例約210萬例，死亡約176萬例［1-2］。因此，尋找有效的早期檢測和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物對(duì)于肺癌的預(yù)防和治療有著重要的意義［3］。線粒體功能障礙是大多數(shù)腫瘤的特征之一，近年來以線粒體核糖體為靶點(diǎn)治療癌癥已成為研究熱點(diǎn)［4-7］。線粒體核糖體蛋白L12（mitochondrial ribosomal protein L12，MRPL12）是線粒體核糖體39S大亞基的一個(gè)組成蛋白，調(diào)節(jié)核糖體mRNA的翻譯［8］。另外，它還能直接與線粒體RNA聚合酶結(jié)合調(diào)節(jié)線粒體基因表達(dá)，并且與細(xì)胞增殖密切相關(guān)［9-10］。MRPL12蛋白的編碼基因位于染色體17q25［8］，并且此區(qū)域的基因在肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）中轉(zhuǎn)錄普遍增強(qiáng)［11］。關(guān)于MRPL12表達(dá)與癌癥的關(guān)系目前罕見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究主要分析MRPL12在LUAD中的表達(dá)和與預(yù)后的關(guān)系，并探討MRPL12在LUAD中可能參與的生物學(xué)過程，為臨床治療和藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 差異表達(dá)分析

通過腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞分析數(shù)據(jù)庫TIMER2.0（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）的Gene_DE模塊分析癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中MRPL12在腫瘤和相鄰正常組織之間的差異表達(dá)，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)顯著性［12］。再利用GEPIA（gene expression profiling and interactive analyses）交互式網(wǎng)站服務(wù)器（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）驗(yàn)證，差異基因檢驗(yàn)方法選擇方差分析（analysis of variance，ANOVA）［13］。綜 合2個(gè) 分 析 平 臺(tái)，篩 選MRPL12差異表達(dá)可能性高的癌癥類型。

1.2 生存分析

利用Sangerbox生物信息分析平臺(tái)［13］（http：//sangerbox.com/Gene？search1=MRPL12&page=1）對(duì)MRPL12差異表達(dá)的癌癥類型進(jìn)行預(yù)后生存分析，采用Cox回歸模型和Kaplan-Meier生存分析模型2種方法相互印證，并評(píng)估了風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）、95%置信區(qū)間（confidenceinterval，CI）和LogrankP值，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 蛋白表達(dá)分析

在UALCAN數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（http：//ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html）中，根據(jù)患者的樣本類型（sample type）、腫瘤分級(jí)（tumor grade）、腫瘤分期（individual cancer stage）分析MRPL12的蛋白表達(dá)［14］，差異評(píng)估方法采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 相關(guān)基因篩選

LinkedOmics（http：//www.linkedomics.org/admin.php）能在線分析32種癌癥的多組學(xué)數(shù)據(jù)［15］?；赥CGA_LUAD數(shù)據(jù)集，利用LinkedOmics分析與MRPL12表達(dá)呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因。統(tǒng)計(jì)方法選擇Pearson相關(guān)性分析，以相關(guān)系數(shù)和P值衡量相關(guān)性，P<0.05表示結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 KEGG通路富集分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）對(duì)與MRPL12表達(dá)呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的前1 000個(gè)基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析［16］。P<0.05表示相關(guān)的通路有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)和定量聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均購自上海酶研生物科技有限公司，并已通過短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）鑒定。人正常肺上皮細(xì)胞Beas-2B用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。人LUAD細(xì)胞（H1395、H1975、PC-9和HCC827）用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。收集處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA濃度和純度，GoScript Reverse Transcription System試劑盒對(duì)提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計(jì)算MRPL12的相對(duì)表達(dá)量。定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative PCR，qPCR）引物如下：5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′和5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCATG-3′（GAPDH）；5′-TGTGGGGGCCTTGCCTTGGGCTT-3′和5′-ATGGCCGC TGCTCCTCATATGTCGCA-3′（MRPL12）。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRPL12的mRNA表達(dá)水平

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中惡性腫瘤的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequence，RNA-seq）數(shù)據(jù)，我們研究了MRPL12在不同惡性腫瘤和正常組織中的表達(dá)水平。綜合TIMER和GEPIA的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，MRPL12在以下6種癌癥類型中顯著高表達(dá)（圖1）：膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）、宮頸鱗狀細(xì)胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CESC）、結(jié) 腸 腺 癌（colon adenocarcinoma，COAD）、LUAD、肺鱗狀細(xì)胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）。

圖1 MRPL12在不同癌癥中的轉(zhuǎn)錄水平Fig.Expression levelsof MRPL12 in different cancers

2.2 MRPL12對(duì)LUAD患者生存的影響

根據(jù)惡性腫瘤組織中MRPL12的mRNA表達(dá)的差異，我們進(jìn)一步分析了這些組織中MRPL12表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。通過Cox回歸模型分析MRPL12與這6種癌癥預(yù)后的關(guān)系，在LUAD中MRPL12表達(dá)變化與預(yù)后總體生存期（overall suivival，OS）和疾病特異性生存期（disease-specific survival，DSS）的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A、B）。Kaplan-Meier曲線與Cox回歸分析結(jié)果一致，LUAD患者M(jìn)RPL12高表達(dá)組的OS以及DSS均較低（圖2C、D）。MRPL12的表達(dá)與BLCA、CESC、COAD、LUSC、UCEC患者OS和DSS的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 LUAD患者M(jìn)RPL12表達(dá)與OS和DSS的關(guān)系Fig 2 Relationship between MRPL12 expression and OSand DSSin LUAD patients

2.3 MRPL12的蛋白表達(dá)水平

為了驗(yàn)證MRPL12在LUAD組織中的蛋白表達(dá)水平及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，我們從UALCAN數(shù)據(jù)分析平臺(tái)下載美國臨床蛋白質(zhì)組腫瘤分析協(xié)會(huì)（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC）的蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：MRPL12在LUAD組織中的蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組織（圖3A）；腫瘤分級(jí)越高，MRPL12蛋白表達(dá)水平越高（圖3B）；不同腫瘤分期的MRPL12蛋白表達(dá)水平也均顯著高于正常組織（圖3C）。

圖3 LUAD組織中MRPL12的蛋白表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Fig 3 Relationship between protein expression of MRPL12 and clinicopathological parametersin LUAD tissues

2.4 MRPL12相關(guān)基因分析

通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析LUAD組織中與MRPL12表達(dá)相關(guān)的基因，以P<0.01、r>0.4或r<-0.4為界限，共檢索到1 091個(gè)正相關(guān)基因和1 126個(gè)負(fù)相關(guān)基因（圖4A）。MRPL12的表達(dá)與MYC結(jié)合蛋白2（MYC binding protein 2，MYCBP2）呈負(fù)相關(guān)（r=-0.695，P=0.000，圖4B），與ANAPC11（anaphase-promoting complex subunit 11）呈 正 相 關(guān)（r=0.840，P=0.000，圖4C）。為了分析MRPL12的功能，我們用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG通路富集分析。其中，與MRPL12表達(dá)負(fù)相關(guān)的基因富集到癌癥通路（P=0.000）、癌癥蛋白聚糖（P=0.000）、非小細(xì)胞肺癌（P=0.000）等癌癥相關(guān)的通路（圖5），與MRPL12表達(dá)正相關(guān)的基因KEGG通路富集分析結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 基于Linked Omics數(shù)據(jù)庫的LUAD組織MRPL12相關(guān)基因分析Fig 4 MRPL12 co-expression genes in LUAD tissuesbased on LinkedOmicsdatabase

圖5 LUAD組織中與MRPL12負(fù)相關(guān)基因的KEGG通路富集分析Fig 5 KEGG enrichment analysis of MRPL12-negatively-correlated genesin LUAD tissues

2.5 qPCR驗(yàn)證MRPL12在細(xì)胞中的表達(dá)

利用qPCR方法檢測MRPL12在人正常肺上皮細(xì)胞（Beas-2B）和人LUAD細(xì)胞（H1395、H1975、PC-9和HCC827）中的表達(dá)。結(jié)果顯示（圖6），MRPL12在LUAD細(xì)胞（H1395、H1975和HCC827）中的mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于正常細(xì)胞（Beas-2B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 MRPL12在細(xì)胞系中的mRNA表達(dá)水平Fig 6 ThemRNA expression levels of MRPL12 in cell lines

3 討論

肺癌最常見的亞型是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC），NSCLC又分為鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌和腺癌，臨床上約50%的肺癌患者被診斷為LUAD［17］。由于大多數(shù)患者都是在癌癥晚期被診斷出來，經(jīng)過手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療（化療）等綜合治療后，其5年生存率也很難超過15%［18-19］。近年來，新的分子靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，推動(dòng)了靶向治療和免疫治療等新療法的發(fā)展。NSCLC亞型的治療進(jìn)展很大程度上得益于下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)對(duì)分子知識(shí)的積累。例如，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶在62%的NSCLC中過表達(dá)，并且與較差的預(yù)后相關(guān)。以奧斯替尼（osimertinib）為代表的EGFR靶向抑制劑已在晚期NSCLC患者的治療中占據(jù)重要地位，奧斯替尼將患者的中位無進(jìn)展生存期（median progression-free survival，mPFS）延長到了18.9個(gè)月［20］。另外，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）在2017年批準(zhǔn)間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）抑制劑色瑞替尼（ceritinib）用于治療ALK陽性的轉(zhuǎn)移NSCLC患者，治療客觀緩解率達(dá)到73%，是傳統(tǒng)化療的2倍以上［21］。因此，治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)對(duì)藥物開發(fā)和肺癌治療具有重要作用。使用高通量測序的全基因組分子研究，將基因的表達(dá)、突變、重排等特征與臨床樣本的病理參數(shù)結(jié)合將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的癌癥生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。TCGA數(shù)據(jù)庫收錄了人類各種癌癥及其亞型的基因組變異、mRNA表達(dá)、miRNA表達(dá)、甲基化和臨床數(shù)據(jù)，是癌癥研究很重要的數(shù)據(jù)來源。我們根據(jù)TCGA的LUAD數(shù)據(jù)集評(píng)估了MRPL12的表達(dá)和對(duì)預(yù)后生存的影響，提出MRPL12是潛在的LUAD預(yù)后的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

MRPL12是由核基因編碼的一種MRPs，被認(rèn)為是線粒體mRNA翻譯的調(diào)節(jié)因子［9，22］。哺乳動(dòng)物線粒體核糖體由28S小亞基和39S大亞基組成，大小亞基分別包含29個(gè)MRPs和50個(gè)MRPs［6，23］。據(jù)報(bào)道［6］，部分MRPs可能在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮功能性作用。由于線粒體和細(xì)菌核糖體相似，利用阿奇霉素（azithromycin）和強(qiáng)力霉素（doxycycline）等抗生素靶向線粒體核糖體在多種癌癥中表現(xiàn)出抑制腫瘤球形成的作用［24］。其中，阿奇霉素直接與細(xì)菌核糖體的50S亞基結(jié)合，并特異性抑制線粒體mRNA翻譯，而50S的細(xì)菌核糖體與39S的線粒體核糖體同源，這證明了靶向線粒體核糖體可能是對(duì)抗特定腫瘤的一種新方法。MRPL12基因編碼線粒體核糖體39S大亞基的一個(gè)組成蛋白，與葉綠體和細(xì)菌的L12核糖體蛋白同源［25］。MRPL12除了調(diào)控線粒體mRNA翻譯的功能，還被證實(shí)直接綁定并激活線粒體RNA聚合酶（mitochondrial RNA polymerase，POLRMT），因此其在線粒體轉(zhuǎn)錄和翻譯中都發(fā)揮了作用［26］。MRPL12突變導(dǎo)致成纖維細(xì)胞生長阻滯，線粒體翻譯缺陷，環(huán)氧化酶1（cyclooxygenase-1，COX-1）、COX-2和COX-3合成顯著減少［10］。在乳腺癌細(xì)胞中，MRPL12、DNA聚合酶γ（DNA polymerase gamma，POLG）和核糖核酸酶H1（ribonuclease H1，RNASEH1）上調(diào)可能導(dǎo)致線粒體增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖［27］。然而，MRPL12與其他癌癥的關(guān)系還沒有研究報(bào)道，具體機(jī)制尚不清楚。

LUAD組織和正常組織中MRPL12表達(dá)量比較分析發(fā)現(xiàn)，MRPL12在LUAD組織中明顯高表達(dá)，提示MRPL12可能是LUAD中的一個(gè)重要的促癌基因。進(jìn)一步分析MRPL12蛋白與LUAD患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果表明MRPL12表達(dá)水平與LUAD分期以及分級(jí)呈正相關(guān)，說明腫瘤分化和擴(kuò)散程度越高，MRPL12表達(dá)水平越高。另外，Cox回歸和Kaplan-Meier 2種生存分析都表明，MRPL12高表達(dá)的LUAD患者預(yù)后OS和DSS都較差。綜合以上結(jié)果表明，MRPL12基因高表達(dá)可能是LUAD預(yù)后的一種不利因素。為了進(jìn)一步探索MRPL12在LUAD中可能的作用機(jī)制，我們通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析與MRPL12密切相關(guān)的基因，并分為正相關(guān)和負(fù)相關(guān)2組。有趣的是，與MRPL12呈負(fù)相關(guān)，并且相關(guān)性較高的基因富集到許多癌癥相關(guān)的通路，直接和NSCLC相關(guān)的通路也在其中，更加確認(rèn)了MRPL12與LUAD的相關(guān)性。值得注意的是，MYCBP2是與MRPL12負(fù)相關(guān)最顯著的基因（r=-0.695，P=0.000）。MYCBP2可能是一個(gè)E3泛素連接酶，特異性地與MYC原癌基因（MYC proto-oncogene，MYC）蛋白結(jié)合，促進(jìn)MYC降解［28-29］。MYC癌基因家族的激活或擴(kuò)增是癌癥的特征之一［30］。我們可以假設(shè)MRPL12的高表達(dá)抑制MYCBP2，從而使MYC累積，促進(jìn)癌癥發(fā)展，這將是我們下一步需要驗(yàn)證的問題。

本研究主要通過TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析MRPL12在LUAD中的表達(dá)及臨床意義，提出MRPL12基因具有作為LUAD臨床預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)的潛力，并且初步探討了MRPL12在LUAD中可能的分子機(jī)制與信號(hào)通路。本研究結(jié)果為下一步細(xì)胞和動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。

參·考·文·獻(xiàn)

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