李銀霞，高 敏，白 雪，劉燕妮，張亦涵，索占偉

(蘭州大學(xué)藥學(xué)院分子藥理研究所，甘肅 蘭州 730000)

綠原酸( chorogenic acid，CGA)為金銀花、杜仲等中藥的重要有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗微生物等多種生物活性[1-2]。同時，CGA廣泛分布于咖啡豆、茶葉、水果以及蔬菜等膳食中，也是一種重要的人體機能調(diào)節(jié)物質(zhì)。研究表明，CGA具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，如減輕角叉菜膠誘發(fā)的炎性疼痛[3]、紫杉醇誘發(fā)的外周神經(jīng)痛[4]，以及神經(jīng)損傷誘發(fā)的病理性疼痛[5]。研究表明，CGA的鎮(zhèn)痛效應(yīng)主要與間接減輕炎癥級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)[6]，如通過p38、核因子κB (NF-κB) 信號通路抑制炎性介質(zhì)及細胞因子的釋放等[7]。然而，對于CGA減輕慢性病理性疼痛的確切機制尚未闡明。

慢性疼痛的形成機制十分復(fù)雜，涉及與痛覺敏感化相關(guān)聯(lián)的神經(jīng)及突觸的可塑性改變，包括離子通道、胞內(nèi)信號、支架蛋白等的重構(gòu)與修飾。其中，位于脊髓背角以及高級中樞通路中的谷氨酸能突觸傳遞的異常增強，被認為是慢性病理性疼痛的核心機制[8]。AMPA受體( alpha-amino-3-hyroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors，AMPARs)是一種重要的離子型谷氨酸受體，介導(dǎo)快速興奮性突觸傳遞，在痛覺傳遞和可塑性中發(fā)揮著重要作用。在成年動物脊髓背角，絕大多數(shù)AMPARs是由GluA1和GluA2亞基組成的同源或異源四聚體[9]。其中，包含GluA2亞基的AMPARs，對鈣離子的通透性極低，但缺乏GluA2亞基的、由GluA1組成的同源四聚體對鈣離子具有高度的通透性[10]。外周炎癥或神經(jīng)損傷可特異性增加脊髓背角神經(jīng)元中GluA1的突觸含量，提高細胞興奮性、增強突觸傳遞[11-12]。因此，GluA1是參與慢性疼痛形成的重要分子。特異性抑制GluA1的活性或基因敲除GluA1，可顯著減輕痛覺敏感化癥狀[13]。為探討綠原酸對慢性疼痛可能的鎮(zhèn)痛作用及其與AMPA受體的關(guān)系，本研究利用CFA誘發(fā)小鼠機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏為模型，考察CGA對慢性疼痛癥狀的影響，并利用免疫印跡法，探討CGA對疼痛動物AMPA受體可能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 雄性昆明成年小鼠，體質(zhì)量(20-22)g，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(甘) 2005-0007。飼養(yǎng)于12 h明暗交替、(22-24)℃環(huán)境，自由飲水、進食。

1.1.2主要試劑 綠原酸(chorogenic acid，CGA，Sigma，批號WXBD1890V)；完全弗氏佐劑( complete Freund’s adjuvant，CFA，Sigma，貨號 F5881)；抗兔GluA1-pS831抗體、抗兔GluA1-pS845抗體、抗鼠β-actin抗體( Sigma 公司，貨號 AB5847、AB5849、A1978)；抗兔GluA1抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、ECL發(fā)光試劑盒( Beyotime Biotech公司，貨號 AF2473、A0216、A0208、P0018AM )；抗兔GluA2抗體( Boster Biological Tech公司，貨號 A02905)。

1.1.3儀器 Von Frey纖維(規(guī)格：2.36，2.44，2.83，3.22，3.61，3.84，4.08，4.17，Stoelting Wood Dale)；PL-200型熱測痛儀(成都泰盟科技有限公司)；DYY-7C電泳儀(北京六一儀器廠)；JA2003精密電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；YLS-4C小鼠轉(zhuǎn)棒儀(上海欣軟信息技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1機械性縮足閾值( paw withdrawal threshold，PWT)測定 利用Up-Down法[14]，采用盲法測定小鼠PWT。藥物處理前，將小鼠置于測試籠中，使其適應(yīng)環(huán)境1 h。測定時，將Von Frey纖維垂直作用于小鼠后足底皮膚表面，使其彎曲，并停留5 s。利用公式“50% PWT (g) = 10[Xf+Kδ]/10 000”進行計算，Xf 為最后一個有效值所對應(yīng)纖維的克數(shù)，δ=0.22。為觀察CGA對炎性小鼠PWT的影響，在連續(xù)測定2 d的基礎(chǔ)值后，于后足底皮下注射CFA，1 d后，鞘內(nèi)給予50、100、200 ng CGA。每隔15 min測定一次PWT，連續(xù)監(jiān)測1 h.

1.2.2熱縮足潛伏期(paw withdrawal latency，PWL)測定 將小鼠提前置入觀察室中，使其適應(yīng)環(huán)境1 h。測試前，調(diào)制刺激強度為0.30，斷電時間為10 s。測試時，將光束對準小鼠后足底表面，以傳遞熱刺激。當小鼠出現(xiàn)縮足時，儀器自動記錄自加熱開始至出現(xiàn)縮足所用的時間，即縮足潛伏期。間斷性測定3次，計算平均值。每2次測量之間至少間隔2 min，以免連續(xù)熱刺激造成誤差。給藥后的測定均采用盲法。為觀察CGA對炎性小鼠PWL的影響，設(shè)立與上述PWT測定相同的給藥方案和時間點，監(jiān)測PWL的變化。

1.2.3運動機能測試 利用小鼠轉(zhuǎn)棒儀測試小鼠的運動機能。將小鼠放在轉(zhuǎn)棒上，運行儀器，記錄小鼠墜落時的轉(zhuǎn)速，即最大轉(zhuǎn)速[15]。試驗前，使小鼠適應(yīng)轉(zhuǎn)棒運動，每天至少練習3次，連續(xù)適應(yīng)2 d。在測試時，連續(xù)記錄3次的最大轉(zhuǎn)速值，并計算平均值。為觀察CGA是否對運動機能產(chǎn)生影響，在每隔15 min連續(xù)測定兩次基礎(chǔ)值后，鞘內(nèi)給予200 ng CGA，再每隔15 min測定一次，連續(xù)測定1 h。

1.2.4疼痛模型的制備 連續(xù)檢測2 d的PWT和PWL基礎(chǔ)值后，將25 μL CFA懸液緩慢注入小鼠后足底皮下。1 d后，檢測PWT和PWL。與基礎(chǔ)值相比，PWT和PWL顯著降低者，視為建模成功。

1.2.5鞘內(nèi)給藥 小鼠背部剃毛、消毒后，沿L5-L6椎骨間隙，將30 G針頭的微量注射器針頭垂直刺入蛛網(wǎng)膜下腔，以小鼠輕微擺尾作為給藥成功的標志[15]，緩慢推注5 μL藥物。

1.2.6富含突觸后致密質(zhì)組分的提取 在參照本實驗室先前建立的方法[16]，提取脊髓背角富含突觸后致密質(zhì)( postsynaptic density，PSD)的組分，以檢測蛋白的突觸含量。將小鼠隨機分為3組，第1組在雙后足底皮下注射生理鹽水，1 d后，鞘內(nèi)注射生理鹽水；第2、3組雙后足底皮下均注射CFA，1 d后，第2組小鼠鞘內(nèi)給予生理鹽水，第3組小鼠鞘內(nèi)給予100 ng CGA。在鞘內(nèi)給藥15 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉( 60-90 mg·kg-1)以深度麻醉小鼠，隨后分離L4-L5節(jié)段脊髓，將其快速移入冰冷、充95% O2/5% CO2的人工腦脊髓液中。顯微鏡下剝膜后，剪取背角，在4 ℃裂解液( 10.0 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.6，320 mmol·L-1Sucrose，5.0 mmol·L-1EDTA，10 g·L-1PMSF，proteases/phosphatases inhibitors cocktail)中勻漿。經(jīng)1 000×g離心10 min后，收集上清。上清經(jīng)10 000×g離心15 min，收集沉淀。將含0.5% TritonX-100的裂解液再次加入至上述沉淀中，經(jīng)輕微吹打后，4 ℃裂解30 min。32 000×g離心20 min后，得到富PSD的組分P3。在P3中加入SDS上樣緩沖液，100 ℃煮5 min后，用于Western blot免疫印跡檢測。

1.2.7免疫印跡 蛋白樣品用8% SDS-PAGE凝膠經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%的脫脂牛奶封閉30 min后，PBST洗3次，每次10 min。加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日，經(jīng)PBST 3次洗滌后，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。再經(jīng)PBST 3次洗滌后，ECL顯色、拍片。所使用的抗體濃度為：GluA1-pS831(1 ∶1 000)；GluA1-pS845(1 ∶500)；β-actin(1 ∶600)；GluA1(1 ∶400)；GluA2(1 ∶1 000)。

1.2.8磷酸化檢測 采用“1.2.6”中的分組方法處理動物并分離脊髓背角。利用RIPA裂解液將分離出的脊髓背角進行全細胞勻漿，在4 ℃搖床裂解40 min后，14 000×g離心10 min，收集上清，加入SDS上樣緩沖液。經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜后，加入相應(yīng)的GluA1的磷酸化特異性抗體，進行免疫印跡，得到磷酸化印跡條帶。再將PVDF膜進行Strip，重新加入GluA1抗體后，免疫印跡得到總蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 CGA對機械性痛覺超敏的影響行為學(xué)結(jié)果顯示( Fig 1)，正常小鼠在后足底皮下注射(i.d.)CFA后，PWT逐漸下降，并在1 d后穩(wěn)定在較低水平，說明誘發(fā)了機械性痛覺超敏。鞘內(nèi)注射(i.t.)3種劑量的CGA后，PWT出現(xiàn)不同程度的提高。低劑量CGA( 50 ng)作用15 min后，與生理鹽水組相比，PWT顯著升高(P<0.05)，隨后迅速下降；中劑量組( 100 ng)在CGA注射后的各時間點，PWT值均顯著高于生理鹽水組，并在15 min內(nèi)出現(xiàn)峰值(P<0.01)；高劑量CGA( 200 ng) 可更為顯著地提升炎性小鼠的PWT，表明CGA可劑量依賴性減輕CFA所誘發(fā)的機械性痛敏癥狀。

Fig 1 Effects of CGA on mechanical allodynia induced by CFA n=6)

2.2 CGA對熱痛覺過敏的影響結(jié)果顯示( Fig 2)，正常小鼠在皮下注射CFA后，PWL也出現(xiàn)下降，并在1 d后穩(wěn)定在較低水平，說明誘發(fā)了熱痛覺過敏。鞘內(nèi)給予CGA后，疼痛小鼠的PWL也明顯升高，并表現(xiàn)出與PWT變化相近的劑量依賴性和時效關(guān)系。

Fig 2 Effects of CGA on thermal hyperalgesia

2.3 CGA對正常動物基礎(chǔ)痛閾、運動機能的影響鞘內(nèi)給予高劑量的CGA(200 ng)后，正常小鼠的PWT(Fig 3A)、PWL(Fig 3B)均未發(fā)生改變。在鞘內(nèi)給予CGA(200 ng)后的各時間點，小鼠在轉(zhuǎn)輪運動時所能承受的最大轉(zhuǎn)速也未發(fā)生改變(Fig 3C)，表明測試劑量的CGA對小鼠的運動機能并未造成影響。

2.4 CGA對炎性小鼠AMPA受體突觸表達的影響免疫印跡結(jié)果顯示(Fig 4)，小鼠后足底注射CFA 1 d后，與注射生理鹽水的對照組相比，GluA1亞基的突觸含量明顯升高(P<0.01)，但GluA2亞基保持不變(P>0.05)，說明CFA可特異性誘導(dǎo)突觸中GluA1的表達亢進。鞘內(nèi)給予中劑量CGA(100 ng) 作用15 min后，與鞘內(nèi)給予生理鹽水的CFA組相比，GluA1的突觸表達水平明顯降低(P<0.05)，表明CGA可有效逆轉(zhuǎn)CFA所誘發(fā)的GluA1的突觸表達亢進。

Fig 3 Effects of CGA on basic pain thresholds and motor function of normal animals n=6)

Fig 4 Effects of CGA on synaptic expressions of GluA1 and GluA2 of inflamed mice n=6)

2.5 CGA對炎性小鼠GluA1磷酸化的影響結(jié)果顯示(Fig 5)，小鼠后足底注射CFA 1 d后，脊髓背角GluA1的第845位( Ser845)和第831位的絲氨酸殘基( Ser831)的磷酸化水平均明顯升高(P<0.01)。給予中劑量CGA(100 ng)作用15 min后，與鞘內(nèi)給予生理鹽水的CFA組相比，GluA1-845的磷酸化水平明顯降低(P<0.05)，而GluA1-831的磷酸化水平基本不變(P>0. 05)，表明CGA可特異性逆轉(zhuǎn)CFA所誘發(fā)的GluA1-845的過磷酸化。

3 討論

本研究利用痛行為學(xué)測試發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)給予CGA可劑量依賴性地抑制CFA所誘發(fā)的機械性痛覺超敏與熱痛覺過敏，證實了CGA確實對慢性疼痛癥狀具有改善作用。與之前的報道[17]基本一致的是，CGA的起效較為迅速，在15 min內(nèi)即可達到峰值，隨后其效應(yīng)迅速下降。這一結(jié)果提示，CGA可能并非只通過間接抑制炎癥反應(yīng)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。更為重要的是，CGA可能通過某種更為快速的方式調(diào)節(jié)痛覺傳遞或可塑性。本研究發(fā)現(xiàn)，CGA可快速、特異性地抑制炎性小鼠GluA1亞基的突觸表達，提示：逆轉(zhuǎn)AMAP受體的功能亢進是CGA改善慢性病理性疼痛的一個重要機制。

Fig 5 Effects of CGA on phosphorylations of GluA1-Ser845 and GluA1-Ser831 of inflamed mice n=6)

研究顯示，AMPA受體亞基的C-末端存在多個磷酸化修飾位點，這些位點的磷酸化與去磷酸化在受體的運輸和突觸定位中起到關(guān)鍵性作用。其中，GluA1亞基的第831位Ser(GluA1-Ser831)和第845位Ser(GluA1-Ser845)的磷酸化尤為重要。外周炎癥或組織損傷可明顯提高脊髓背角神經(jīng)元中GluA1的這兩個位點的磷酸化水平，引發(fā)GluA1在突觸的大量聚集和通道的異常開放，導(dǎo)致突觸傳遞的異常增強，形成痛覺敏感化。值得關(guān)注的是，GluA1的磷酸化同時受到蛋白激酶和磷酸酶的雙重調(diào)控。其中，GluA1-Ser845受到蛋白激酶A( PKA)和鈣依賴性蛋白磷酸酶-2B( PP2B)的雙重調(diào)控。PKA的激活或PP2B的失活，均可提高GluA1-Ser845的磷酸化水平。提高PP2B的活性可抑制GluA1的磷酸化及痛敏癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)，CGA可逆轉(zhuǎn)GluA1-Ser845的過磷酸化。因此，CGA對GluA1的調(diào)控作用可能與其影響GluA1-Ser845的磷酸化有關(guān)。因此，CGA很可能通過活化PP2B，降低GluA1-Ser845的磷酸化，從而逆轉(zhuǎn)疼痛動物的GluA1受體的突觸表達亢進，進而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)。