泥文娟，張書(shū)琦，王曉艷,3，賈文匯，張明亮，李 琨，唐進(jìn)法,,3，李偉霞,,3

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 1.藥學(xué)院、2. 第一附屬醫(yī)院中藥臨床評(píng)價(jià)技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室、 3. 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046)

腦中風(fēng)(也稱(chēng)腦卒中)因其高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)，已成為危害人類(lèi)健康的重大疾病，且近年來(lái)呈現(xiàn)發(fā)病率上升，發(fā)病年齡提前的趨勢(shì)[1]。缺血性中風(fēng)在腦中風(fēng)中占比較大，對(duì)急性期的有效治療是降低腦中風(fēng)患者向后遺癥期發(fā)展的關(guān)鍵?，F(xiàn)有臨床證據(jù)表明，與西醫(yī)治療相比，中醫(yī)藥在腦中風(fēng)的整體治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)理論認(rèn)為，從瘀論治缺血性中風(fēng)是基本療法[2]。研究表明，理血類(lèi)活血藥對(duì)當(dāng)歸-川芎是缺血性中風(fēng)的核心藥味和藥對(duì)[3]。當(dāng)歸能補(bǔ)血活血，川芎能行氣散血，二藥相使配對(duì)可活血、養(yǎng)血、行氣三者并舉，使祛瘀而不耗傷氣血，養(yǎng)血而不致血壅氣滯。當(dāng)歸-川芎配伍不僅是臨床常用經(jīng)典活血化瘀藥對(duì)(佛手散、芎歸散、芎湯、中成藥舒腦欣滴丸等)，還是治療缺血性中風(fēng)的經(jīng)典方藥補(bǔ)陽(yáng)還五湯和腦心通膠囊等的重要組成。

Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase-sinal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)作為人體重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它的缺陷和異?；罨c多種疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系正日益受到人們的關(guān)注。有研究表明，該通路的激活與腦缺血/再灌注(I/R)損傷的病理生理過(guò)程密切相關(guān)[4]，但當(dāng)歸-川芎藥對(duì)如何通過(guò)調(diào)節(jié)JAK/STAT通路家族成員或上下游因子的表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不清楚。故本研究采用線(xiàn)栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)致I/R損傷動(dòng)物模型，觀察當(dāng)歸-川芎藥對(duì)的活血化瘀和腦保護(hù)作用，并探討其對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康♀ ，SD大鼠，體質(zhì)量(220±20)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。

1.2 藥物與試劑當(dāng)歸(批號(hào)18110101)，購(gòu)自鄭州瑞龍制藥股份有限公司；川芎(批號(hào)171229)，購(gòu)自安徽石田中藥飲片有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部陳天朝主任藥師鑒定，符合2015版《中國(guó)藥典》一部相關(guān)規(guī)定。尼莫地平片(批號(hào)BJ43395)，購(gòu)自拜耳醫(yī)藥保健有限公司；2%TTC染色液(批號(hào)20190723)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；甲醛溶液(批號(hào)20190101)購(gòu)于煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；大鼠核因子κB(NF-κB)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)ELISA試劑盒均購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司(批號(hào)0711E19)；丙二醛(MDA)測(cè)試盒(批號(hào)20191006)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒(批號(hào)20190930)、谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)試盒(批號(hào)20190927)和總蛋白定量(考馬斯亮藍(lán)法)測(cè)試盒(批號(hào)20190726)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗ERK1/2(批號(hào)00077469)、兔抗JAK2(批號(hào)00046735)、兔抗AKT(批號(hào)00077916)購(gòu)自Proteintech中國(guó)公司；兔抗p-STAT3購(gòu)自Cell Signaling Teachnology公司；SP9000試劑盒和DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉生物工程有限公司。

1.3 儀器Neofuge 1600R型臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器股份有限公司)；S10型手提式高速分離器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；元素型18120 Molecular(摩爾)超純水系統(tǒng)(上海摩勒科學(xué)儀器有限公司)；SHP-250型生化培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；BS224S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；L3200型線(xiàn)栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司)；DHG-9031型電熱恒溫水浴箱(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.4 藥物的制備取當(dāng)歸和川芎藥材各1 kg混合，加10倍量體積的50%乙醇冷凝回流提取3次，每次2 h，將3次濾液合并，減壓濃縮至稠浸膏，稱(chēng)重為1 340 g，計(jì)算得到當(dāng)歸-川芎藥對(duì)的生藥量為1.49 g生藥/g浸膏。

1.5 大鼠腦缺血/再灌注模型的制備參照Z(yǔ)ea Longa的線(xiàn)栓法[5]加以改良制備大鼠MCAO致腦缺血-再灌注(I/R)損傷動(dòng)物模型，大鼠禁食12 h后，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(0. 35 mL/100 g)進(jìn)行麻醉，仰臥位固定在鼠板上，75%酒精消毒大鼠頸部手術(shù)區(qū)域，沿頸部正中縱向切口，切開(kāi)皮膚后鈍性分離組織，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，完全剝離血管表面迷走神經(jīng)。結(jié)扎CCA近心端和ECA，用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉CCA遠(yuǎn)心端，在距動(dòng)脈分叉處3 mm的CCA上剪一小口，將線(xiàn)栓有硅膠的一端從小口插入，松開(kāi)動(dòng)脈夾，快速將線(xiàn)栓經(jīng)過(guò)動(dòng)脈分叉處繼續(xù)送入ICA，當(dāng)線(xiàn)栓上的黑點(diǎn)接近動(dòng)脈分叉處時(shí)減緩進(jìn)線(xiàn)栓的速率，感到輕微阻力時(shí)停止插入。結(jié)扎固定CCA與線(xiàn)栓，在切口處給予青霉素預(yù)防感染，縫合切口，將線(xiàn)栓尾端留在皮膚外。將大鼠放在電熱毯上，缺血2 h后輕輕拔出線(xiàn)栓再灌注24 h。

1.6 動(dòng)物分組及給藥將90只大鼠隨機(jī)分為：假手術(shù)組(sham)、模型組(I/R)、GX低劑量組(GXL, 4.86 g·kg-1)、GX中劑量組(GXM, 8.10 g·kg-1)、GX高劑量組(GXH, 11.34 g·kg-1)和尼莫地平片對(duì)照組(Nimodiping，15 mg·kg-1)，每組15只。給藥組大鼠每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。于d 6晚上將大鼠禁食不禁水飼養(yǎng)，d 7按照模型制備方法造模。假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水。動(dòng)物給藥劑量按體表面積換算系數(shù)計(jì)算：人臨床用量×0.018/200×1 000×臨床等效量的倍數(shù)，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)的低、中、高劑量組分別為臨床等效量的3、5和7倍。

1.7 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1神經(jīng)功能評(píng)分 大鼠再灌注24 h后，采用Longa五分制評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分[5]：正常行走，無(wú)神經(jīng)功能缺損，0分；垂直提起時(shí)左前爪無(wú)力或未完全伸直，輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，1分；行走時(shí)轉(zhuǎn)到對(duì)側(cè)即左轉(zhuǎn)，中度局灶性神經(jīng)功能缺損，2分；行走時(shí)向左側(cè)跌倒，嚴(yán)重局灶性神經(jīng)功能缺損，3分；不能自主行走，意識(shí)低下，4分。

1.7.2腦梗死體積測(cè)定 每組大鼠取5只用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉后，使用普通采血管進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，取血后迅速斷頭取出完整腦組織，在-20 ℃冰箱中冷凍30 min，進(jìn)行2 mm連續(xù)冠狀切片，放于2% TTC染液中，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中避光染色30 min，每5 min翻面一次。腦組織染色結(jié)束后拍照記錄，其中白色部分為梗死區(qū)域，紅色部分為正常區(qū)域。

1.7.3腦組織病理學(xué)檢測(cè) 每組中另外10只大鼠用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉后，使用普通采血管進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，取血后迅速斷頭取腦組織，切取前半部分用于生化指標(biāo)含量測(cè)定，后半部分置于4%多聚甲醛中固定過(guò)夜。石蠟包埋，進(jìn)行2 μm切片，采用H&E染色法對(duì)腦組織進(jìn)行染色，并在顯微鏡下觀察腦半暗帶區(qū)病理改變。

1.7.4生化指標(biāo)測(cè)定 將大鼠大腦前半部分按質(zhì)量 ∶體積=1 ∶9加入預(yù)冷的生理鹽水，于冰上使用高速分離器制成腦組織勻漿，采用ELISA法對(duì)腦組織勻漿中NF-κB、VEGF、VACM-1、ICAM-1、PAI-1的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)；采用生化法對(duì)腦組織勻漿中MDA、SOD和GSH-Px的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。所有試劑盒均按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.7.5免疫組化檢測(cè) 將腦組織切片脫蠟，檸檬酸抗原修復(fù)，3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加山羊血清并室溫封閉內(nèi)源性生物素，分別滴加兔抗大鼠一抗(JAK2、p-STAT3、AKT、ERK1/2)、抗兔二抗、辣根酶標(biāo)記卵霉鏈白素，依次進(jìn)行DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。采用日本尼康顯微照像系統(tǒng)選取視野進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分假手術(shù)組大鼠無(wú)神經(jīng)功能損傷癥狀。模型組大鼠(n=12)中3只輕度神經(jīng)功能缺損，6只中度神經(jīng)功能缺損，3只嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損；陽(yáng)性給藥組大鼠(n=13)中3只無(wú)神經(jīng)功能缺損，5只輕度神經(jīng)功能缺損，3只中度神經(jīng)功能缺損，1只嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損；GXL組大鼠(n=14)中4只無(wú)神經(jīng)功能缺損，3只輕度神經(jīng)功能缺損，5只中度神經(jīng)功能缺損，3只嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損；GXM組大鼠(n=10)中1只無(wú)神經(jīng)功能缺損，8只輕度神經(jīng)功能缺損，1只嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損；GXH組大鼠(n=10)中4只無(wú)神經(jīng)功能缺損，3只輕度神經(jīng)功能缺損，2只中度神經(jīng)功能缺損，1只嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損(Fig 1)。結(jié)果表明，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)低、中和高劑量給藥組及陽(yáng)性藥尼莫地平均能顯著改善I/R損傷大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀。

Fig 1 Neurological function score results of each group

2.2 腦梗死體積測(cè)定假手術(shù)組大鼠腦組織染色均勻，無(wú)梗死區(qū)域。模型組和各給藥組大鼠腦組織易碎，均可見(jiàn)白色的梗死區(qū)域，且與紅色的正常腦組織之間界限不明顯(Fig 2)。

2.3 腦組織病理學(xué)檢測(cè)假手術(shù)組大鼠腦組織半暗帶區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，排列緊密整齊，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完全正常，胞核居中，未見(jiàn)空泡樣改變。模型組大鼠腦組織半暗帶區(qū)出現(xiàn)壞死、水腫、炎癥、神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞異常增大、出現(xiàn)空泡樣改變、神經(jīng)元數(shù)量減少等病理特征。與模型組比較，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)給藥組和尼莫地平組均對(duì)腦組織病理狀態(tài)有一定改善作用，其中，GXH、GXM組和尼莫地平片組的改善作用最強(qiáng)，能有效改善水腫、炎癥神經(jīng)細(xì)胞空泡變性和組織紊亂等病理狀態(tài)(Fig 3)。

Fig 2 Results of TCC staining

Fig 3 HE staining of penumbra of rat brain tissues (×40)

2.4 生化指標(biāo)測(cè)定與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中MDA、NF-κB、VEGF、PAI-1和ICAM-1表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，GSH-Px和SOD表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)給藥組能明顯下調(diào)腦缺血/再灌注大鼠腦組織中MDA、NF-κB、VEGF、PAI-1和ICAM-1的水平(P<0.05)，上調(diào)GSH-Px和SOD表達(dá)水平(P<0.05),見(jiàn)Tab 1。

2.5 腦組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)假手術(shù)組大鼠腦組織半暗帶區(qū)的JAK2和AKT主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，p-STAT3和ERK1/2表達(dá)于細(xì)胞核中(Fig 5)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織半暗帶區(qū)的JAK2和p-STAT3表達(dá)量均明顯升高，AKT表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)各給藥組的JAK2和p-STAT3表達(dá)量明顯降低，AKT和ERK1/2表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)Fig 4。

3 討論

臨床上缺血性腦中風(fēng)多為半側(cè)大腦出現(xiàn)梗死，局灶性I/R模型更符合缺血性腦血管病的特點(diǎn)。I/R引起的損傷主要由兩個(gè)方面造成，一是缺血導(dǎo)致的損傷，二是血液恢復(fù)供應(yīng)引起的繼發(fā)損傷，故I/R模型是目前研究藥物對(duì)缺血性腦血管病治療作用的常用動(dòng)物模型[6]。尼莫地平是第二代二氫吡啶Ca2+通道拮抗劑，具有親脂性，可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，顯著減少腦梗死體積和神經(jīng)元凋亡，使短暫性局灶性腦缺血的損傷降低33%，是目前腦血管疾病治療的首選藥物，已成為公認(rèn)的神經(jīng)保護(hù)藥物，故本研究選用該藥物作為陽(yáng)性對(duì)照藥[7]。

課題組前期通過(guò)臨床數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)1 ∶1配比在腦病科中最為常用[8]；且實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)1 ∶1醇提物的總活血效應(yīng)優(yōu)于水提和先水提后醇提給藥組，而醇提物中芳香酸類(lèi)和苯酞內(nèi)酯類(lèi)成分的含量在相同配比中高于先水提后醇提物及水提物組[9]。故本研究選用當(dāng)歸-川芎藥對(duì)1 ∶1醇提物來(lái)探索其對(duì)I/R大鼠的活血化瘀和腦保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸-川芎藥對(duì)及陽(yáng)性藥尼莫地平均可明顯改善I/R損傷大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，降低腦梗死面積，改善水腫、炎癥神經(jīng)細(xì)胞空泡變性和組織紊亂等病理狀態(tài)。

JAK-STAT信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條與神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的通路，與I/R發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明[10]，缺血后腦組織中JAK2和STAT3陽(yáng)性表達(dá)均上調(diào)，并激活JAK2-STAT3磷酸化，使p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)明顯增加，誘導(dǎo)腦損傷，出現(xiàn)腦水腫、梗死面積擴(kuò)大、神經(jīng)功能障礙等現(xiàn)象；而下調(diào)JAK2/STAT3信號(hào)通路可減少缺血性腦梗死，恢復(fù)血腦屏障的完整性，促進(jìn)I/R損傷后神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)組大鼠腦組織缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞中JAK2和p-STAT3表達(dá)水平較模型組均明顯降低，AKT和ERK1/2表達(dá)水平明顯升高，表明當(dāng)歸-川芎藥對(duì)可通過(guò)抑制JAK/STAT信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)大鼠I/R損傷的保護(hù)作用。

缺血性中風(fēng)急性期可快速激活免疫炎癥反應(yīng)，引起繼發(fā)性腦損傷，炎癥是I/R損傷的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[12]，NF-κB信號(hào)通路是炎癥調(diào)控中樞，與多種關(guān)鍵炎癥因子如細(xì)胞因子類(lèi)(TNF-α、IL-6)、黏附分子類(lèi)(VCAM-1、ICAM-1)等的表達(dá)有關(guān)，且血管黏附分子VCAM-1和ICAM-1水平是心腦血管疾病病變炎癥和活血效應(yīng)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[13]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)可明顯降低I/R損傷大鼠腦組織中NF-κB和ICAM-1水平，但劑量依賴(lài)性不強(qiáng)，提示抗炎是當(dāng)歸-川芎藥對(duì)改善I/R損傷的機(jī)制之一。

Tab 1 Effects of GX on biochemical indexes of brain tissue in rats n=10)

Fig 4 Immunohistochemical results of JAK2, p-STAT3, AKT, ERK1/2 in penumbra and mean optical density of rat brain tissues (×40,

氧化應(yīng)激是I/R過(guò)程中導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵機(jī)制之一，MDA是氧化應(yīng)激的特異性標(biāo)志物，SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，GSH-Px可清除體內(nèi)的脂類(lèi)氫過(guò)氧化物，三者均是氧化應(yīng)激過(guò)程中重要檢測(cè)指標(biāo)[14]。本文研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)組大鼠腦組織中MDA水平較模型組明顯降低，而GSH-Px和SOD水平明顯升高，說(shuō)明抗氧化亦是當(dāng)歸-川芎藥對(duì)保護(hù)腦組織的機(jī)制之一。

PAI是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放的活性物質(zhì)，是纖溶酶原激活物的生理性抑制劑，其在機(jī)體內(nèi)含量越高，則形成血栓的可能性就越高，危險(xiǎn)系數(shù)也會(huì)越高[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)可明顯降低模型組大鼠腦組織中PAI-1水平。VEGF是目前已知的作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長(zhǎng)因子，參與血管再生、神經(jīng)保護(hù)及缺血后神經(jīng)元再生，保護(hù)腦損傷[16]。在本研究中，當(dāng)歸-川芎藥對(duì)組大鼠腦組織中VEGF并未表現(xiàn)出促進(jìn)作用，可能因本實(shí)驗(yàn)為I/R急性期。有研究顯示，治療腦梗塞的藥物早期能改善腦功能部分原因可能是減輕了腦梗死、腦水腫及其對(duì)周?chē)M織的壓迫作用，而不是由于神經(jīng)細(xì)胞增殖代償，因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞發(fā)揮增殖、遷移，且進(jìn)一步與全腦進(jìn)行功能整合至少應(yīng)該在恢復(fù)期[17]。

綜上，本文研究結(jié)果顯示當(dāng)歸-川芎藥對(duì)可改善I/R損傷大鼠神經(jīng)功能缺損、降低腦梗死面積、改善炎性水腫等作用，其機(jī)制與調(diào)控JAK-STAT信號(hào)通路及抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)等有關(guān)，為深入探究當(dāng)歸-川芎藥對(duì)的活血化瘀及腦保護(hù)作用提供了重要參考。