陳 盛，嚴(yán)志龍，吳曄明，徐 敏，顧 松，馬 靖

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心普外科，上海 2 0 0 1 2 7；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院兒外科，上海 200092；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心病理科，上海 200127

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）源于交感神經(jīng)節(jié)的原始神經(jīng)嵴細(xì)胞，是最常見的兒童惡性實(shí)體腫瘤之一。雖然有手術(shù)、化學(xué)治療（化療）、放射治療（放療）、自身造血干細(xì)胞移植等多種治療方式，但由于進(jìn)展期NB具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、預(yù)后較差的特點(diǎn)，治療效果均不理想。據(jù)文獻(xiàn)［1-2］報(bào)道，國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤分期系統(tǒng)（International Neuroblastoma Staging System，INSS）3期的NB患兒5年生存率約為50%，4期NB的5年生存率僅為20%。因此，尋找NB發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，對(duì)提高該病的療效、判斷其預(yù)后具有重要意義。

實(shí)體腫瘤快速生長(zhǎng)，而腫瘤滋養(yǎng)血管生長(zhǎng)速度相對(duì)落后，并可能存在血管畸形，因此，腫瘤內(nèi)部存在血液供應(yīng)不足、缺氧是典型的微環(huán)境特征［3-4］。已知低氧導(dǎo)致NB具有更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，也使得NB細(xì)胞去分化，具備腫瘤干細(xì)胞特征，對(duì)放療、化療有更強(qiáng)的耐受性［5-6］。在缺氧過程中，NB的低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表達(dá)增加，HIF-1α在NB細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境、惡性程度增加的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7-8］。本課題組前期研究［7］首先發(fā)現(xiàn)，NB細(xì)胞中HIF-1α通過激活下游的音猬因子（sonic hedgehog，SHH）信號(hào)通路，促進(jìn)NB細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究通過測(cè)定HIF-1α/SHH通路在NB中的表達(dá)，報(bào)道該信號(hào)通路與NB臨床特征的聯(lián)系，以及對(duì)其預(yù)后的提示意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2009年1月—2014年12月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院住院行NB切除術(shù)，手術(shù)年齡為0～18歲的兒童患者作為研究對(duì)象，在2家醫(yī)院的病理科調(diào)取NB石蠟切片。并選擇相同時(shí)間段和年齡段、接受節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤（ganglioneuroma，GN）切除術(shù)的患兒作為對(duì)照組，同樣調(diào)取其石蠟切片。NB患兒共101例，其中男性53例，女性48例；中位年齡為3歲（4個(gè)月～10歲）；收集相關(guān)病史資料進(jìn)行回顧性分析。GN患兒共20例，其中男性8例，女性12例；中位年齡為10歲（4～17歲）。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)分別為SCMCIRB-K2017024、XHEC-D-2036）。

1.2 主要試劑

免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)所需的HIF-1α一抗（工作濃度1∶200）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，SHH一抗（工作濃度1∶200）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（工作濃度1∶100）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

采用免疫組織化學(xué)SP（streptavdin-peroxidase）法進(jìn)行染色，在NB和GN石蠟切片中檢測(cè)HIF-1α和SHH蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟如參考文獻(xiàn)［9］所述。

切片由2位病理科醫(yī)師盲法閱片，對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行半定量評(píng)分，如有意見不同則協(xié)商討論達(dá)成一致。每張石蠟切片隨機(jī)選5個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。按照細(xì)胞著色百分比和著色強(qiáng)度分別評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如參考文獻(xiàn)［10］所述：著色細(xì)胞≤5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分；細(xì)胞無著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。2種分值的乘積為最終得分，≥6分為高表達(dá)，<6分為低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以中位數(shù)（全距）表示；定性資料以頻數(shù)（百分比）表示，采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)HIF-1α和SHH在NB中的表達(dá)水平進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，采用Kaplan-Meier生存分析法進(jìn)行預(yù)后分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NB患兒的一般信息

將101例NB患兒按INSS分期標(biāo)準(zhǔn)，分為1期患者20例、2期患者23例、3期患者22例、4期患者36例（包括4s期4例）。腫瘤原發(fā)部位位于腎上腺49例、后腹膜39例、后縱隔12例、頸部1例。所有患兒均接受NB完全或部分切除術(shù)，61例術(shù)后接受正規(guī)化療，其中8例接受自體干細(xì)胞移植。有5例因家庭原因或經(jīng)濟(jì)原因術(shù)后未接受或未完成正規(guī)化療，均死亡。22例死于腫瘤進(jìn)展或復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，3例死于化療后嚴(yán)重感染，失訪9例。去除失訪病例，本組病例5年總體生存（overall survival，OS）率為67.4%，5年無事件生存（event-free survival，EFS）率為62.0%。其中1期NB患兒OS率和EFS率均為100%，2期NB患兒OS率和EFS率均為95.7%，3期NB患兒OS率和EFS率分別為59.1%、45.5%，4期NB患兒OS率和EFS率分別為37.5%、31.2%。

2.2 HIF-1α、SHH在NB和GN中的表達(dá)差異

免疫組織化學(xué)顯示HIF-1α表達(dá)于細(xì)胞核，SHH表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)（圖1）。HIF-1α在27例（26.7%）NB患兒中高表達(dá)，在74例（73.3%）例患兒中低表達(dá)；SHH在33例（32.7%）NB患兒中高表達(dá)，在68例（67.3%）例患兒中低表達(dá)；在GN中，只有1例高表達(dá)HIF-1α（5.0%），2例高表達(dá)SHH（10.0%）（表1、圖1）。因此，HIF-1α、SHH在NB中的表達(dá)率高于GN，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。Spearman相關(guān)分析顯示，101例NB中HIF-1α、SHH表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（r=0.41，P=0.000）。

表1 HIF-1α、SHH在NB和GN中的表達(dá)水平Tab 1 Expression levels of HIF-1αand SHH in NBs and GNs

2.3 HIF-1α、SHH表達(dá)水平和NB臨床病理特征的關(guān)系

3、4期NB中HIF-1α、SHH的高表達(dá)患者比例高于1、2期NB，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HIF-1α：38.6%vs11.4%，P=0.002；SHH：42.1%vs20.5%，P=0.021）（圖1、表2）。病理分類為組織分化不良型（unfavorable histology，UFH）NB中HIF-1α、SHH的高表達(dá)患者比例也高于組織分化良好型（favorable histology，F(xiàn)H）NB，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HIF-1α：37.0%vs14.9%，P=0.012；SHH：44.4%vs19.1%，P=0.007）（圖1、表2）。此外，HIF-1α、SHH的高表達(dá)也與局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（HIF-1α：36.2%vs14.0%，P=0.012；SHH：46.6%vs14.0%，P=0.001），而與年齡、性別、MYCN proto-oncogene（MYCN）基因擴(kuò)增、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)（均P>0.05）（表2）。

表2 HIF-1α、SHH表達(dá)水平和NB患兒臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between expression levels of HIF-1α/SHH and clinicopathological characteristics of NB patients

圖1 HIF-1α、SHH在GN和NB中的典型表達(dá)Fig 1 Typical expression of HIF-1αand SHH in GN and NB

2.4 HIF-1α、SHH表達(dá)水平和NB預(yù)后相關(guān)

去除失訪病例，92例NB患兒中位隨訪時(shí)間為7.1年（5.1年～11.4年）。Kaplan-Meier生存分析顯示，HIF-1α高表達(dá)組的5年OS率和EFS率均低于HIF-1α低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OS率：40.9%vs75.7%，P=0.001；EFS率：40.9%vs70.0%，P=0.008）（圖2）。SHH高表達(dá)組的5年OS率、EFS率也同樣低于SHH低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OS率：42.9%vs78.1%，P=0.000；EFS率：39.3%vs73.4%，P=0.001）（圖2）。

圖2 NB患兒中HIF-1α、SHH的表達(dá)水平和預(yù)后的關(guān)系Fig 2 Relationship between theexpression levels of HIF-1α/SHH and theprognosis in NBpatients

3 討論

腫瘤微環(huán)境中，低氧通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、凋亡、黏附、代謝、血管生成等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使腫瘤細(xì)胞增殖性、耐藥性、侵襲力增加［11-12］。HIF-1是細(xì)胞在低氧下調(diào)節(jié)生理功能的重要轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)與氧氣輸送、利用，以及葡萄糖代謝有關(guān)的1 000多種人類基因的表達(dá)［13-14］。HIF-1是一個(gè)異二聚體，由氧調(diào)節(jié)性表達(dá)的α-亞基和組成性表達(dá)的β-亞基構(gòu)成。常氧下α-亞基中的2個(gè)關(guān)鍵脯氨酸殘基會(huì)被羥化，在von Hippel-Lindau腫瘤抑制蛋白的作用下，HIF-1α被泛素化，隨后被蛋白酶體降解；低氧下α-亞基的降解被阻斷，其表達(dá)升高，并促進(jìn)下游靶基因轉(zhuǎn)錄［13-14］。有文獻(xiàn)［7，15-16］報(bào)道，在包括NB在內(nèi)的一些惡性腫瘤中，HIF-1α高表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞的惡性程度，促進(jìn)其生長(zhǎng)侵襲，并提示不良預(yù)后。

SHH信號(hào)通路在胚胎發(fā)育和組織分化中起到重要作用，但是該通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，有產(chǎn)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)［17］。研究［18］證明，NB中該信號(hào)通路存在異常激活，阻斷該通路后可有效抑制NB生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡，降低MYCN的表達(dá)水平。本課題組前期研究［7］發(fā)現(xiàn)，在NB中HIF-1α可正向調(diào)控SHH信號(hào)通路，通過激活該通路實(shí)現(xiàn)HIF-1α促NB生長(zhǎng)的效應(yīng)。本研究在較大樣本量的NB病例中測(cè)定HIF-1α/SHH信號(hào)通路的表達(dá)，并將其和患者的臨床特征、遠(yuǎn)期預(yù)后相聯(lián)系，探索該通路的臨床意義。

HIF-1α在NB中的作用仍有爭(zhēng)議。Dungwa等［19］發(fā)現(xiàn)NB中HIF-1α高表達(dá)與高的INSS分期、UFH病理類型、高危分組等臨床特征密切相關(guān)，并提示患兒的不良預(yù)后。但也有研究［20］結(jié)論與之相反，即HIF-1α高表達(dá)的NB患兒傾向于有更低的INSS分期、更高的5年OS率。GN同樣起源于交感神經(jīng)節(jié)的原始神經(jīng)嵴細(xì)胞，和NB是同一家族的腫瘤，但GN組織分化成熟，是良性腫瘤。本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α、SHH在GN中均低表達(dá)，而在NB中表達(dá)升高，尤其在進(jìn)展期NB中表達(dá)更高；說明HIF-1α/SHH信號(hào)通路激活和NB的惡性表型相關(guān)，也可能在NB的發(fā)生、發(fā)展以及組織分化中起到重要作用。3、4期以及UFH型NB的HIF-1α、SHH表達(dá)水平高于1、2期以及FH型NB，有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NB中HIF-1α、SHH表達(dá)水平同樣升高，這進(jìn)一步說明HIF-1α/SHH信號(hào)通路激活可能是NB進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、去分化的分子機(jī)制。在本研究中，NB的HIF-1α和SHH表達(dá)水平呈正相關(guān)，也證實(shí)HIF-1α對(duì)SHH通路的正向調(diào)控作用。我們也發(fā)現(xiàn)HIF-1α、SHH高表達(dá)組的5年OS率、EFS率均降低，提示HIF-1α/SHH信號(hào)通路激活可能預(yù)示NB患兒的不良預(yù)后，可作為年齡、分期、MYCN基因擴(kuò)增、病理類型等已知的NB預(yù)后因素的補(bǔ)充條件，進(jìn)一步增加判斷NB預(yù)后的準(zhǔn)確性。

原癌基因MYCN擴(kuò)增在促進(jìn)NB生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等方面發(fā)揮重要作用，強(qiáng)烈提示NB的不良預(yù)后［21-22］。MYCN在NB中的擴(kuò)增率為10%～25%，在進(jìn)展期NB中擴(kuò)增率更高［23］。HIF-1α/SHH信號(hào)通路和MYCN擴(kuò)增之間的關(guān)系尚不明確，需進(jìn)一步研究。本研究中MYCN的擴(kuò)增率為11.9%（12/101），我們未發(fā)現(xiàn)MYCN擴(kuò)增組和非擴(kuò)增組之間HIF-1α和SHH的表達(dá)差異，無法提示HIF-1α/SHH信號(hào)通路和MYCN之間的調(diào)控關(guān)系，這也可能和NB中MYCN的擴(kuò)增率較低有關(guān)。

綜上所述，HIF-1α、SHH表達(dá)升高和NB高的INSS分期、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UFH病理分型等臨床特征密切相關(guān)，并預(yù)示NB患兒的不良預(yù)后。因此，HIF-1α/SHH信號(hào)通路激活可能在NB發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，該信號(hào)通路可能是NB潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

參·考·文·獻(xiàn)

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