周天浩，辛肇晨，杜少倩，曹 源，許靜軒，勞曾紅，王紅霞#

1.上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院腫瘤中心，上海 201600；2.復旦大學附屬中山醫(yī)院普外科，上海 200030；3.浙江省德清縣人民醫(yī)院腫瘤科，德清 313216

乳腺癌是女性惡性腫瘤死亡的主要原因，發(fā)病率高居女性惡性腫瘤之首，死亡率居第五位。乳腺癌在中國的新發(fā)病例占全世界的12.2%，死亡病例占全世界的9.6%，嚴重危害女性生命健康［1］。乳腺癌是一種具有高度異質(zhì)性的疾病，具有不同組織類型、分化程度和分子亞型等；同一腫瘤內(nèi)部又由異質(zhì)性細胞亞群組成，導致臨床預后及治療反應性差異顯著［2］。目前對于乳腺癌的研究主要依賴已建立的可無限傳代細胞系，但其難以反映乳腺癌原發(fā)灶的真實生物學特征、異質(zhì)性狀態(tài)以及腫瘤微環(huán)境［3］。人源性腫瘤異體移植模型對解決乳腺癌的生物學復雜性具有一定意義，但其成功率低、成本高、動物飼養(yǎng)周期長，限制了其廣泛臨床應用［4］。近年來，患者來源類器官（patient-derived organoids，PDO）模型的建立為腫瘤生物學研究提供了方便、可靠的途徑［5］。PDO可以維持原發(fā)腫瘤細胞的生物學特性及組織異質(zhì)性，在驗證藥物敏感性、鑒定原代細胞基因及染色體突變、構(gòu)建異種移植動物模型等方面發(fā)揮重要作用［6］。但包括乳腺癌在內(nèi)的實體腫瘤PDO培養(yǎng)還存在培養(yǎng)成功率不高、傳代效率低、培養(yǎng)基和培養(yǎng)體系尚需優(yōu)化等問題。既往研究［7］報道的乳腺癌PDO培養(yǎng)成功率約為60%。Sachs等［8］成功建立了包含100余例乳腺癌的PDO庫，培養(yǎng)成功率可達80%，且可傳代20代，但其培養(yǎng)和傳代方法煩瑣，培養(yǎng)成本高，限制了其推廣和應用。乳腺癌纖維組織含量高，難以徹底消化，細胞回收率低，消化過久又會損傷細胞活性。既往研究［9-10］報道，乳腺癌組織消化大多采用Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原酶，究竟哪種消化效果更優(yōu)目前尚無定論。如何進一步改進培養(yǎng)方法、提高培養(yǎng)效率和降低培養(yǎng)成本是目前乳腺癌PDO培養(yǎng)亟需解決的問題。

腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和耐藥中發(fā)揮重要調(diào)控作用［11］。腫瘤上皮細胞和成纖維細胞體外共培養(yǎng)模型的探索也備受重視。Truong等［12］使用微流體培養(yǎng)系統(tǒng)共培養(yǎng)患者來源CAFs和乳腺癌細胞系，研究CAFs對腫瘤細胞侵襲和遷移的影響；Nayak等［13］利用生物可降解多聚內(nèi)酯的3D支架培養(yǎng)CAFs，并研究原代培養(yǎng)的乳腺癌細胞與CAFs釋放的細胞外基質(zhì)的交互作用。然而以上模型培養(yǎng)體系復雜，日常操作不易實現(xiàn)，且均未見PDO和患者來源CAFs的直接共同培養(yǎng)。既往報道的乳腺癌PDO的培養(yǎng)模型幾乎不含成纖維細胞，也無法真實反映腫瘤內(nèi)微環(huán)境的復雜狀態(tài)及相互調(diào)控［14］。因此在PDO培養(yǎng)中引入CAFs，可以更好地還原真實腫瘤內(nèi)環(huán)境，為研究腫瘤和間質(zhì)細胞的相互作用提供便利。

基于此，本研究根據(jù)乳腺癌組織的纖維化特征，選用不同種類膠原酶消化處理組織標本，改進組織處理方法；優(yōu)化PDO培養(yǎng)基成分和傳代方法，建立CAFs和PDO共培養(yǎng)體系，以期為乳腺癌基礎及轉(zhuǎn)化研究提供良好的體外模型。

1 材料與方法

1.1 組織標本、主要試劑及儀器

1.1.1 組織標本 58例乳腺癌患者組織標本均來自上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院。患者均簽署知情同意書。研究獲得上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院倫理委員會批準（#2018KY153）。

1.1.2 主要試劑 細胞培養(yǎng)添加劑B27、p38抑制劑SB-202190、Ⅰ型膠原酶、Ⅲ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶購自美國Sigma，4%多聚甲醛、DNA酶Ⅰ、CCK8試劑購自碧云天，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自巴西Gibco，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、改進型DMEM/F12細胞培養(yǎng)基、DMEM高糖細胞培養(yǎng)基、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、胰蛋白酶、TrypLE消化酶、谷氨酰胺、細胞恢復液、青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）購自美國Gibco，rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（rho-associated coiled-coil forming kinase，ROCK）抑制劑Y-27632購自美國Abmole，R-脊椎蛋白1（R-spondin-1）重組蛋白、noggin重組蛋白由本實驗室自制，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuregulin 1，NRG1）重組蛋白、成纖維細胞生長因子7（fibroblast growth factor 7，F(xiàn)GF7）、FGF10、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）購自美國Peprotech，轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）抑制劑A83-01購自英國Tocris，N-乙酰半胱氨酸、煙酰胺、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩沖液、原代細胞抗生素購自美國Invitrogen，免疫組織化學試劑盒購自中杉金橋，多色免疫熒光試劑盒購自美國Akoya，基質(zhì)膠購自美國R&D。鈣黏蛋白1（cadherin 1，CDH1）抗體、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體、角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）抗體、成纖維細胞活化蛋白α（fibroblast activating proteinα，F(xiàn)AP-α）抗體購自美國Abcam（貨號ab76055、ab52218、ab133263、ab207178），腫瘤相關(guān)鈣信號換能分子2（tumor associated calcium signal transducer 2，TROP2）抗體購自美國EMZO（貨號ENZO-ABS-380），雌激素受體（estrogen receptor，ER）抗體、孕激素受體（progesterone receptor，PR）抗體、人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）抗體、上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM/TROP1）抗體購自中國Proteintech（貨 號21244-1-AP、25871-1-AP、18299-1-AP、21050-1-AP）。

1.1.3 主要儀器 光學顯微鏡（Nikon，日本），熒光顯微鏡（ZEISS，德國），低溫高速離心機（Eppendorf，德國），CytoFLEX流式細胞儀（Beckman Coulter，美國），石蠟切片機、CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺（Thermo Scientific，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 PDO的處理和培養(yǎng) 將手術(shù)切除的乳腺癌組織剪碎至直徑小于1 mm；加入PDO消化液（改進型DMEM/F12+1 mg/mL膠原酶+300μg/mL DNA酶Ⅰ+2μmol/L Y-27632+雙抗），37℃搖床消化，轉(zhuǎn)速50 r/min；20 min后取出振蕩至組織散開，再放回37℃搖床消化20 min；加洗滌液（改進型DMEM/F12+2μmol/L Y-27632+0.5%BSA+雙抗）終止消化，用力振蕩，70μm濾網(wǎng)過濾細胞懸液，棄膠原殘余，細胞懸液4℃、400×g離心5 min；洗滌液重懸，4℃、400×g離心5 min，重復2次，計數(shù)，每1×104個細胞加30μL基質(zhì)膠和30μL PDO培養(yǎng)基。乳腺癌PDO培養(yǎng)基成分如下：谷氨酰胺添加劑glutamax 2 mmol/L，HEPES緩沖液10 mmol/L，雙抗100 U/mL，N-乙酰半胱氨酸1.25 mmol/L，EGF 5 ng/mL；noggin重組蛋白50倍稀釋使用，R-spondin-1重組蛋白20倍稀釋使用，A83-01（0.5 nmol/L）、Y-27632 （5 μmol/L）、SB202190（500 nmol/L）、B27添加劑50倍稀釋使用。

對同一患者（n=5）來源的PDO分別采用不同F(xiàn)GF7和FGF10含量的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。首先考察不同F(xiàn)GF7和FGF10的含量對PDO培養(yǎng)的影響，將細胞分為3組：高濃度組（5 ng/mL和20 ng/mL）、低濃度組（2.5 ng/mL和10 ng/mL）和未添加組。進一步比較EGF含量對PDO培養(yǎng)的影響，實驗分為高濃度組（5 ng/mL）、低濃度組（2.5 ng/mL）和未添加組。

1.2.2 細胞活性檢測 收集不同膠原酶處理的乳腺癌細胞，計數(shù)。取5×104個細胞，離心，棄上清液，100μL PBS重懸，按1∶1 000加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），4℃避光孵育30 min，離心，棄上清液，加入500μL PBS重懸，離心，重復2次。200μL PBS重懸，流式細胞儀分析DAPI陽性率和陰性率。

1.2.3 PDO傳代 選擇2種傳代方法。方法①：4℃、400×g離心5 min；細胞恢復液重懸，冰上消化30 min；4℃、400×g離心5 min，棄上清液；加入洗滌液重懸，4℃、400×g離心5 min；加入TrypLE消化酶，反復吹吸，37℃消化5～10 min，每2～3 min取出搖勻，放回37℃繼續(xù)消化，并在顯微鏡下觀察，細胞消化成絮狀或者單個為止，一般不超過10 min。方法②：4℃，使用較高轉(zhuǎn)速900×g，離心5 min；棄上清液，并吸去上層基質(zhì)膠，加入TrypLE消化酶，反復吹吸，后續(xù)過程同方法①。上述2種傳代方法分別完成后，按照以下步驟處理：4℃、400×g離心5 min；加入洗滌液，重懸；4℃、400×g離心5 min；將PDO培養(yǎng)基和基質(zhì)膠1∶1混合，重懸細胞鋪板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育10～15 min?；|(zhì)膠混合物凝固后加入PDO培養(yǎng)基。

1.2.4 免疫組織化學檢測 取500～1 000個PDO三維球體，500×g離心5 min，棄上清液，加入4%多聚甲醛，室溫固定過夜。之后梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明1 h，石蠟（溫度<50℃）浸泡2次，每次1 h；包埋后連續(xù)切片，厚度3μm。對于新鮮標本組織，手術(shù)離體后直接取乳腺癌組織塊浸泡于甲醛溶液中，進行固定、脫水、包埋和切片。將PDO切片和腫瘤原發(fā)灶切片置于65℃烘箱烤30 min，二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇水化，檸檬酸鈉抗原修復液高壓修復5 min，自然冷卻至室溫。室溫封閉15 min，棄封閉液，一抗4℃孵育過夜。次日棄一抗，分別室溫孵育3%過氧化氫、二抗和辣根酶標記鏈霉卵白素15 min，孵育間隙均用PBS洗滌3次，每次3 min。DAB辣根過氧化物酶顯色后，蘇木精染核，隨后梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，封片后顯微鏡下觀察。觀察指標主要包括陽性細胞內(nèi)定位、陽性細胞數(shù)量和陽性程度。利用Image pro plus軟件檢測陽性細胞數(shù)目，200倍鏡下隨機取5個視野，采用自動測量的方法，選取陽性染色像素信息，系統(tǒng)自動識別陽性細胞個數(shù)，再選取細胞核染色像素信息，系統(tǒng)自動識別細胞總數(shù)。陽性率=（陽性細胞個數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。

1.2.5 多色免疫組織化學鑒定 將PDO切片和腫瘤原發(fā)灶切片置于65℃烘箱烤30 min，二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇水化，用檸檬酸鈉抗原修復液高壓修復5 min，自然冷卻至室溫。室溫封閉15 min，棄封閉液，CK18抗體室溫孵育15 min，棄一抗，分別孵育二抗和綠色熒光染料，孵育間隙洗滌2次，每次5 min。微波爐抗原修復15 min，自然冷卻到室溫，封閉，分別孵育α-SMA一抗、二抗、紅色熒光染料和DAPI，封片觀察。

1.2.6 CAFs的分離和培養(yǎng) 將新鮮乳腺癌組織用剪刀分成體積1～3 mm3的組織塊，用CAFs消化液（DMEM+0.1 mg/mL膠原酶Ⅳ+2%雙抗）37℃消化過夜，次日加入含有10%FBS的DMEM終止消化，離心，用含有20%FBS的DMEM重懸，鋪板。3 d后CAFs可從組織中爬出并貼壁。細胞充分爬出后，用胰酶消化細胞1∶2進行傳代。傳至第3代，細胞長成形態(tài)均一的CAFs。

1.2.7 CAFs的免疫熒光鑒定 將處于生長對數(shù)期的CAFs鋪在裝有細胞爬片的24孔板中。待細胞貼壁后12 h，棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定30 min；PBS浸洗2次，每次5 min，室溫封閉10 min，加入α-SMA、FAP-α一抗，4℃過夜孵育；棄一抗，PBS浸洗3次，每次5 min，加入熒光二抗，室溫避光孵育30 min；棄二抗，PBS洗滌2次，每次5 min，擦干玻片后滴加封片劑，倒置于干凈的載玻片上。

1.2.8 PDO與CAFs共培養(yǎng) 將處于對數(shù)生長期的CAFs用胰酶消化，用含有10%FBS的DMEM終止消化，離心，棄上清液，用PDO培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)；將PDO消化成單細胞后，再次細胞計數(shù)，取CAFs和PDO細胞，1∶1混合，離心，用1∶1制備的基質(zhì)膠和PDO培養(yǎng)基混合液重懸，37℃培養(yǎng)箱放置10 min后，加入乳腺癌PDO培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.9 CCK8實驗 分別設置PDO單獨培養(yǎng)組和PDO+CAFs共培養(yǎng)組，每孔種植5 000個CAFs和PDO細胞，設置3個復孔，分別培養(yǎng)1、2、4、6和8 d。每次小心吸取3D培養(yǎng)的PDO，離心，棄上清液和基質(zhì)膠，用450μL新鮮PDO培養(yǎng)基和50μL CCK8重懸，37℃培養(yǎng)2 h后用分光光度計測量450 nm處的吸光度值［D（450 nm）］。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料用±s表示，2組間差異比較采用非配對t檢驗。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織單細胞處理體系的改進

根據(jù)既往研究［15-17］報道以及乳腺癌自身膠原蛋白的性質(zhì)，分別選用3種不同膠原酶比較細胞回收效率與細胞活性。收集5例乳腺癌新鮮腫瘤組織，分別以100μLⅠ型、Ⅲ型和Ⅳ膠原酶處理。結(jié)果顯示，Ⅳ膠原酶在消化40 min后可將乳腺癌組織消化成絮狀，而Ⅰ型、Ⅲ型膠原酶處理組均有明顯組織剩余。過濾離心后細胞計數(shù)，Ⅳ型膠原酶消化得到的細胞數(shù)明顯多于Ⅰ型和Ⅲ型膠原酶處理組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.045，P=0.017；圖1A）。過濾收集單細胞懸液，通過流式細胞儀檢測細胞活性，Ⅳ型膠原酶處理組的細胞存活率明顯高于Ⅰ型、Ⅲ型膠原酶處理組（圖1B、C），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.005，P=0.048）。綜上，在同等條件下Ⅳ型膠原酶對乳腺癌組織的消化效率最高，對細胞活性保護最好。

圖1 不同種類的膠原酶對乳腺癌組織的消化效率和對細胞損傷的對比Fig 1 Comparison of digestion efficiency and cell damageof different types of collagenase in breast cancer tissues

2.2 PDO培養(yǎng)基和傳代方式的優(yōu)化

對同一患者（n=5）來源的PDO，采用不同F(xiàn)GF7和FGF10含量的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每日觀察3組PDO形成數(shù)量和直徑大小，并在培養(yǎng)的第5日和第10日拍照（圖2A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第10日FGF7和FGF10添加與否對PDO生成數(shù)量（P=0.556，P=0.842）以及三維球體大?。≒=0.842，P=0.800）均無顯著影響（圖2A）。進一步比較不同EGF含量對PDO培養(yǎng)的影響，結(jié)果（圖2B）發(fā)現(xiàn)EGF高濃度組和低濃度組中PDO形成數(shù)量和球體直徑差異無統(tǒng)計學意義（P=0.225，P=0.719）；而與EGF高濃度組和低濃度組相比，EGF未添加組PDO培養(yǎng)成功率明顯降低，三維球體生成數(shù)量明顯減少（P=0.000），且球體直徑明顯減?。≒=0.000）。

為簡化PDO細胞傳代步驟，提高傳代效率，我們基于基質(zhì)膠和PDO密度不同的原理，采用梯度離心法分離基質(zhì)膠與PDO的混合物；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)速在900×g時，基質(zhì)膠和PDO可以完全分層。吸去基質(zhì)膠后再用消化酶消化的方法，相比于傳統(tǒng)用細胞恢復液消化基質(zhì)膠和直接用消化酶消化基質(zhì)膠與PDO的混合物的方法，消化時間縮短，對PDO保護作用更好，傳代效率更高。改良傳代方法后，PDO仍保持良好狀態(tài)，且可傳代20代以上（圖2C）。對58例乳腺癌組織的處理結(jié)果顯示，采用本研究改進的PDO培養(yǎng)和傳代體系，培養(yǎng)成功率達79.3%（46/58）。

圖2 PDO培養(yǎng)和傳代條件的優(yōu)化和改進Fig 2 Optimization and improvement of PDO culture and passage conditions

2.3 優(yōu)化培養(yǎng)后的PDO的鑒定與驗證

采用免疫組織化學法檢測乳腺癌PDO和原發(fā)灶中ER、PR和HER2蛋白的表達情況；結(jié)果顯示，優(yōu)化培養(yǎng)后獲得的乳腺癌PDO中ER、PR和HER2的表達水平與乳腺癌原發(fā)灶基本一致（圖3A）；定量分析結(jié)果顯示，各分子表達水平在PDO和原發(fā)灶之間的差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05，圖3B）。進一步采用免疫組織化學法比較上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和乳腺癌干細胞相關(guān)指標CDH1、TROP1和TROP2在乳腺癌原發(fā)灶及相應PDO中的表達水平；結(jié)果顯示，同一患者來源PDO和原發(fā)灶的CDH1、TROP1和TROP2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（圖3C、D）。

圖3 PDO的表面分子表達情況和組織學特點Fig 3 Molecular expression and histological characteristics of PDO

2.4 CAFs和PDO共培養(yǎng)體系的構(gòu)建

PDO三維球體懸浮生長，而CAFs貼壁生長。基于此，本研究將源自同一乳腺癌患者的CAFs和PDO分別培養(yǎng)，待兩者體外穩(wěn)定生長之后，對其進行鑒定，再進行共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，PDO細胞表達腺上皮標志物CK18而不表達成纖維細胞標志物α-SMA（圖4A），表明其組成成分主要為乳腺癌腫瘤細胞；而經(jīng)分離并穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的CAFs表達FAP-α和α-SMA，證實了CAFs的存在（圖4B）。后續(xù)按照1∶1比例將CAFs與PDO混合，發(fā)現(xiàn)兩者可在同一培養(yǎng)體系中穩(wěn)定生長，并可傳代培養(yǎng)（圖4C）。在PDO和CAFs穩(wěn)定共培養(yǎng)之后，鏡下觀察PDO的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與CAFs共同培養(yǎng)的PDO形態(tài)更加豐富多樣（圖4D）。高倍鏡下觀察PDO具體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與CAFs共同培養(yǎng)的PDO外形相對不規(guī)則，內(nèi)部可長出多個囊腔（圖4E）。

為了探究CAFs對PDO生長狀態(tài)是否產(chǎn)生影響，本研究比較單獨培養(yǎng)的PDO和與CAFs共同培養(yǎng)的PDO的生長速度差別。CCK8實驗結(jié)果顯示，相比較于單獨培養(yǎng)的PDO，與CAFs共同培養(yǎng)的PDO細胞生長速度更快，差異有統(tǒng)計學意義（圖4F）。

圖4 CAFs和PDO共培養(yǎng)體系構(gòu)建和CAFs對PDO形態(tài)異質(zhì)性以及生長速度的影響Fig 4 Construction of CAFs and PDO co-culture system and influence of CAFs on morphological heterogeneity and growth rate of PDO

3 討論

隨著乳腺癌PDO培養(yǎng)體系的建立，發(fā)現(xiàn)其具有細胞系無法替代的功能，在新藥研發(fā)［18］、基因編輯［19-20］、指定個體化學治療（化療）方案制定［21］等方面具有廣闊的應用前景。大多數(shù)乳腺癌的纖維化程度非常嚴重，組織質(zhì)硬，難以徹底消化成單個細胞，而組織未完全消化導致細胞損失較多。乳腺癌的膠原纖維主要由Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原蛋白組成［22］，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原酶也已經(jīng)公開用于乳腺癌PDO標本的培養(yǎng)處理；但采用何種膠原酶對組織進行處理所得結(jié)果更優(yōu)目前尚未達成共識［23-24］。我們通過對比不同類型的膠原酶對乳腺癌組織的消化效率，發(fā)現(xiàn)相同酶濃度下，Ⅳ型膠原酶具有良好的消化效率，并且對細胞活性損傷較小。在此優(yōu)化的標本處理條件下，體積較小的腫瘤或者穿刺腫瘤樣本PDO培養(yǎng)的成功率有望提高。

PDO的培養(yǎng)基成分復雜、價格昂貴，在應對大規(guī)模培養(yǎng)和臨床廣泛推廣時成本高。因此，在保證獲得較高培養(yǎng)成功率的前提下，培養(yǎng)體系的優(yōu)化顯得尤為重要。現(xiàn)有PDO培養(yǎng)體系中R-spondin-1、noggin的主要作用為維持細胞干性狀態(tài)；A83-01、Y-27632、SB202190分別為TGF-β、ROCK、p38靶向抑制劑，抑制細胞分化［25］。FGF7、FGF10和EGF是促進乳腺上皮細胞增殖的因子，三者在上皮細胞或者間質(zhì)細胞中均可通過自分泌或者旁分泌的方式發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在PDO的培養(yǎng)中FGF7和FGF10并非必需添加因子，而EGF劑量減半仍可維持較好PDO體外生長效率；后續(xù)擴大培養(yǎng)后，培養(yǎng)成功率為79.3%（46/58）。此外，在本研究培養(yǎng)體系下，PDO可以穩(wěn)定傳代20代以上。免疫組織化學分析結(jié)果顯示，構(gòu)建成功的PDO模型與原發(fā)灶在ER、PR、HER2、CDH1、TROP1、TROP2表達上基本一致，表明該PDO模型在簡化培養(yǎng)體系、減小培養(yǎng)工作量的同時很好地保持了原發(fā)灶的特征和分子生物學特點，能夠滿足后續(xù)藥物篩選、功能驗證等實驗應用的需求。

近年來的研究證明，CAFs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、耐藥和免疫微環(huán)境抑制中的作用越來越重要。CAFs可以通過分泌細胞因子或者釋放外泌體促進腫瘤細胞生長和血管生成［9］，也可以參與腫瘤化療耐藥的調(diào)節(jié)［26］。此外，CAFs在腫瘤免疫的調(diào)節(jié)過程中也起重要作用［27］。因此，向待研究的腫瘤體系引入CAFs至關(guān)重要。對于乳腺癌PDO和同一患者來源原代CAFs動態(tài)共培養(yǎng)未見相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn)，通過乳腺癌CAFs和PDO共培養(yǎng)體系的建立，可以提高PDO細胞的增殖速度且促使PDO形態(tài)更加多樣，使其呈現(xiàn)更強的異質(zhì)性。

本研究優(yōu)化了類器官標本處理、培養(yǎng)、傳代等一系列操作步驟，使得類器官培養(yǎng)成本降低，培養(yǎng)時間縮短，有助于日后大規(guī)模培養(yǎng)擴增PDO。引入同一患者來源的CAFs和PDO動態(tài)共培養(yǎng)體系，之前在乳腺癌中尚未有相關(guān)報道。該培養(yǎng)方法簡便易行，可用于CAFs和乳腺癌細胞交互作用的動態(tài)研究，并為后續(xù)研究CAFs和PDO共同培養(yǎng)后CAFs和PDO的基因表達譜變化、培養(yǎng)體系中分泌蛋白變化以及藥物的篩選等打下堅實基礎。

參·考·文·獻

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