方 健，朱桂行，童金枝，楊宇凡，張建輝，朱甜甜，尚嬌嬌，童 麗，孫 敏

(1. 安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601；2. 潁上縣人民醫(yī)院病理科，安徽 阜陽 236200； 3. 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中藏藥研究中心，青海 西寧 810016)

糖尿病是一種因胰島素分泌不足和(或)胰島素抵抗所引起的代謝性疾病[1]。隨著居民生活水平的上升，高糖高脂飲食產(chǎn)生的糖脂毒性可損傷胰島β細(xì)胞功能，造成2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[2]。研究表明，保護(hù)胰島細(xì)胞損傷是治療糖尿病的根本環(huán)節(jié)[3]，而氧化應(yīng)激是導(dǎo)致胰島細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/血紅素氧合酶(heme oxygenase-1，HO-1)信號(hào)通路是細(xì)胞重要的防御系統(tǒng)，可抵抗氧化應(yīng)激，因此激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路能預(yù)防或減輕糖尿病腎病的進(jìn)展。

懸鉤子屬植物的降血糖活性已在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中得到報(bào)道，并與升高胰島素水平有關(guān)[4]，但是懸鉤子屬植物中起降糖作用的活性成分及作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期采用β細(xì)胞膜固相色譜法對(duì)秀麗莓的活性成分進(jìn)行篩選，結(jié)果表明原花青素(proanthocyanidins，PC)B和C為保護(hù)胰島β細(xì)胞的活性成分，本實(shí)驗(yàn)將通過建立C57BL/6糖尿病小鼠模型進(jìn)一步研究秀麗莓原花青素對(duì)糖尿病小鼠胰腺組織的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑二甲雙胍片購(gòu)自上海施貴寶制藥有限公司(批號(hào)：H20023370)；TC、TG、HDL-C、LDL-C測(cè)試盒購(gòu)自南京建成研究所(批號(hào)：A111-1-1、A110-1-1、A113-1-1、A112-1-1)；STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：S0130)；Nrf2抗體、HO-1抗體購(gòu)自proteinch公司(批號(hào)：16396-1-AP、10701-1-AP)；AKT抗體、p-AKT抗體購(gòu)自美國(guó)SAB公司(批號(hào)：YT0175、YP0006)；ECL顯影液購(gòu)自上海天能科技有限公司(批號(hào)：180-501)。

秀麗莓原花青素(RPC)的提?。盒沱愝稍锴o采自青海果洛，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所盧學(xué)峰老師鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物秀麗莓(RubusamabilisFocke)。丙酮水浸泡粉碎后的干燥莖，提取3次浸泡過夜，取濾液，反復(fù)提取，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，制得秀麗莓干燥莖原花青素粗提物。粗提物經(jīng)D101大孔樹脂柱純化，得到含量>95%的總原花青素，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，放置冰箱備用[5]。

1.2 儀器Gynergy HI型酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；JS-1070P型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)；ACCUCHEK型血糖儀及配套血糖試紙(上海羅氏制藥公司)；DYY-4C型電轉(zhuǎn)膜儀及電泳儀裝置(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥體質(zhì)量(20±2)g的雄性C57BL/6小鼠，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(皖)2019003。隨機(jī)抽取8只作為對(duì)照組(Con)給與普通飼料喂養(yǎng)；其它小鼠給與高脂飼料喂養(yǎng)，4周后50 mg·kg-1的劑量腹腔注射STZ(持續(xù)3 d)，注射后的72 h，血糖儀尾尖取血檢測(cè)小鼠空腹血糖(fasting blood-glucose, FBG)，抽取FBG≥16.7 mmol·L-1的小鼠繼續(xù)給予高脂飼料飼養(yǎng)，并將其隨機(jī)分為模型組(Mod)、二甲雙胍組(Met)、原花青素低劑量組(RPCL)、原花青素高劑量組(RPCH)，每組8只。Met組小鼠按20 mg·kg-1劑量給予二甲雙胍片溶液灌胃；RPCL組和RPCH組小鼠分別按50、150 mg·kg-1劑量給予原花青素溶液灌胃；Mod組和Con組小鼠灌胃給予等體積蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)給藥7周。每周記錄1次體質(zhì)量和每2周記錄1次FBG。

2.2 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)在藥物干預(yù)的第6周末進(jìn)行，所有小鼠禁食12 h后，根據(jù)每只小鼠的體重給予葡萄糖溶液(2 g·kg-1)灌胃，按順序分別檢測(cè)0、30、60、120 min的血糖，利用GraphPad Prism 8.3.0繪制血糖變化折線圖，并計(jì)算曲線下面積(AUC)。

2.3 生化指標(biāo)檢測(cè)7周后小鼠眼球取血，置于抗凝管中，3 000 r·min-1離心5 min分離血漿，檢測(cè)血漿中血脂、SOD活力和MDA含量。紅細(xì)胞沉淀用于檢測(cè)GHb含量。解剖小鼠分離胰腺組織，一部分使用4%多聚甲醛固定用于HE染色；其余部分于-80 ℃冰箱中保存，用于Western blot的檢測(cè)。

2.4 HE染色取固定的胰腺組織，進(jìn)行脫水、石蠟包埋，切片(厚4-5 μm)、染色、封片等步驟，完成操作后將切片放置于Leica光學(xué)顯微鏡下拍照，觀察其形態(tài)特征。

2.5 Western blot檢測(cè)取胰腺組織，加入適量預(yù)冷的RIPA裂解液，置于冰上超聲，裂解1 h。裂解液于4 ℃、12 000 r·min-1離心，取上清并檢測(cè)蛋白濃度，使用裂解液調(diào)各樣品蛋白濃度一致后，加上樣緩沖液煮沸5 min制作Western blot標(biāo)本。蛋白樣品經(jīng)電泳，電轉(zhuǎn)移至NC膜后，5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗AKT(1 ∶500)、p-AKT(1 ∶500)、Nrf2(1 ∶750)、HO-1(1 ∶1 000)置于4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加二抗孵育2 h，ECL曝光，曝光后用ImageJ進(jìn)行灰度分析。

3 結(jié)果

3.1 RPC對(duì)糖尿病小鼠一般情況的影響Con組小鼠毛色正常，精力旺盛，反應(yīng)快，無多飲多食多尿現(xiàn)象；Mod組小鼠毛色灰暗，精神萎靡、反應(yīng)慢，有明顯的多飲多食多尿；RPC組及Met組小鼠經(jīng)治療后，毛色恢復(fù)光澤，多飲多食多尿有所改善，精神狀態(tài)及反應(yīng)靈敏度均優(yōu)于Mod組。

3.2 RPC對(duì)糖尿病小鼠體重的影響小鼠分組后喂養(yǎng)7周，每周測(cè)1次體重，由Fig 1可知，從第2周開始小鼠體重發(fā)生差異，RPC組及Met組小鼠體重均高于Mod組，一直持續(xù)到第7周。

Fig 1 Effect of RPC on body weight of diabetic mice n=8)

3.3 RPC對(duì)糖尿病小鼠FBG的影響由Tab 1可知，Mod組小鼠的FBG水平明顯高于Con組(P<0.01)，而經(jīng)過Met和RPC的7周治療后，Met組、RPCL組和RPCH組的FBG水平較Mod組明顯降低(P<0.05)。

Tab 1 Effect of RPC on FBG in diabetic mice n=8)

3.4 RPC對(duì)糖尿病小鼠生化指標(biāo)的影響由Tab 2表明：Mod組小鼠血漿TG、TC、LDL-C、GHb較Con組明顯增加(P<0.01)，HDL-C略微降低(P<0.05)；與Mod組比較，Met組、RPCL組和RPCH組能明顯降低TG、TC、LDL-C、GHb(P<0.05)，增加HDL-C(P>0.05)。

3.5 RPC對(duì)糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影響在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1周進(jìn)行，由Fig 2A可知，所有組別小鼠30 min時(shí)血糖濃度達(dá)到峰值，然后血糖濃度呈下降趨勢(shì)。利用GraphPad Prism 8.3.0計(jì)算葡萄糖曲線下的面積(AUC)并繪制成柱狀圖如Fig 2B所示，Mod組葡萄糖耐量曲線下的面積(AUC)明顯高于Con組(P<0.01)，表明Mod組小鼠胰島β細(xì)胞的葡萄糖刺激的胰島素分泌功能受損較為嚴(yán)重。Met組、RPCL組和RPCH組葡萄糖耐量曲線下的面積(AUC)明顯比Mod組降低(P<0.05)，提示RPC能減輕糖尿病小鼠的糖耐量受損，改善胰島β細(xì)胞功能。

Fig 2 Effect of RPC on OGTT in diabetic mice n=6)

3.6 RPC對(duì)糖尿病小鼠氧化應(yīng)激的影響由Fig 3可知：經(jīng)過Met和RPC的7周治療后，Met組、RPCL組和RPCH組小鼠血漿SOD活力升高，MDA含量降低(P<0.01)。

Fig 3 Effect of RPC on SOD activity and MDA level in diabetic mice n=8)

3.7 RPC對(duì)糖尿病小鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)的影響由Fig 4 HE染色可知，Con組胰腺組織、胰島、以及胰島細(xì)胞無明顯病變；與Con組比較，Mod組胰腺組織可見胰島縮小，結(jié)構(gòu)紊亂，胰島細(xì)胞分布不均勻，邊界模糊；與Mod組比較，Met組、RPCL和RPCH組小鼠胰腺組織有所恢復(fù)。提示RPC對(duì)糖尿病小鼠的胰腺組織病理損傷有明顯改善作用。

3.8 RPC對(duì)糖尿病小鼠胰腺組織相關(guān)蛋白表達(dá)的影響由Fig 5可知，Mod組p-AKT/AKT、Nrf2和HO-1表達(dá)比Con組明顯下降(P<0.01)；Met組、RPCL組和RPCH組p-AKT/AKT、Nrf2和HO-1表達(dá)比Mod組明顯增加(P<0.05)，提示RPC能激活PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)通路。

4 討論

原花青素是存在于水果、樹皮、紅酒、綠茶和許多種子中最豐富的多酚類化合物[6]，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗腫瘤和保護(hù)心血管等多種藥理活性。秀麗莓中含有豐富的原花青素，研究表明，原花青素的降糖作用是通過促進(jìn)外周葡萄糖攝取，保護(hù)胰島細(xì)胞和胰腺功能以及調(diào)節(jié)GLP-1的分泌等途徑實(shí)現(xiàn)的[7]。本研究結(jié)果表明原花青素通過抑制氧化應(yīng)激而保護(hù)糖尿病小鼠胰腺組織的損傷。

糖尿病是由多種因素所引起的代謝性綜合癥，胰島β細(xì)胞的功能降低和凋亡在糖尿病發(fā)病過程中起到了重要的作用[8]。葡萄糖耐量作為胰島β細(xì)胞功能的表征指標(biāo)，同時(shí)可以反映機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力。結(jié)果顯示Mod組小鼠在30 min時(shí)血糖濃度達(dá)到最高水平，120 min時(shí)血糖仍維持在較高水平，表明胰島β細(xì)胞功能受損。RPC組能增強(qiáng)胰島β細(xì)胞功能，改善糖尿病小鼠葡萄糖耐量受損。研究表明原花青素通過胰島素的合成、分泌和降解來改變?chǔ)录?xì)胞的功能[9]，Sun等[10]研究進(jìn)一步證實(shí)原花青素對(duì)棕櫚酸和H2O2誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡與降低氧化應(yīng)激有關(guān)。

Fig 4 Effect of RPC on morphology of pancreatic tissues in diabetic mice (HE staining×400) A. Con group; B. Mod group; C. Met group; D. RPCL group; E. RPCH group

Tab 2 Effect of RPC on biochemical indicators in diabetic mice n=8)

Fig 5 Effect of RPC on expression of p-AKT/AKT, Nrf2 and HO-1 in pancreatic tissues of diabetic mice n=8)

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷和凋亡的一個(gè)重要因素。糖尿病患者由于長(zhǎng)時(shí)間接觸高糖高脂物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致代謝異常并誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生過量的活性氧簇[11]，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的損傷和凋亡。而MDA和SOD可用于指示機(jī)體的抗氧化能力。本研究結(jié)果顯示RPC使小鼠胰腺組織MDA含量下降，SOD活性增加，表明RPC通過增加抗氧化物質(zhì)的活性與含量，提高機(jī)體抗氧化能力，拮抗氧化應(yīng)激損傷。

Nrf2/HO-1信號(hào)通路參與了多種組織、器官氧化應(yīng)激的損傷，是細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵通路[12]。正常狀況下，Nrf2以胞漿中的二聚體形式與Keap1蛋白結(jié)合，當(dāng)機(jī)體受到活性氧刺激時(shí)，活化后的Nrf2從Keap1上解偶聯(lián)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合并激活靶基因HO-1的轉(zhuǎn)錄[13]；HO-1能清除氧自由基，從而產(chǎn)生抗氧化損傷[14]。

PI3K/ AKT信號(hào)通路廣泛存在細(xì)胞中，參與細(xì)胞外信號(hào)促進(jìn)代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、凋亡、炎癥反應(yīng)等重要的細(xì)胞活動(dòng)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，該途徑與多種疾病相關(guān)聯(lián)，如腫瘤、肥胖癥和糖尿病[16-17]。正常情況下，調(diào)節(jié)亞基p85對(duì)PI3K起著抑制作用，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞外信號(hào)刺激后，p85激活催化亞基p110讓PI3K活化，并催化PIP2為PIP3，進(jìn)而導(dǎo)致AKT磷酸化使之被激活，激活后從質(zhì)膜進(jìn)入胞質(zhì)，使Nrf2蛋白的絲氨酸位點(diǎn)磷酸化，削弱與Keap1的結(jié)合，增強(qiáng)其表達(dá)并促進(jìn)Nrf2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而引起信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[18]。在本研究中，RPC能夠激活PI3K/AKT信號(hào)通路，引發(fā)Nrf2/HO-1的激活，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷。

本研究結(jié)果表明，秀麗莓原花青素通過激活PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)通路，減輕糖尿病小鼠的胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，從而使糖尿病小鼠損傷的胰腺組織得到改善。