張 婷，丁永芳，彭蘊茹

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028)

肝臟纖維化是指肝細胞出現(xiàn)壞死及炎癥刺激后，肝臟內(nèi)大量纖維結(jié)締組織異常增生，膠原合成與降解異常的病理過程。肝纖維化是發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段，因此，有效阻斷肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，對防治肝硬化及肝癌具有重要意義。肝纖維化是肝內(nèi)多種細胞及多個因素共同作用的結(jié)果，而肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)在其中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。持續(xù)的損傷刺激肝臟內(nèi)免疫細胞釋放炎癥因子，HSC由靜止轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)，最終具有肌成纖維樣細胞表型[1]。HSC是肝臟內(nèi)主要的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)生成細胞，活化的HSC主要特征為強增殖力，表型改變，ECM異常累積[2]。持續(xù)不斷的ECM沉積導致肝臟臟器損傷，失去基本生理功能。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor，TGF-β1)是目前研究較多的一種促纖維化細胞因子，參與肝病各個階段并發(fā)揮重要作用[3]。而脂多糖(lipopolyscaccharide，LPS)是一種細胞毒素，可以釋放炎性細胞因子，對HSC也有一定的激活作用，可參與肝臟損傷-炎癥-纖維化的過程[4]。有研究[5]顯示，TGF-β1與LPS可以分別激活LX-2細胞建立體外纖維化模型，促進纖維化的進程，但其協(xié)同作用的具體機制尚不清楚。

活化的HSC大量表達TGF-β1，Smad是TGF-β1下游靶點，主要是通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號通路推動纖維化進程[6-7]。Smad家族中Smad2，Smad3活化后主要分布在細胞核內(nèi)，持續(xù)活化HSC，增加合成ECM蛋白的表達，自分泌大量TGF-β1持續(xù)激活HCS，加速肝纖維化進展。因此，研究TGF-β1/Smad信號通路對于闡釋藥物抗肝纖維化作用機制有重要意義。

白首烏是傳統(tǒng)補益類中藥，C-21甾體是從白首烏中發(fā)現(xiàn)的數(shù)量最多、也是最主要的活性成分。本課題組前期研究[8-9]表明，白首烏C-21甾苷(TCSG)具有顯著的抗肝纖維化作用。但迄今為止，白首烏C21甾苷對肝星狀細胞活化的影響及作用機制尚未深入研究。本研究擬采用TGF-β1聯(lián)合LPS誘導人肝星狀細胞LX-2的活化從而模擬體外肝纖維化發(fā)病過程，并在此基礎(chǔ)上研究TCSG對LX-2活化的影響，以及通過TGF-β1/Smad信號通路闡明TCSG發(fā)揮抗肝纖維化的內(nèi)在分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑，儀器及細胞 白首烏C-21甾體總苷(TCSG)提取物由本院中藥資源研究室錢仕輝教授課題組提取并經(jīng)比色法測定C-21甾體總苷的質(zhì)量分數(shù)為52.89%。脂多糖(Sigma，Lot：L2880-100MG)；TGF-β1(PEPRO TECH，Lot：1218209)；Alexa FluorTM488 donkey anti-rabbit IgG(H+L)(Invitrogen，Lot：2045215)；BCA蛋白濃度測定增強型試劑盒(碧云天，Lot：091919200430)；GAPDH、α-SMA、NF-κB、IκB-α、p-Smad3(Cell Signaling，批號分別為：#2118、#19245、#8242、#2859、#9520)；p-Smad2、Smad2、Smad3、TGF-β1(Abcam，批號分別是：ab53100、ab40854、ab40854、ab92486)；二抗山羊抗兔IgG(Jackson Immuno Research，Lot：147832)；羥脯氨酸試劑盒(堿)(南京建成生物工程研究所，A030-2-1)；DMEM(HyClone，Lot：AE29423688)；胎牛血清(Gibco，Lot：2166451)。Millicell EZ SLIDE(MILLIPORE)；倒置熒光顯微鏡(LEICA，DMi8)，酶標儀(Thermo，Multiskan FC)，電泳儀器(Bio-Rad)。人肝星狀細胞株(LX-2)購于中南大學。

1.2 實驗方法

1.2.1LX-2細胞培養(yǎng) LX-2在含1%雙抗和10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2-3 d換液一次，在顯微鏡下觀察直到細胞密度達到對數(shù)生長期后進行傳代及凍存。

1.2.2MTT法檢測細胞活力 取密度為8×106個·L-1的細胞懸液，100 μL/孔加入96孔培養(yǎng)板中，每組6個復孔。實驗分為對照組和不同濃度(20、40、60、80、100 mg·L-1)TCSG藥物組，除對照組外，其余每組加入相應濃度的TCSG，分別孵育24、48、72 h后，加入20 μL新鮮配制的MTT(5 g·L-1)溶液37 ℃孵育4 h，小心棄去上清液，每孔中加入200 μL的DMSO溶液，振搖10 min，保證藍色甲瓚充分溶解于DMSO中，設(shè)定波長490 nm，采用全自動酶標儀，在相應的波長下讀取并記錄吸光度值。

1.2.3細胞免疫熒光染色法觀測α-SMA表達情況 取密度為4×106個/L的細胞懸液，接種于Millicell EZ SLIDE (8-well glass)培養(yǎng)板中，300 μL/孔，培養(yǎng)24 h后進行分組和藥物處置。實驗設(shè)對照組，TGF-β1+LPS組，TGF-β1+LPS聯(lián)合 不同濃度的TCSG藥物干預(10、20、40 mg·L-1)組。TGF-β1+LPS組分別加入終濃度為10 μg·L-1的TGF-β1和10 mg·L-1的LPS，藥物干預組在加入誘導劑TGF-β1和LPS同時，加入終濃度為10、20、40 mg·L-1的TCSG，對照組加入相應體積的DMEM。處理24 h后，PBS洗滌3次/5 min，4%多聚甲醛冰上固定20 min，PBS洗滌3次/5 min，0.5% Triton X-100冰上透化15 min，含3% BSA的PBS室溫封閉45-60 min。一抗(抗α-SMA抗體1 ∶200)4 ℃孵育過夜。次日，室溫孵育30 min，暗室熒光二抗(Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG(H+L)1 ∶500)室溫孵育1 h。核染料DAPI(5 mg·L-1)染細胞核，室溫孵育5 min后用PBS緩沖液洗滌3次/5 min，每孔隨機選擇3個視野熒光顯微鏡下拍攝。

1.2.4羥脯氨酸含量檢測 取細胞密度為8×106個/L細胞懸液，接種于12孔培養(yǎng)板中，每組3個復孔。24 h后藥物處置方法同“1.2.3”，24 h后收集各孔培養(yǎng)液上清，按照羥脯氨酸堿水解法檢測試劑盒說明書操作流程，檢測細胞上清液中的羥脯氨酸含量變化情況。

1.2.5Western blot 實驗分組同“1.2.4”。收集細胞加入細胞裂解液200 μL/孔，冰上裂解30 min。期間每10 min用移液器吹打至混懸狀態(tài)。在4 ℃條件下，以12 000 r·min-1離心15 min，小心吸取上清液。100 ℃變性10 min，取等量蛋白質(zhì)進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后室溫封閉1 h，棄掉牛奶，一抗4 ℃過夜。次日，回收一抗，室溫孵二抗1 h，洗膜3次，ECL化學發(fā)光顯影液顯影。蛋白條帶采用ImageJ軟件檢測灰度值，通過目標蛋白與內(nèi)參蛋白(GAPDH)灰度值比較分析。

2 結(jié)果

2.1 TCSG對LX-2細胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示：與對照組相比較，不同濃度的TCSG(20、40、60、80、100 mg·L-1)處理LX-2細胞24 h，細胞增殖沒有明顯抑制作用；處理LX-2細胞48 h，與對照組比較，40、60、80、100 mg·L-1TCSG均對細胞增殖有顯著抑制作用(P<0.05,P<0.01)；處理細胞72 h，各個濃度TCSG(20、40、60、80、100 mg·L-1)均顯著抑制細胞增殖(P<0.05,P<0.01)。實驗結(jié)果表明一定濃度的TCSG作用于細胞48 h以上，可以抑制肝星狀細胞LX-2的增殖，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，所以后續(xù)實驗選擇10、20、40 mg·L-1TCSG作為抑制LX-2細胞活化的濃度，以避免藥物產(chǎn)生毒性。

2.2 TCSG對活化的LX-2細胞α-SMA表達的影響免疫熒光染色結(jié)果如Fig 2所示，綠色熒光的深淺表示α-SMA蛋白在LX-2細胞內(nèi)的表達水平，綠色越深，分布越密集，表明α-SMA蛋白表達水平越高，DAPI染胞核呈藍色熒光。對照組呈現(xiàn)微弱的綠色熒光，分散稀疏，表示α-SMA的蛋白表達水平較低；TGF-β1聯(lián)合LPS處理LX-2細胞24 h，綠色熒光強度明顯增強，表示α-SMA蛋白表達水平較高；10、20、40 mg·L-1TCSG處理LX-2細胞24 h，綠色熒光強度明顯減弱，表示α-SMA蛋白表達水平降低。說明TGF-β1聯(lián)合LPS刺激提高了LX-2細胞中α-SMA蛋白表達，10、20、40 mg·L-1TCSG可以降低α-SMA在LX-2細胞內(nèi)的表達水平。

Fig 1 Effect of TCSG on cell

Fig 2 Expression of α-SMA in LX-2 cells observedby immunoflouresence(×400)

2.3 TCSG對活化的LX-2細胞HYP含量的影響如Fig 3所示，與對照組相比較，模型組中LX-2細胞上清液HYP含量升高(P<0.01)。與模型組相比較，TCSG藥物組中LX-2細胞上清液HYP含量降低(P<0.05)。提示TCSG具有劑量依賴性降低LX-2細胞上清液HYP水平。

2.4 TCSG處理組對LX-2纖維化及炎癥相關(guān)蛋白表達的影響與對照組相比，模型組LX-2細胞上TGF-β1、NF-κB、α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量升高(P<0.05)。IκB-α蛋白相對表達明顯降低。與模型組相比，TCSG藥物組LX-2細胞上TGF-β1、NF-κB、α-SMA、p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量明顯降低，而IκB-α蛋白相對表達量升高(P<0.05)(Fig 4A，B)。提示TCSG可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號通路抑制LX-2細胞活化發(fā)揮抗肝纖維化作用。

Fig 3 Effect of TCSG on hydroxyproline content

Fig 4 Effects of TCSG on protein expression of TGF-β1,α-SMA,NF-κB,IκB-α,p-Smad2/Smad2 and

3 討論

肝星狀細胞(HSC)活化，細胞外基質(zhì)(ECM)異常沉積，最終導致肝纖維化。多項研究[10-11]表明，TGF-β1是目前研究最多的導致纖維化的細胞因子，在細胞外，胞質(zhì)與胞核內(nèi)均有表達。體內(nèi)TGF-β1可以通過旁分泌及自分泌激活HSC細胞，大量產(chǎn)生α-SMA及膠原等，推動肝纖維化發(fā)展。有研究[12]表明，Smad信號通路是TGF-β1調(diào)控的主要細胞內(nèi)信號通路。TGF-β1與細胞表面TGF-β受體結(jié)合，激活下游Smad家族中Smad2、Smad3，導致Smad2和Smad3磷酸化，增加纖維化標志物α-SMA，TGF-β1蛋白表達及膠原合成，活化HSC細胞[13-14]。有文獻[15-16]表明，LPS通過刺激HSC細胞，引起炎癥反應，大量分泌促炎性因子，激活HSC細胞。其中NF-κB是LPS誘導炎癥發(fā)生過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)多種炎癥因子的基因表達。其中IκB-α是存在于細胞質(zhì)中的NF-κB抑制因子，通常情況下與NF-κB結(jié)合形成無活性的復合物，當對刺激做出反應時，IκB-α被IκB激酶磷酸化后轉(zhuǎn)移并降解[17-18]?；罨腘F-κB信號通路激活TGF-β1的表達，持續(xù)活化HSC，上調(diào)纖維化標志物α-SMA蛋白表達。

基于本課題組前期體內(nèi)實驗研究表明白 首烏C-21甾苷抗肝臟纖維化的工作基礎(chǔ)，本實驗以體外人肝星狀細胞(LX-2)纖維化模型為研究對象，進一步研究TCSG調(diào)控NF-κB/TGF-β1/Smads信號通路抗肝纖維化的內(nèi)在分子機制。TGF-β1聯(lián)合LPS建立體外肝纖維化模型，免疫熒光結(jié)果顯示纖維化標志物α-SMA蛋白表達升高，細胞上清液中羥脯氨酸含量增加，Western blot結(jié)果顯示LX-2細胞中TGF-β1、NF-κB、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白比值表達升高，IκB-α蛋白表達降低。TCSG干預后，免疫熒光結(jié)果顯示纖維化標志物α-SMA表達明顯降低，細胞上清液中羥脯氨酸含量降低，Western blot結(jié)果顯示LX-2細胞中TGF-β1、NF-κB、Smad2、Smad3與其磷酸化蛋白比值表達降低，IκB-α蛋白表達升高。

綜上所述，中藥白首烏主要成分TCSG對TGF-β1及LPS共同誘導的體外肝纖維化模型具有明顯的干預作用?？赡苁峭ㄟ^抑制Smad2與Smad3蛋白磷酸化水平，下調(diào)TGF-β1、α-SMA、NF-κB蛋白表達，抑制IκBα降解，調(diào)控NF-κB/TGF-β1/Smad信號通路，抑制人肝星狀細胞活化起到抗纖維化作用。