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        HIF-1α/SHH信號(hào)通路在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義

        2021-09-09 08:09:48嚴(yán)志龍吳曄明
        關(guān)鍵詞:信號(hào)研究

        陳 盛,嚴(yán)志龍,吳曄明,徐 敏,顧 松,馬 靖

        1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心普外科,上海 2 0 0 1 2 7;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院兒外科,上海 200092;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心病理科,上海 200127

        神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)源于交感神經(jīng)節(jié)的原始神經(jīng)嵴細(xì)胞,是最常見的兒童惡性實(shí)體腫瘤之一。雖然有手術(shù)、化學(xué)治療(化療)、放射治療(放療)、自身造血干細(xì)胞移植等多種治療方式,但由于進(jìn)展期NB具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、預(yù)后較差的特點(diǎn),治療效果均不理想。據(jù)文獻(xiàn)[1-2]報(bào)道,國(guó)際神經(jīng)母細(xì)胞瘤分期系統(tǒng)(International Neuroblastoma Staging System,INSS)3期的NB患兒5年生存率約為50%,4期NB的5年生存率僅為20%。因此,尋找NB發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵分子靶點(diǎn),對(duì)提高該病的療效、判斷其預(yù)后具有重要意義。

        實(shí)體腫瘤快速生長(zhǎng),而腫瘤滋養(yǎng)血管生長(zhǎng)速度相對(duì)落后,并可能存在血管畸形,因此,腫瘤內(nèi)部存在血液供應(yīng)不足、缺氧是典型的微環(huán)境特征[3-4]。已知低氧導(dǎo)致NB具有更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力,也使得NB細(xì)胞去分化,具備腫瘤干細(xì)胞特征,對(duì)放療、化療有更強(qiáng)的耐受性[5-6]。在缺氧過程中,NB的低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表達(dá)增加,HIF-1α在NB細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境、惡性程度增加的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7-8]。本課題組前期研究[7]首先發(fā)現(xiàn),NB細(xì)胞中HIF-1α通過激活下游的音猬因子(sonic hedgehog,SHH)信號(hào)通路,促進(jìn)NB細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲。在前期研究的基礎(chǔ)上,本研究通過測(cè)定HIF-1α/SHH通路在NB中的表達(dá),報(bào)道該信號(hào)通路與NB臨床特征的聯(lián)系,以及對(duì)其預(yù)后的提示意義。

        1 對(duì)象與方法

        1.1 研究對(duì)象

        選擇2009年1月—2014年12月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院住院行NB切除術(shù),手術(shù)年齡為0~18歲的兒童患者作為研究對(duì)象,在2家醫(yī)院的病理科調(diào)取NB石蠟切片。并選擇相同時(shí)間段和年齡段、接受節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤(ganglioneuroma,GN)切除術(shù)的患兒作為對(duì)照組,同樣調(diào)取其石蠟切片。NB患兒共101例,其中男性53例,女性48例;中位年齡為3歲(4個(gè)月~10歲);收集相關(guān)病史資料進(jìn)行回顧性分析。GN患兒共20例,其中男性8例,女性12例;中位年齡為10歲(4~17歲)。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)分別為SCMCIRB-K2017024、XHEC-D-2036)。

        1.2 主要試劑

        免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)所需的HIF-1α一抗(工作濃度1∶200)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,SHH一抗(工作濃度1∶200)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(工作濃度1∶100)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

        1.3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

        采用免疫組織化學(xué)SP(streptavdin-peroxidase)法進(jìn)行染色,在NB和GN石蠟切片中檢測(cè)HIF-1α和SHH蛋白表達(dá),實(shí)驗(yàn)步驟如參考文獻(xiàn)[9]所述。

        切片由2位病理科醫(yī)師盲法閱片,對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行半定量評(píng)分,如有意見不同則協(xié)商討論達(dá)成一致。每張石蠟切片隨機(jī)選5個(gè)高倍視野(×400),每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。按照細(xì)胞著色百分比和著色強(qiáng)度分別評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如參考文獻(xiàn)[10]所述:著色細(xì)胞≤5%計(jì)0分,6%~25%計(jì)1分,26%~50%計(jì)2分,51%~75%計(jì)3分,>75%計(jì)4分;細(xì)胞無著色計(jì)0分,淡黃色計(jì)1分,黃色計(jì)2分,棕褐色計(jì)3分。2種分值的乘積為最終得分,≥6分為高表達(dá),<6分為低表達(dá)。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以中位數(shù)(全距)表示;定性資料以頻數(shù)(百分比)表示,采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)HIF-1α和SHH在NB中的表達(dá)水平進(jìn)行Spearman相關(guān)分析,采用Kaplan-Meier生存分析法進(jìn)行預(yù)后分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 NB患兒的一般信息

        將101例NB患兒按INSS分期標(biāo)準(zhǔn),分為1期患者20例、2期患者23例、3期患者22例、4期患者36例(包括4s期4例)。腫瘤原發(fā)部位位于腎上腺49例、后腹膜39例、后縱隔12例、頸部1例。所有患兒均接受NB完全或部分切除術(shù),61例術(shù)后接受正規(guī)化療,其中8例接受自體干細(xì)胞移植。有5例因家庭原因或經(jīng)濟(jì)原因術(shù)后未接受或未完成正規(guī)化療,均死亡。22例死于腫瘤進(jìn)展或復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,3例死于化療后嚴(yán)重感染,失訪9例。去除失訪病例,本組病例5年總體生存(overall survival,OS)率為67.4%,5年無事件生存(event-free survival,EFS)率為62.0%。其中1期NB患兒OS率和EFS率均為100%,2期NB患兒OS率和EFS率均為95.7%,3期NB患兒OS率和EFS率分別為59.1%、45.5%,4期NB患兒OS率和EFS率分別為37.5%、31.2%。

        2.2 HIF-1α、SHH在NB和GN中的表達(dá)差異

        免疫組織化學(xué)顯示HIF-1α表達(dá)于細(xì)胞核,SHH表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)(圖1)。HIF-1α在27例(26.7%)NB患兒中高表達(dá),在74例(73.3%)例患兒中低表達(dá);SHH在33例(32.7%)NB患兒中高表達(dá),在68例(67.3%)例患兒中低表達(dá);在GN中,只有1例高表達(dá)HIF-1α(5.0%),2例高表達(dá)SHH(10.0%)(表1、圖1)。因此,HIF-1α、SHH在NB中的表達(dá)率高于GN,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。Spearman相關(guān)分析顯示,101例NB中HIF-1α、SHH表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.41,P=0.000)。

        表1 HIF-1α、SHH在NB和GN中的表達(dá)水平Tab 1 Expression levels of HIF-1αand SHH in NBs and GNs

        2.3 HIF-1α、SHH表達(dá)水平和NB臨床病理特征的關(guān)系

        3、4期NB中HIF-1α、SHH的高表達(dá)患者比例高于1、2期NB,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HIF-1α:38.6%vs11.4%,P=0.002;SHH:42.1%vs20.5%,P=0.021)(圖1、表2)。病理分類為組織分化不良型(unfavorable histology,UFH)NB中HIF-1α、SHH的高表達(dá)患者比例也高于組織分化良好型(favorable histology,F(xiàn)H)NB,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HIF-1α:37.0%vs14.9%,P=0.012;SHH:44.4%vs19.1%,P=0.007)(圖1、表2)。此外,HIF-1α、SHH的高表達(dá)也與局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(HIF-1α:36.2%vs14.0%,P=0.012;SHH:46.6%vs14.0%,P=0.001),而與年齡、性別、MYCN proto-oncogene(MYCN)基因擴(kuò)增、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)(均P>0.05)(表2)。

        表2 HIF-1α、SHH表達(dá)水平和NB患兒臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between expression levels of HIF-1α/SHH and clinicopathological characteristics of NB patients

        圖1 HIF-1α、SHH在GN和NB中的典型表達(dá)Fig 1 Typical expression of HIF-1αand SHH in GN and NB

        2.4 HIF-1α、SHH表達(dá)水平和NB預(yù)后相關(guān)

        去除失訪病例,92例NB患兒中位隨訪時(shí)間為7.1年(5.1年~11.4年)。Kaplan-Meier生存分析顯示,HIF-1α高表達(dá)組的5年OS率和EFS率均低于HIF-1α低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OS率:40.9%vs75.7%,P=0.001;EFS率:40.9%vs70.0%,P=0.008)(圖2)。SHH高表達(dá)組的5年OS率、EFS率也同樣低于SHH低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OS率:42.9%vs78.1%,P=0.000;EFS率:39.3%vs73.4%,P=0.001)(圖2)。

        圖2 NB患兒中HIF-1α、SHH的表達(dá)水平和預(yù)后的關(guān)系Fig 2 Relationship between theexpression levels of HIF-1α/SHH and theprognosis in NBpatients

        3 討論

        腫瘤微環(huán)境中,低氧通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、凋亡、黏附、代謝、血管生成等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,使腫瘤細(xì)胞增殖性、耐藥性、侵襲力增加[11-12]。HIF-1是細(xì)胞在低氧下調(diào)節(jié)生理功能的重要轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)與氧氣輸送、利用,以及葡萄糖代謝有關(guān)的1 000多種人類基因的表達(dá)[13-14]。HIF-1是一個(gè)異二聚體,由氧調(diào)節(jié)性表達(dá)的α-亞基和組成性表達(dá)的β-亞基構(gòu)成。常氧下α-亞基中的2個(gè)關(guān)鍵脯氨酸殘基會(huì)被羥化,在von Hippel-Lindau腫瘤抑制蛋白的作用下,HIF-1α被泛素化,隨后被蛋白酶體降解;低氧下α-亞基的降解被阻斷,其表達(dá)升高,并促進(jìn)下游靶基因轉(zhuǎn)錄[13-14]。有文獻(xiàn)[7,15-16]報(bào)道,在包括NB在內(nèi)的一些惡性腫瘤中,HIF-1α高表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞的惡性程度,促進(jìn)其生長(zhǎng)侵襲,并提示不良預(yù)后。

        SHH信號(hào)通路在胚胎發(fā)育和組織分化中起到重要作用,但是該通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖,有產(chǎn)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[17]。研究[18]證明,NB中該信號(hào)通路存在異常激活,阻斷該通路后可有效抑制NB生長(zhǎng),促進(jìn)凋亡,降低MYCN的表達(dá)水平。本課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn),在NB中HIF-1α可正向調(diào)控SHH信號(hào)通路,通過激活該通路實(shí)現(xiàn)HIF-1α促NB生長(zhǎng)的效應(yīng)。本研究在較大樣本量的NB病例中測(cè)定HIF-1α/SHH信號(hào)通路的表達(dá),并將其和患者的臨床特征、遠(yuǎn)期預(yù)后相聯(lián)系,探索該通路的臨床意義。

        HIF-1α在NB中的作用仍有爭(zhēng)議。Dungwa等[19]發(fā)現(xiàn)NB中HIF-1α高表達(dá)與高的INSS分期、UFH病理類型、高危分組等臨床特征密切相關(guān),并提示患兒的不良預(yù)后。但也有研究[20]結(jié)論與之相反,即HIF-1α高表達(dá)的NB患兒傾向于有更低的INSS分期、更高的5年OS率。GN同樣起源于交感神經(jīng)節(jié)的原始神經(jīng)嵴細(xì)胞,和NB是同一家族的腫瘤,但GN組織分化成熟,是良性腫瘤。本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α、SHH在GN中均低表達(dá),而在NB中表達(dá)升高,尤其在進(jìn)展期NB中表達(dá)更高;說明HIF-1α/SHH信號(hào)通路激活和NB的惡性表型相關(guān),也可能在NB的發(fā)生、發(fā)展以及組織分化中起到重要作用。3、4期以及UFH型NB的HIF-1α、SHH表達(dá)水平高于1、2期以及FH型NB,有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NB中HIF-1α、SHH表達(dá)水平同樣升高,這進(jìn)一步說明HIF-1α/SHH信號(hào)通路激活可能是NB進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、去分化的分子機(jī)制。在本研究中,NB的HIF-1α和SHH表達(dá)水平呈正相關(guān),也證實(shí)HIF-1α對(duì)SHH通路的正向調(diào)控作用。我們也發(fā)現(xiàn)HIF-1α、SHH高表達(dá)組的5年OS率、EFS率均降低,提示HIF-1α/SHH信號(hào)通路激活可能預(yù)示NB患兒的不良預(yù)后,可作為年齡、分期、MYCN基因擴(kuò)增、病理類型等已知的NB預(yù)后因素的補(bǔ)充條件,進(jìn)一步增加判斷NB預(yù)后的準(zhǔn)確性。

        原癌基因MYCN擴(kuò)增在促進(jìn)NB生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等方面發(fā)揮重要作用,強(qiáng)烈提示NB的不良預(yù)后[21-22]。MYCN在NB中的擴(kuò)增率為10%~25%,在進(jìn)展期NB中擴(kuò)增率更高[23]。HIF-1α/SHH信號(hào)通路和MYCN擴(kuò)增之間的關(guān)系尚不明確,需進(jìn)一步研究。本研究中MYCN的擴(kuò)增率為11.9%(12/101),我們未發(fā)現(xiàn)MYCN擴(kuò)增組和非擴(kuò)增組之間HIF-1α和SHH的表達(dá)差異,無法提示HIF-1α/SHH信號(hào)通路和MYCN之間的調(diào)控關(guān)系,這也可能和NB中MYCN的擴(kuò)增率較低有關(guān)。

        綜上所述,HIF-1α、SHH表達(dá)升高和NB高的INSS分期、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UFH病理分型等臨床特征密切相關(guān),并預(yù)示NB患兒的不良預(yù)后。因此,HIF-1α/SHH信號(hào)通路激活可能在NB發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,該信號(hào)通路可能是NB潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

        參·考·文·獻(xiàn)

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