張世勇+王明華+鐘立強

摘要：采用DNA混池測序法篩選斑點叉尾肌肉生長抑制素（MSTN）基因SNP位點，同時使用SNaPshot法將篩選到的SNP多態(tài)性位點進行分型，最后與生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析。共篩選到4個SNP位點，即g.3501 T>G、g.3844 T>A、g.4297 C>G、g.4355 G>C。其中，g.3501 T>G位于第一內(nèi)含子；g.3844 T>A位于第二外顯子，并造成密碼子GUA變?yōu)镚AA，氨基酸由纈氨酸（Val）變?yōu)楣劝彼幔℅lu）；g.4297 C>G、g.4355 C>G位于第二內(nèi)含子。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，SNP位點g.4355 G>C與斑點叉尾的體質(zhì)量和體長呈顯著性負相關(guān)，具有GG基因型個體的體質(zhì)量和體長顯著性低于CC型和CG型（P<0.05），該位點可作為斑點叉尾分子育種的候選分子標記。

關(guān)鍵詞：斑點叉尾；MSTN；SNP；SNaPshot；生長性狀；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號： Q953；S917 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0030-03

肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）是骨形成蛋白家族（bone morphogenetic protein family）和TGF-β超家族成員之一，又被稱為生長分化因子8（growth and differentiation factor 8，GDF-8）。MSTN基因是肌肉生長發(fā)育的關(guān)鍵基因，它編碼的蛋白是骨骼肌生長的負性調(diào)控因子。McPherron等敲除小鼠的MSTN基因，發(fā)現(xiàn)小鼠骨骼肌生長加快[1]；在斑馬魚中進行的MSTN基因敲除試驗具有類似的試驗結(jié)果[2]。脊椎動物中MSTN基因的結(jié)構(gòu)和功能具有較高的保守性[3]，因此可將MSTN基因作為哺乳動物及魚類等物種的候選生長相關(guān)基因。

斑點叉尾（Ictalures punctatus）別稱美洲鲇、溝鲇，屬于鲇形目（Siluriformes）科（Ictaluridae），原產(chǎn)于美國，是一種重要的水產(chǎn)經(jīng)濟類物種，具有肉質(zhì)細膩、適溫范圍廣、生長速度快、抗病能力強等特點，2013年全世界養(yǎng)殖產(chǎn)量為 419 215 t[4]。斑點叉尾自1984年引入國內(nèi)后，養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量逐年增加，2013年我國養(yǎng)殖產(chǎn)量占全世界的一半以上，產(chǎn)量達224 132 t[5]。隨著我國斑點叉尾養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)明顯的生長減慢、體色分化、規(guī)格不齊等種質(zhì)衰退現(xiàn)象[6]；因此，培育生長快、抗逆性強的斑點叉尾新品種（系）已成為當前斑點叉尾產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要問題。本研究將MSTN基因作為斑點叉尾生長發(fā)育性狀的候選基因進行了SNP多態(tài)性檢測，并將篩選到的SNP位點與生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，旨在為斑點叉尾分子標記輔助育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

供試斑點叉尾樣本均來自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所祿口試驗基地。于2013年6月進行家系培育，為減小環(huán)境對斑點叉尾生長的影響，苗種培育按照同一標準進行，即均一的換水速率、投喂量、養(yǎng)殖密度、充氧量、水溫。待稚魚日齡為30 d時，每個家系隨機選取300尾于室外水泥池進行培育。家系日齡達到120 d時，每個家系隨機選取50尾魚注射RFID電子標記，并記錄每尾魚的電子編號、家系編號、體質(zhì)量、體長等信息。標記后將魚移至土池培育，家系平均日齡為520 d時，掃描并記錄存活個體編號，測量個體的體質(zhì)量、體長等信息。同時采集每尾魚的尾鰭組織，放入95%乙醇中，于 -20 ℃ 下保存。

1.2 基因組DNA提取

斑點叉尾尾鰭DNA的提取使用UNIQ-10型柱式動物基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司），按照試劑盒說明書進行操作。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果，采用紫外分光光度計測定DNA樣品濃度。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫公布的斑點叉尾MSTN基因序列（AF396747.1），采用Primer Premier 5軟件設(shè)計2對引物（表1）。第1對引物（P1）主要用于擴增第一外顯子及5′非編碼區(qū)、第一內(nèi)含子部分序列，第2對引物（P2）主要用于擴增第二外顯子、第二內(nèi)含子、第三外顯子及第一內(nèi)含子、3′非編碼區(qū)部分序列。

1.4 PCR擴增及測序

隨機抽取40尾斑點叉尾的DNA樣品，將每個樣品的質(zhì)量濃度調(diào)整至100 ng/μL ，各取1 μL 混合構(gòu)建DNA池。以DNA池和20尾個體基因組DNA為模板，利用所設(shè)計的2對引物進行PCR擴增。采用即用型UtraTaq酶PCR試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）進行PCR擴增。40 μL PCR反應(yīng)體系為：2×UltraTaq Master Mix試劑20 μL、基因組DNA 2 μL、上游及下游引物（質(zhì)量濃度為10 pmol/μL）各2 μL、ddH2O 14 μL 。采用BIOMETRA T1型PCR擴增儀進行擴增，PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，利用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物純化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司，直接采用ABI 3730XL型測序儀測序。所得結(jié)果使用Chromas軟件觀察測序峰圖，并結(jié)合使用ClustalX軟件進行DNA序列比對，判斷SNP位點的堿基類型。

1.5 SNaPshot法SNP分型

采用SNaPshot法對4個家系共176尾魚進行SNP位點分型。根據(jù)SNP位點側(cè)翼序列設(shè)計擴增引物，使擴增片段長度為200～500 bp。延伸引物3′端第1個堿基緊鄰待測SNP位點，Tm值為50 ℃以上，并且在引物的5′末端加上不同長度的Poly C或Poly T。

采用Touchdown PCR程序進行多重PCR擴增，20 μL 反應(yīng)體系為：0.8 μL MgCl2（50 mmol/L）、2 μL 10×PCR buffer（Mg2+ free）、0.5 μL dNTP（10 mmol/L）、0.5 μL混合引物、1 μL 模板DNA、0.5 μL Platinum Taq（5 U），其余用ddH2O補足。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，60 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；共11個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃；94 ℃變性15 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共24個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后進行PCR產(chǎn)物純化，10 μL 反應(yīng)體系為：FastAP（Thermosensitive Alkaline Phosphatase，F(xiàn)ermentas）0.8 μL、ExoⅠ 0.2 μL、ExoⅠ buffer 0.7 μL、PCR產(chǎn)物3 μL、H2O 5.3 μL 。反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，80 ℃ 15 min，純化后進行延伸反應(yīng)，并預(yù)先混勻延伸引物。

SNP分型采用ABI SNaPshot Multiplex PCR試劑盒（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），6 μL 反應(yīng)體系為：Snapshot Mix 1 μL、延伸引物0.1 μL、多重PCR產(chǎn)物2 μL、ddH2O 2.9 μL 。反應(yīng)條件為：96 ℃預(yù)變性1 min；96 ℃變性10 s，52 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后加入1 U FastAP，并以37 ℃ 60 min、85 ℃ 15 min條件進行純化。以GeneScan-120Liz Size Standard（ABI）為內(nèi)標，取1 μL 產(chǎn)物與9 μL 含有Liz的Hi-Di（GS-120Liz ∶Hi-Di=1 ∶200）混合，95 ℃變性3 min，立即冰浴3 min后上測序儀。采用ABI PRISM 3730 XI型自動遺傳分析系統(tǒng)進行檢測及分析，并利用Genemapper v4.1軟件進行分型。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用R（3.0.1）軟件對試驗斑點叉尾SNP位點的各基因型體質(zhì)量、體長進行方差齊性分析（homogeneity of variance test）和單因素ANOVA（one-way ANOVA）分析。采用均值多重比較（multiple comparisons of means）方法分析SNP位點各基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)程度。統(tǒng)計分析模型為：

Yij=μ+Gi+eij。

式中：Yij為某個性狀第i個標記第j個個體觀測值，μ為試驗觀測所有個體的平均值（即總體平均值），Gi為第i個標記的效應(yīng)值，eij為對應(yīng)于觀察值的隨機殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSTN基因SNP位點篩選

利用所設(shè)計的2對引物對40尾斑點叉尾構(gòu)建的DNA池及20尾個體進行PCR擴增和測序分析。共篩選出4個SNP位點，即g.3501 T>G、g.3844 T>A、g.4297 C>G、g.4355 G>C，且所有位點均由第2對引物擴增得到。其中，g.3501 T>G位于第一內(nèi)含子；g.3844 T>A位于第二外顯子，密碼子GUA變?yōu)镚AA，氨基酸由纈氨酸（Val）變?yōu)楣劝彼幔℅lu）；g.4297 C>G、g.4355 C>G位于第二內(nèi)含子（圖1）。

2.2 SNP位點的關(guān)聯(lián)分析

對斑點叉尾4個家系176尾魚的體質(zhì)量和體長進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示。體質(zhì)量、體長分別為（280.63±13.21） g、（31.26±0.56） cm。采用R軟件將篩選得到的4個SNP位點與測量的斑點叉尾體質(zhì)量、體長進行單因素ANOVA分析，并結(jié)合均值多重比較分析得出，4個SNPs中的1個（g.4355 G>C）與斑點叉尾體質(zhì)量、體長呈顯著性負相關(guān)（表2）。在SNP位點g.4355 G>C，具有GG基因型個體的體質(zhì)量、體長顯著性低于CC型和CG型（P<005）。

3 結(jié)論與討論

MSTN基因具有多種重要功能，它在哺乳動物中的主要功能為調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程中肌纖維的數(shù)量，以及抑制肌纖維的生長[1]。MSTN基因多態(tài)性及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析研究最早于哺乳動物中進行，綿羊、豬、中國肉牛等[7-11]均已發(fā)現(xiàn)突變位點與生長性狀之間存在相關(guān)性。近年來，在鯉魚、羅非魚、黃顙魚、圓斑星鰈、鱸魚、鳙魚等[3，12-18]重要的水產(chǎn)動物中也開展了相關(guān)研究。唐永凱等在吉富羅非魚中篩選到1個與增質(zhì)量顯著相關(guān)的SNP位點[13]。朱媛媛等、陳校輝等先后對黃顙魚MSTN基因進行研究，均發(fā)現(xiàn)了造成不同個體間生長性狀顯著性差異的SNP位點[14-15]。

本研究在斑點叉尾MSTN基因中共篩選到4個SNP位點，其中1個SNP位點位于第二外顯子，其余3個均位于內(nèi)含子區(qū)域。將篩選到的SNP位點與生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明SNP g.4355 C>G與生長性狀顯著相關(guān)。具有GG型個體的體質(zhì)量、體長顯著低于CC型和CG型， GG型個體的平均體質(zhì)量、平均體長分別比4個家系所有個體體質(zhì)量、體長的平均值小30%、10%。4個家系中的個體以CC型和CG型為主，具有GG型的個體較少。綜合推測該位點GG型屬于隱性突變，由于該位點堿基突變造成MSTN基因的表達量升高，進而抑制了斑點叉尾的生長。這種現(xiàn)象也存在于豬[9]、牛[11]、紅鰭東方鲀[3]的研究中。

本研究獲得的與生長性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點位于內(nèi)含子區(qū)域。盡管內(nèi)含子不具有編碼蛋白質(zhì)的能力，但其發(fā)生單核苷酸突變能夠顯著影響基因的表達效率。已有研究表明，內(nèi)含子的功能主要為轉(zhuǎn)錄調(diào)控，即在轉(zhuǎn)錄階段對相應(yīng)的基因進行調(diào)控進而影響生長性狀[19]。越來越多的試驗結(jié)果證明，內(nèi)含子在調(diào)控mRNA剪切、轉(zhuǎn)錄、基因表達方面起著重要作用[20-21]，例如內(nèi)含子長鏈非編碼RNA（intronic lncRNA）發(fā)生單核苷酸突變將使其調(diào)控的轉(zhuǎn)錄本表達水平發(fā)生改變。然而，本研究中該SNP位點參與調(diào)控MSTN基因功能的具體機制有待進一步研究。