姜建萍 楊學(xué)明 袁翔 邱慶慶 楊秀榮 蔣欽楊 黃光華 蔣和生

摘要：【目的】克隆羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）淀粉酶基因（AMY），并進(jìn)行生物學(xué)信息分析及其表達(dá)規(guī)律研究，為揭示AMY基因的生物學(xué)功能及其對(duì)羅氏沼蝦生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用機(jī)理提供理論依據(jù)?！痉椒ā縋CR克隆羅氏沼蝦AMY基因編碼區(qū)（CDS）序列，利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、SignalP-5.0、MegAlign及Lasergene v8.0等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AMY基因在羅氏沼蝦不同組織（腹神經(jīng)節(jié)、胃、心臟、鰓組織、性腺、肝胰腺、肌肉和腸道）中的表達(dá)情況，并明確其在生長(zhǎng)快速家系（FG）和生長(zhǎng)慢速家系（SG）個(gè)體肌肉中的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】羅氏沼蝦AMY基因CDS序列全長(zhǎng)2121 bp，共編碼706個(gè)氨基酸殘基;其編碼蛋白分子量為76.87 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為4.63，屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白，包含2個(gè)典型的淀粉酶結(jié)構(gòu)域;在羅氏沼蝦AMY蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占13.88%，延伸鏈占21.39%，無(wú)規(guī)則卷曲占64.73%。羅氏沼蝦AMY氨基酸序列與克氏原螯蝦AMY氨基酸序列的相似性最高（62.6%），與大珠母貝AMY氨基酸序列的相似性較低（48.9%）;基于AMY氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示，羅氏沼蝦與克氏原螯蝦的親緣關(guān)系最近，而與中華絨螯蟹的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。AMY基因在羅氏沼蝦不同組織中廣泛表達(dá)，但存在性別差異性和組織特異性，具體表現(xiàn)為：雌性個(gè)體腸道中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于雄性個(gè)體（P<0.01，下同），鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于雄性個(gè)體（P<0.05），而肝胰腺中的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于雄性個(gè)體。羅氏沼蝦AMY基因在FG個(gè)體肌肉中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于SG個(gè)體?！窘Y(jié)論】AMY基因在羅氏沼蝦的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，廣泛表達(dá)于羅氏沼蝦的不同組織中，但存在性別差異性和組織特異性。

關(guān)鍵詞： 羅氏沼蝦;淀粉酶基因（AMY）;表達(dá)規(guī)律;生物信息學(xué)分析;生長(zhǎng)性狀

中圖分類(lèi)號(hào)： S917.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）05-1362-08

Abstract：【Objective】Macrobrachium rosenbergii amylase gene（AMY） was cloned， biological information analysis and expression regulation were studied， to provide theoretical foundation for further understanding biological function of AMY gene in the growth and development of M. rosenbergii. 【Method】The coding area sequence （CDS） of AMY gene in M. rosenbergii was cloned by PCR. Bioinformatic analysis of AMY sequencing was performed using ExPASy ProtParam， ExPASy ProtScale， SignalP-5.0， MegAlign and Lasergene v8.0 softwares. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-PCR） was used to detect the expression of AMY gene in different tissues（including abdominal ganglion，stomach，heart，gill，gonad，hepatopancreas，muscle and intestine）， and further to explore its expression in the muscle of individuals from fast-growing families（FG） and slow-growing families（SG）. 【Result】The length of CDS of AMY gene was 2121 bp， encoding 706 amino acids residues. The molecular weight of AMY protein was 76.87 kD，and the theoretical isoelectric point（pI） was 4.63，belonging to an unstable hydrophilic protein， which contained two typical amylase domains. The secondary structure of AMY protein was consisted of α-helix，extended strand and random coil，accounting for 13.88%， 21.39% and 64.73%， respectively. The homology of amino acid sequence of AMY gene in M. rosenbergii was the highest（62.6%） and lower（48.9%） compared with the amino acid sequences of Procambarus clarkii and Pinctada maxima，respectively. Phylogenetic tree constructed based on the amino acid sequence similarity of AMY genes howed that M. rosenbergii had the closest genetic relationship with P. clarki， but had the far genetic relationship with Eriocheir sinensis. AMY gene was widely expressed in the different tissues， but with differences between sexes and tissue specificity. The details were as follows：it had the extremely higher expression in the intestines and gills of female individuals than that of male individuals（P<0.01， the same below），it had the significantly higher expression in gill of female individuals than that of male indivi-duals（P<0.05），but the expression in the hepatopancreas of female individuals was lower than that of male individuals. In addition， the expression level of AMY gene in muscle of in FG was extremely higher than that in SG. 【Conclusion】AMY gene plays an important role in growth and development of? M. rosenbergii. It is widely expressed in different tissues of M. rosenbergii， but with sex specificity? and tissue specificity.

Key words：Macrobrachium rosenbergii; amylase gene（AMY）; expression regulation; bioinformatic analysis; growth traits

Foundation item：Guangxi Natural Science Foundation（2018GXNSFBA281209）; Science and Technology Major Project of Guangxi（Guike AA17204080-6）; Guangxi Postdoctoral Fundamental Research Fund（T3340097968）

0 引言

【研究意義】羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）原產(chǎn)于東南亞國(guó)家，因具有生長(zhǎng)快、食性廣、肉質(zhì)鮮美及養(yǎng)殖周期短等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已發(fā)展成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種之一（姜建萍等，2019）。截至2018年，我國(guó)羅氏沼蝦產(chǎn)量達(dá)13.3萬(wàn)t（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁政漁業(yè)管理局，2019）。隨著集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，近親繁殖等原因致使羅氏沼蝦種質(zhì)不斷退化，“老頭蝦”“蝎子蝦”現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)，嚴(yán)重制約了羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，亟待進(jìn)一步加強(qiáng)羅氏沼蝦遺傳改良以提高羅氏沼蝦養(yǎng)殖效益和健康養(yǎng)殖水平。淀粉酶（Amylase，AMY）是機(jī)體內(nèi)重要的消化酶類(lèi)，在甲殼類(lèi)動(dòng)物碳水化合代謝及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收方面扮演著重要角色（Simon，2009;Karasov and Douglas，2013;Rodríguez-Viera et al.，2017），因此開(kāi)展羅氏沼蝦AMY基因克隆及其表達(dá)規(guī)律分析，對(duì)深入探究AMY基因生物學(xué)功能和提高羅氏沼蝦遺傳改良及分子輔助育種均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，已有眾多學(xué)者針對(duì)AMY基因克隆及其生物信息學(xué)分析展開(kāi)了一系列研究，從鱖魚(yú)（陳亮等，2009）、斜帶石斑魚(yú)（胡永樂(lè)等，2010）、大珠母貝（潘俐玲等，2013）、日本囊對(duì)蝦（宋曉紅，2014）、九孔鮑（栗志民等，2017）及斑節(jié)對(duì)蝦（楊其彬等，2017）等多種水產(chǎn)動(dòng)物中克隆獲得AMY基因編碼區(qū)（CDS）序列，針對(duì)AMY基因的表達(dá)模式及其規(guī)律也有較多研究報(bào)道。辛靜靜等（2011）研究證實(shí)，AMY基因多態(tài)性對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性狀有顯著影響，可作為影響凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性狀的候選基因。宋曉紅（2014）研究表明，AMY基因在不同變異類(lèi)型日本囊對(duì)蝦的不同組織中均有表達(dá)，以肝胰腺中的相對(duì)表達(dá)量最高，故推測(cè)AMY基因與日本囊對(duì)蝦的消化代謝相關(guān)。彭濤（2015）通過(guò)免疫印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析克氏原螯蝦AMY基因的組織表達(dá)差異，結(jié)果顯示AMY基因在各組織中的表達(dá)量差異顯著，以在肝胰腺中的表達(dá)量最高，其次是胃組織;經(jīng)蛻皮激素刺激48 h后其表達(dá)量明顯下降，說(shuō)明AMY基因能應(yīng)答克氏原螯蝦蛻皮激素誘導(dǎo)信號(hào)。唐小紅等（2015）研究表明，肝胰臟并不是草魚(yú)生成淀粉酶的唯一場(chǎng)所，在其腸道組織中也有AMY基因表達(dá);自出膜72 h仔魚(yú)開(kāi)口攝食之后，AMY基因的表達(dá)量明顯增加，故推測(cè)攝食能促進(jìn)草魚(yú)AMY基因的表達(dá)。栗志民等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，AMY基因在九孔鮑右側(cè)殼肌、腸道、肝臟、胃、外套膜、吻和腹足等7種組織中均有不同程度的表達(dá)，經(jīng)ANOVA分析顯示消化組織與非消化組織間的AMY基因表達(dá)量存在顯著差異，即AMY基因表達(dá)量與九孔鮑的生長(zhǎng)性狀呈顯著正相關(guān)。楊其彬等（2017）研究表明，AMY基因在斑節(jié)對(duì)蝦的不同組織及整個(gè)生長(zhǎng)階段均有表達(dá)，且以糠蝦時(shí)期的表達(dá)量最高，說(shuō)明AMY基因可能與斑節(jié)對(duì)蝦的幼體發(fā)育相關(guān)。以上研究證明，AMY基因是水產(chǎn)類(lèi)動(dòng)物重要的生長(zhǎng)性狀候選基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，關(guān)于羅氏沼蝦AMY基因的克隆、生物信息學(xué)分析及其表達(dá)規(guī)律鮮見(jiàn)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于NCBI已公布的AMY基因EST序列，克隆羅氏沼蝦AMY基因CDS序列，并進(jìn)行生物學(xué)信息分析及其表達(dá)規(guī)律研究，為揭示AMY基因的生物學(xué)功能及其對(duì)羅氏沼蝦生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

5月齡羅氏沼蝦由廣西南寧國(guó)家級(jí)羅氏沼蝦良種場(chǎng)提供。以肝胰腺為素材，進(jìn)行AMY基因克隆;分別選取7尾雌/雄羅氏沼蝦采集樣品，包括腹神經(jīng)節(jié)、胃、心臟、鰓組織、性腺、肝胰腺、肌肉和腸道共8個(gè)組織，用于AMY基因表達(dá)分析;同時(shí)采集生長(zhǎng)快速家系（FG）和生長(zhǎng)慢速家系（SG）中體重和體長(zhǎng)極端性狀的雌性羅氏沼蝦肌肉組織（邱慶慶，2019），分別置于液氮中保存?zhèn)溆??？俁NA提取試劑TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、凝膠回收試劑盒、pMD18-T載體和Premix Ex TaqTM Ⅱ均購(gòu)自TaKaRa公司;DL2000 DNA Marker購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司;Taq PCR Master Mix購(gòu)自Vazyme公司;大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1. 2 總RNA提取及cDNA合成

采用TRIzol提取羅氏沼蝦樣品總RNA，利用NanoDrop 2000和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度及其完整性，再以PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑合成cDNA。

1. 3 AMY基因克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)GenBank已公布的羅氏沼蝦AMY基因EST序列（KM886337.1），利用AMY-1引物擴(kuò)增AMY基因CDS序列，PCR反應(yīng)體系15.0 μL：2×Taq Master Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，RNase-free ddH2O 5.5 μL。擴(kuò)增程序：95.0 ℃預(yù)變性5 min;95.0 ℃ 30 s，57.6 ℃ 30 s，72.0 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72.0 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用膠回收試劑盒進(jìn)行目的條帶回收及純化，過(guò)夜連接至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 4 AMY基因生物信息學(xué)分析

利用ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析羅氏沼蝦AMY基因編碼蛋白理化性質(zhì);采用ExPASy ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行親/疏水性預(yù)測(cè);運(yùn)用SignalP-5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)其信號(hào)肽;使用SMART（http：//smart.embl.de/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè);利用MLRC（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_mlrc.html）和SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分別進(jìn)行編碼蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);并以DNASTAR中的MegAlign和Lasergene v8.0分別進(jìn)行同源比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析。

1. 5 AMY基因表達(dá)分析

基于克隆獲得的AMY基因CDS序列，以18S rRNA序列（DQ642856.1）為內(nèi)參基因（俞炎琴，2013），利用Primer 3（http：//primer3.ut.ee/）和Oligo 7.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表1），通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)羅氏沼蝦AMY基因的表達(dá)情況。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：Premix Ex Taq? II 10.0 μL，cDNA模板5.0 μL，正、反向引物各0.5 μL，RNase free ddH2O 4.0 μL。擴(kuò)增程序：95.0 ℃預(yù)變性30 s;95.0 ℃ 5 s，60.0 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);72.0 ℃延伸5 min，4.0 ℃保存。每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，采用2?ΔΔCt法計(jì)算AMY基因的相對(duì)表達(dá)量（Livak and Schmittgen，2001）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 羅氏沼蝦AMY基因CDS序列及測(cè)序分析結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果獲得1條明亮清晰、大小約2000 bp的特異性條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果顯示，羅氏沼蝦AMY基因CDS序列全長(zhǎng)2121 bp，共編碼706個(gè)氨基酸殘基;氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其與NCBI已發(fā)布羅氏沼蝦（GenBank登錄號(hào)KM886337.1）相應(yīng)氨基酸序列的相似性達(dá)99.9%，僅是第251位堿基由A→G，導(dǎo)致第84位酪氨酸（Tyr）突變?yōu)榘腚装彼幔–ys）（圖2）。

2. 2 羅氏沼蝦AMY蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析結(jié)果

羅氏沼蝦AMY基因編碼蛋白分子量為76.87 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為4.63。羅氏沼蝦AMY蛋白的甘氨酸（Gly）含量較高，占總氨基酸數(shù)的12.60%;帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）為83個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）為42個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為33.17（屬于不穩(wěn)定蛋白），脂肪數(shù)為59.80;AMY蛋白親水性平均值為-0.398，具有較強(qiáng)的親水性（圖3），與ExPASy ProtParam預(yù)測(cè)得到的親水性平均系數(shù)（GRAVY=-0.398）一致，故推測(cè)羅氏沼蝦AMY蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。SMART的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，羅氏沼蝦AMY蛋白存在信號(hào)肽，且信號(hào)肽是由AWA-YD組成，其剪切位點(diǎn)分別在第18位和第19位氨基酸殘基間。羅氏沼蝦AMY蛋白還包含2個(gè)典型的淀粉酶結(jié)構(gòu)域，即domain A（28Gln～402Arg）和domain C（411Glu～489Gly）。

2. 3 羅氏沼蝦AMY蛋白糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

羅氏沼蝦AMY蛋白不存在糖基化位點(diǎn);其磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖4）顯示，在AMY肽鏈中可能發(fā)生磷酸化且分值在0.5以上的氨基酸位點(diǎn)有80個(gè)，其中，蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)29個(gè)，絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)37個(gè)，酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)14個(gè)。由于AMY肽鏈?zhǔn)且越z氨酸磷酸化位點(diǎn)為主，故推測(cè)羅氏沼蝦AMY蛋白是以絲氨酸為主、蘇氨酸為輔的磷酸化修飾調(diào)控其生物功能。

2. 4 羅氏沼蝦AMY蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

羅氏沼蝦AMY蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，以無(wú)規(guī)則卷曲占比最高（占64.73%），其次是延伸鏈（占21.39%），α-螺旋僅占13.88%。利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)羅氏沼蝦AMY蛋白可能存在的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示。

2. 5 羅氏沼蝦AMY基因同源性比對(duì)分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

根據(jù)NCBI已公布的AMY基因EST序列，可知羅氏沼蝦AMY基因CDS序列編碼706個(gè)氨基酸殘基。針對(duì)羅氏沼蝦（AKL71614.1）、斑節(jié)對(duì)蝦（AME17649.1）、凡納濱對(duì)蝦（AIJ02079.1）、太平洋牡蠣（CAA69658.1）、褐蝦（AWU67110）、合浦珠母貝（AGN55419.1）、克氏原螯蝦（AXC43909.1）、大珠母貝（AEI58897.1）及中華絨螯蟹（ANG56301.1）的AMY氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果（圖7）顯示，羅氏沼蝦與克氏原螯蝦的相似性最高（62.6%），與大珠母貝的相似性較低（48.9%）?；贏MY氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖8）顯示，羅氏沼蝦與克氏原螯蝦的親緣關(guān)系最近，而與中華絨螯蟹的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2. 6 羅氏沼蝦AMY基因的組織表達(dá)差異

如圖9所示，AMY基因在雄性羅氏沼蝦不同組織中的相對(duì)表達(dá)量以肝胰腺最高，其次是胃，鰓組織的相對(duì)表達(dá)量最低;在雌性羅氏沼蝦中以肝胰腺的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是胃，而肌肉的相對(duì)表達(dá)量最低。對(duì)比相同組織不同性別個(gè)體的AMY基因相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦AMY基因在雌性個(gè)體腸道中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于雄性個(gè)體（P<0.01，下同），鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于雄性個(gè)體（P<0.05），肝胰腺中的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于雄性個(gè)體，而腹神經(jīng)節(jié)、胃、心臟、性腺和肌肉中的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）?？梢?jiàn)，AMY基因在羅氏沼蝦不同組織中廣泛表達(dá)，但存在性別差異性和組織特異性。

2. 7 羅氏沼蝦AMY基因在不同生長(zhǎng)速度家系個(gè)體中的表達(dá)差異

為探究羅氏沼蝦AMY基因在不同生長(zhǎng)速度家系個(gè)體中的表達(dá)規(guī)律，以體重和體長(zhǎng)等生長(zhǎng)性狀表型值差異極顯著的FG和SG個(gè)體為供試材料，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同生長(zhǎng)速度家系個(gè)體肌肉中的AMY基因表達(dá)情況。由圖10可知，羅氏沼蝦AMY基因在FG個(gè)體肌肉中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于SG個(gè)體的相對(duì)表達(dá)量。

3 討論

AMY是甲殼類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)主要的消化酶類(lèi)，對(duì)其新陳代謝及生長(zhǎng)發(fā)育等活動(dòng)發(fā)揮著極其重要的作用（陳亮等，2009）。AMY活性對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收效率有顯著影響，進(jìn)而影響機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育（Hidalgo et al.，1999;Huvet et al.，2008;李浩，2018;朱書(shū)禮等，2020）。為此，本研究以羅氏沼蝦為研究對(duì)象，開(kāi)展AMY基因克隆并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，羅氏沼蝦AMY基因CDS序列全長(zhǎng)2121 bp，共編碼706個(gè)氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量為76.87 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為4.63，屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白，包含2個(gè)典型的淀粉酶結(jié)構(gòu)域，即domain A（28Gln～402Arg）和domain C（411Glu～489Gly）;羅氏沼蝦AMY氨基酸序列與克氏原螯蝦AMY氨基酸序列的相似性最高，與大珠母貝AMY氨基酸序列的相似性較低;基于AMY氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示，羅氏沼蝦與克氏原螯蝦的親緣關(guān)系最近，而與中華絨螯蟹的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

本研究對(duì)羅氏沼蝦AMY基因的組織表達(dá)差異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AMY基因在羅氏沼蝦不同組織中廣泛表達(dá)，但存在性別差異性和組織特異性，具體表現(xiàn)為：雌性個(gè)體腸道中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于雄性個(gè)體，鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于雄性個(gè)體，而肝胰腺中的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于雄性個(gè)體。AMY基因在雄性羅氏沼蝦不同組織中的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)楦我认?胃>腹部神經(jīng)>腸道>精巢>心臟>肌肉>鰓組織，在雌性羅氏沼蝦中則表現(xiàn)為肝胰腺>胃>腸道>卵巢>腹神經(jīng)節(jié)>心臟>鰓組織>肌肉，與唐小紅等（2015）、栗志民等（2017）、楊其彬等（2017）的研究結(jié)果相似。羅氏沼蝦AMY基因表達(dá)的性別差異性和組織特異性，與胰蛋白酶原基因（TRY）在黃羽肉雞中的表達(dá)規(guī)律類(lèi)似，TRY基因在雄性黃羽肉雞肺臟中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于雌性黃羽肉雞，而在肌肉中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于雌性黃羽肉雞（許麗惠等，2018）。

本研究結(jié)果顯示，羅氏沼蝦AMY基因在生長(zhǎng)快速家系個(gè)體肌肉中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于生長(zhǎng)慢速家系個(gè)體，與斑節(jié)對(duì)蝦AMY基因的整個(gè)生長(zhǎng)階段均有表達(dá)，且在幼體發(fā)育過(guò)程中糠蝦期的表達(dá)量達(dá)峰值（楊其彬等，2017），文蛤AMY基因在不同發(fā)育時(shí)期的殼頂幼蟲(chóng)期表達(dá)量最高（高曉艷，2015），以及草魚(yú)出膜72 h后AMY基因表達(dá)量明顯升高（唐小紅等，2015）的研究結(jié)果相似。此外，AMY基因與甲殼類(lèi)動(dòng)物的生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)（Prudence et al.，2006;Huvet et al.，2008;栗志民等，2017）。綜合前人的相關(guān)研究結(jié)果可知，AMY基因在羅氏沼蝦的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，AMY基因表達(dá)量高的生長(zhǎng)快速家系個(gè)體，其AMY活性相應(yīng)也較高，因而生長(zhǎng)速率快，與在中華絨螯蟹（田華梅等，2003）、華貴櫛孔扇貝（鄧岳文等，2008）、美洲龍蝦（Perera et al.，2008）及馬氏珠母貝（王慶恒等，2010）中研究發(fā)現(xiàn)AMY活性與生長(zhǎng)速率緊密相關(guān)的結(jié)論相似，進(jìn)一步提示AMY基因可能介導(dǎo)羅氏沼蝦的生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié)論

AMY基因在羅氏沼蝦的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，廣泛表達(dá)于羅氏沼蝦的不同組織中，但存在性別差異性和組織特異性。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）