高 翔，洪利凱，沈 薇 ，龔竹韻

(安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 1.普外科、2.藥劑科,安徽 合肥 230061)

壓瘡(pressure ulcers，PU)是由于局部組織長時間受壓迫導致的血流和組織營養(yǎng)的缺乏從而最終引起皮膚和皮下組織潰瘍和壞死[1]。既往研究證實，在臨床上PU是癱瘓病人的并發(fā)癥之一，具有延長患者住院時間、增加病死率以及加重診治費用等特點[2]。因此，積極探尋PU的藥物治療對于改善其臨床癥狀具有重要意義。

三石生新膏是一種中藥復方制劑，具有消腫止痛、祛腐生肌等功效。臨床實驗研究據表明三石生新膏能夠改善混合痔術后肛緣水腫、促進創(chuàng)面愈合[3]?；A研究發(fā)現(xiàn)三石生新膏能夠通過上調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，促進大鼠慢性感染性創(chuàng)面?zhèn)谟蟍4]。既往研究證實血管新生通過出芽的方式延伸出分支血管，并最終形成血管網絡。而創(chuàng)面修復愈合是一系列復雜的過程，其中新生肉芽組織的形成是影響創(chuàng)面愈合的重要因素。研究證實豐富的新生毛細血管是充實肉芽組織的關鍵步驟[5]。因此，通過調控創(chuàng)面?zhèn)谘苄律鷮τ诟纳芇U尤為關鍵。但是有關三石生新膏對PU傷口修復的影響及其作用機制尚不清楚。磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase，Akt)信號通路與血管新生密切相關。研究表明激活PI3K/Akt信號能夠上調VEGF，促進慢性感染性創(chuàng)口愈合[6]。因此，本研究擬通過局部組織缺血/再灌注損傷構建大鼠PU模型，探究三石生新膏對能否通過調控PI3K/Akt信號軸促進血管新生，從而為PU的三石生新膏臨床治療提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 雄性，SPF級，體質量(200±20)g，8周齡的SD大鼠50只，動物由安徽醫(yī)科大學實驗動物學部提供同，合格證號：SCXK(皖)2017-001，該實驗通過了動物實驗醫(yī)學倫理委員會批準。

1.1.2試劑與藥品 蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin staining，HE)染色液(碧云天生物技術公司，批號：C0105S)；VEGF檢測試劑盒(康朗生物公司，批號：KLC108.96)；VEGF兔單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology，批號：5583)；p-PI3K小鼠單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology，批號：14220)；p-Akt小鼠單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology，批號：15071)；β-actin小鼠單克隆抗體(江蘇碧云天生物技術公司，批號：5174)；一抗、二抗稀釋液(江蘇碧云天生物技術公司，批號：P0023A-100 mL)；山羊抗小鼠(江蘇碧云天生物技術公司，批號：A0286)；山羊抗兔(江蘇碧云天生物技術公司，批號：A0277)；兔SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司，批號：Sp-9001)；極超敏ECL發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天生物技術公司，批號：P0018FS)。三石生新膏：主要包括制爐甘石，煅石膏，滑石各60 g，當歸、白芨、龍血竭各20 g，冰片0.6 g，馬勃18 g，紫草、血珀各12 g，以上組分通過碾磨成成為極細粉末，并使用麻油500 g調至均勻后加入凡士林100 g制備成黏度適中的乳膏，即為三石生新膏。貝復新：重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠(珠海億勝生物制藥有限公司，國藥準字S20040001)規(guī)格：21000IU/5g/支。PI3K抑制劑LY294002(sigma公司，批號：S1737-1 mg)

1.1.3儀器 高速冷凍離心機(美國Thermo Scientific公司)；Multiskan MK2酶標儀(印度Labsystem公司))；RM2016病理切片機(德國徠卡公司)；042BR12088電泳儀(美國Bio-Rad公司)；FCM凝膠成像系統(tǒng)(美國Protein Simple公司)；BX51光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1動物造模、分組與給藥 實驗SD大鼠隨機分為假手術組(Sham)、壓瘡模型組(Model)、貝復新陽性對照組(bFGF)、三石生新膏治療組(TM)、壓瘡模型+阻斷劑組(TM+LY294002)每組各10只。大鼠術前禁食12 h，吸入乙醚麻醉，并于背部正中線處性皮膚制備。備皮后，采用手術刀縱向切開至筋膜，鈍性分離，并于大鼠背部皮下植入鐵盤(鐵盤直徑16 mm，厚度2 mm)，之后縫合筋膜和皮膚表層。體外采用金屬磁盤與大鼠體內的鐵盤產生吸壓進而造成局部性皮膚缺血。缺血2 h后，移動體外磁盤恢復血液灌流，再灌注時間0.5 h。以上缺血2 h再灌注0.5 h為一個周期，之后按照每天5個周期，連續(xù)操作3 d，最后取下大鼠體內鐵盤。Sham組大鼠僅僅采取大鼠背部正中線縱向切口以及皮膚縫合。在大鼠造模成功后，Model組大鼠對創(chuàng)面進行換藥1次，連續(xù)14 d。換藥處理方法：創(chuàng)面碘伏常規(guī)處理，外敷單層凡士林紗布，然后再創(chuàng)面上加蓋兩層消毒干紗布，膠布固定。bFGF組大鼠：對創(chuàng)面進行換藥1次，連續(xù)14 d。換藥處理方法：創(chuàng)面碘伏常規(guī)處理，外加貝復新(重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠)軟膏涂抹，而后采用凡士林紗布貼于創(chuàng)面處，最后在創(chuàng)面上加蓋兩層消毒甘紗布。TM組大鼠：對創(chuàng)面進行換藥1次，連續(xù)14 d。換藥處理方法創(chuàng)面碘伏常規(guī)處理，三石生新膏涂抹創(chuàng)面，厚度約1 mm，而后采用凡士林紗布貼于創(chuàng)面處，最后在創(chuàng)面上加蓋兩層消毒干紗布。TM+LY294002組大鼠：每天給予阻斷劑LY294002溶液腹腔注射，注射劑量為0.3 mg·kg-1·d-1，同時每天對創(chuàng)面進行換藥1次，連續(xù)14 d。換藥處理方法創(chuàng)面碘伏常規(guī)處理，三石生新膏涂抹創(chuàng)面，厚度約1 mm，而后采用凡士林紗布貼于創(chuàng)面處，最后在創(chuàng)面上加蓋兩層消毒干紗布。

1.2.2各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 在各組大鼠創(chuàng)傷建立1 d后，利用透明紙測量各時間點(3 d、7 d、14 d)的創(chuàng)面面積。其中本實驗以大鼠PU模型建立1 d后，測量的面積為創(chuàng)傷面積。利用ImageJ對各時期各組大鼠創(chuàng)傷面積進行計算。愈合面積=創(chuàng)傷面積-各時間點創(chuàng)傷面積。創(chuàng)傷面積愈合率/%=(創(chuàng)傷愈合面積/創(chuàng)傷面積)×100%。

1.2.3病理取材 觀察各組大鼠創(chuàng)面愈合情況，并于創(chuàng)傷后3 d每組隨機性選取6中大鼠進行麻醉。心臟采血后分離血漿并放置于-20 ℃冰箱保存待測。待采血完成后剪去部分創(chuàng)傷面皮膚組織，一部分使用4%的多聚甲醛固定行HE染色和免疫組化，另外一部分放置-80 ℃冰箱保存后續(xù)進行Western blot實驗。

1.2.4HE染色觀察各組大鼠創(chuàng)面病理損傷情況 取出已經固定好的各組大鼠創(chuàng)面皮膚組織，脫水、透明、包埋、石蠟切片，切片厚度約4 μm，并按照HE染色試劑盒進行創(chuàng)面皮膚染色，顯微鏡下觀察各組大鼠創(chuàng)面皮膚組織形態(tài)學變化。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定各組大鼠血漿VEGF含量 各組大鼠乙醚麻醉后，心臟采血，4 ℃，3 000 r·min-1，離心10 min，吸取上清液血漿，按照VEGF檢測試劑盒進行含量測定。

1.2.6免疫組化檢測各組大鼠創(chuàng)傷皮膚組織VEGF表達 將大鼠創(chuàng)傷皮膚組織的石蠟切片置于60 ℃烤箱內脫蠟，然后二甲苯浸洗，梯度乙醇溶液脫水。將皮膚組織切片置于10 nmol·L-1的檸檬酸鹽緩沖溶液中，90 ℃抗原修復30 min。室溫條件下，自然冷卻并用去離子水緩慢沖洗。采用3%的H2O2溶液孵育10 min后，加入10%的BSA溶液封閉20 min。加入VEGF兔單克隆抗體(工作液體積稀釋比例為1 ∶200)，4 ℃條件下孵育過夜。加入山羊抗兔二抗，室溫條件下孵育30 min。滴加DAB顯色液，顯色后拍照，觀察皮膚組織中VEGF表達水平。

1.2.7Western blot檢測創(chuàng)面組織相關蛋白表達 取各組大鼠創(chuàng)面皮膚組織，組織碾磨，裂解；BCA法測定蛋白質濃度；凝膠電泳；濕轉轉膜；上樣；用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育對應VEGF兔單克隆抗體(1 ∶1 000)，p-PI3K小鼠單克隆抗體(1 ∶1 000)，p-Akt小鼠單克隆抗體(1 ∶1 000)以及β-actin小鼠單克隆抗體(1 ∶2 000)，4 ℃過夜，孵育對應的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)1-2 h，；搖床搖晃上加TPBS洗滌3次，5 min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。VEGF、p-PI3K和p-Akt蛋白表達以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值相比反映。

2 結果

2.1 三石生新膏對大鼠創(chuàng)面愈合率的影響干預3 d后，各組大鼠創(chuàng)面部分開始出現(xiàn)結痂，組織滲透液減少，bFGF和TM組大鼠開始出現(xiàn)肉芽組織(見Fig 1)。干預7 d后，Sham組大鼠結痂皮膚脫落，創(chuàng)面皮膚顏色趨于正常，而Model組、bFGF組、TM組以及LY294002組大鼠皮膚創(chuàng)面面積明顯縮小，有豐富的肉芽組織，且創(chuàng)面外緣有大量新生皮膚。干預14 d后，bFGF組和TM組大鼠皮膚已經接近正常，僅有小部分的深層結痂Model組和LY294002組大鼠有小部分創(chuàng)面未有愈合。干預3 d、7 d、14 d，與Model組大鼠相比，TM組大鼠皮膚愈合率明顯升高(P<0.01)；與TM組相比，TM+LY294002抑制劑組大鼠皮膚愈合率降低(P<0.05或P<0.01)(Tab 1)。

2.2 三石生新膏對大鼠皮膚組織病理學特征的影響HE染色顯示Sham組大鼠皮膚形態(tài)完整，復層鱗狀上皮細胞結構排列規(guī)整，細胞間隙無炎癥細胞浸潤。Model組大鼠皮膚細胞排列紊亂，復層鱗狀上皮細胞結構模糊且部分出現(xiàn)斷裂，并伴有大量的炎癥細胞浸潤。bFGF組和TM組大鼠細胞間隙有少量的炎癥細胞浸潤且存在較多新生肉芽組織，以及豐富的毛細血管網絡與成纖維細胞。TM+LY294002組大鼠皮膚形態(tài)不完整，上皮細胞結構模糊且排列不規(guī)則，存在大量的炎癥細胞浸潤現(xiàn)象，但是皮膚組織有少量可見的新生肉芽組織以及血管(Fig 2)。

Tab 1 Effect of Sanshi Shengxin Ointment on wound healing rate in n=6)

2.3 三石生新膏對大鼠血漿VEGF含量的影響干預3 d后，ELISA檢測各組大鼠血漿VEGF含量。結果顯示與Sham組相比，Model組大鼠血漿VEGF水平明顯降低(P<0.01)。與Model組相比，bFGF組和TM組大鼠血漿VEGF水平明顯升高(P<0.01)。與TM組相比，TM+LY294002組大鼠血漿VEGF水平明顯降低(P<0.05)(Fig 3)。

2.4 三石生新膏對大鼠創(chuàng)面皮膚組織VEGF表達的影響干預3 d后，免疫組化和Western blot檢測各組大鼠創(chuàng)傷面組織VEGF表達。結果顯示與Sham組相比，Model組大鼠皮膚組織VEGF表達明顯降低(P<0.01)。與Model組相比，bFGF組和TM組大鼠皮膚組織VEGF表達明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與TM組相比，TM+LY294002組大鼠皮膚組織VEGF表達明顯降低(P<0.01)(Fig 4)。

Fig 1 Effect of Sanshi Shengxin Ointment intervention for 3 days on healing of pressure wounds

Fig 2 Effect of Sanshi Shengxin Ointment on histopathological characteristics of rat skin(400×)

Fig 3 Effect of Sanshi Shengxin Ointment on contentof plasma VEGF in

2.5 三石生新膏對大鼠皮膚組織p-PI3K、p-Akt表達的影響干預3 d后，Western blot檢測各組大鼠創(chuàng)傷皮膚組織PI3K/Akt表達。結果顯示，與Sham組相比，Model組大鼠皮膚組織p-PI3K、p-Akt表達均明顯降低(P<0.01)。與Model組相比，bFGF組和TM組大鼠皮膚組織p-PI3K、p-Akt和VEGF表達均明顯升高(P<0.01)。與TM組相比，TM+LY294002組大鼠皮膚組織p-PI3K、p-Akt表達均明顯降低(P<0.05或P<0.01)(Fig 5)。

3 討論

創(chuàng)面愈合率是判斷藥物干預PU治療效果的關鍵指標之一。既往研究已經證實止血、炎癥過度反應、細胞增殖與修復時期以及傷口重塑是PU創(chuàng)面愈合的病理生理過程[7-8]。VEGF是唯一作用于血管內皮細胞的生長因子，具有促進血管新生的作用[9]。研究表明在創(chuàng)面止血時期，血小板被激活后或促進VEGF釋放，有利于炎癥時期創(chuàng)面血管通透性增加，進而促進炎癥細胞富集于創(chuàng)面并最終清除創(chuàng)傷表面壞死物質。增殖修復時期，真皮細胞和表皮細胞開始修復，促進角質向細胞轉化釋放VEGF，促進血管內皮細胞增殖、遷移分化為具有功能性的血管網絡[10]。在創(chuàng)面重塑時期，VEGF能夠促進瘢痕組織的形成，加快創(chuàng)傷面愈合[11]。以上研究表明VEGF在PU的創(chuàng)面愈合中發(fā)揮關鍵作用。因此，通過探尋有效藥物調節(jié)VEGF表達對于治療PU至關重要。

Fig 4 Effect of Sanshi Shengxin Ointment on expressionof VEGF in rat wound skin

Fig 5 Effect of Sanshi Shengxin Ointment on expressionof p-PI3K and p-Akt in rat skin

三石生新膏源自《瘍科心得集》具有消腫止痛、祛腐生肌等功效。因此，本研究首先通過構建PU大鼠模型，探究三石生新膏對創(chuàng)面愈合的影響。結果顯示與Model組大鼠相比，三石生新膏能夠提高大鼠創(chuàng)面的愈合率，促進血管形成，加快新生皮膚產生。以往研究顯示，三石生新膏的有效成分爐甘石、煅爐甘石均能夠有效改善血液循環(huán)，加快創(chuàng)傷口新陳代謝，促進創(chuàng)面成纖維細胞增殖以及毛細血管網形成，并最終達到促進皮膚創(chuàng)面愈合[12]。HE染色顯示Sham組大鼠皮膚形態(tài)完整，復層鱗狀上皮細胞結構排列規(guī)整，細胞間隙無炎癥細胞浸潤。Model組大鼠皮膚細胞排列紊亂，復層鱗狀上皮細胞結構模糊且部分出現(xiàn)斷裂并伴有大量的炎癥細胞浸潤。bFGF組和TM+LY294002組大鼠細胞間隙有少量的炎癥細胞浸潤且存在較多新生肉芽組織以及豐富的毛細血管網絡以及成纖維細胞。以上研究結果初步表明三石生新膏能夠改善PU大鼠創(chuàng)面損傷?；赩EGF對PU創(chuàng)面愈合的關鍵性。本實驗進一步檢測了三石生新膏對PU大鼠血漿VEGF水平以及皮膚組織VEGF表達的影響。結果顯示，與Model組相比，三石生新膏能夠促進VEGF表達。但是有關三石生新膏對PU大鼠VEGF的調控機制尚不清楚。以往研究PI3K/Akt作為細胞增殖關鍵信號通路。激活PI3K/Akt能夠上調VEGF，促進創(chuàng)傷面愈合[13]。研究表明LY294002能夠抑制PI3K/Akt信號活化，能夠降低血管內皮細胞NO合成酶，繼而降低NO釋放，并最終降低血清VEGF含量[14]。此外，PI3K/Akt能夠通過激活GSK3、mTOR等上調HIF-1α表達，繼而增加VEGF表達[15]。因此，本研究通過檢測創(chuàng)面皮膚組織PI3K/Akt信號相關蛋白表達。結果顯示與Model組相比，三石生新膏組大鼠皮膚組織p-PI3K、p-Akt表達均明顯升高。提示：三石生新膏可能通過PI3K/Akt信號軸作用于VEGF，進而促進PU大鼠創(chuàng)面愈合。LY294002作為PI3K特異性抑制劑能夠有效抑制PI3K/Akt信號活化[16]。實驗結果表明，抑制PI3K/Akt信號活化能夠抑制VEGF表達，降低三石生新膏促進PU大鼠創(chuàng)面愈合。

綜上所述，本研究通過局部組織缺血/再灌注損傷法制備壓瘡大鼠模型，探究三石生新膏對PU大鼠創(chuàng)面愈合的影響及其作用機制。結果發(fā)現(xiàn)，三石生新膏能夠促進PU大鼠創(chuàng)面愈合，其機制與激活PI3K/Akt信號，促進VEGF表達相關。但是本實驗亦存在一定的不足，即未能闡明三石生新膏中何種中藥成分或是單體對PU創(chuàng)面愈合的影響。因此，在后續(xù)實驗研究中將通過分離三石生新膏的有效單體成分，體外探究其對PU血管新生的影響及其調控機制。通過以上研究將進一步明確三石生新膏的藥理學作用，繼而為PU的臨床治療提供可靠的實驗依據。