龐 賽，龐發(fā)根，江 坤，李玉蘭，王鐵杰

(深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，深圳市藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518057)

歐洲藥品質(zhì)量管理局(EDQM)是目前全球最權(quán)威的實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證機(jī)構(gòu)之一，對(duì)實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立完成檢測的能力有較高的要求。測量不確定度是表征賦予被測量值分散性的非負(fù)參數(shù)，一個(gè)完整的定量分析結(jié)果應(yīng)包含測量值和測量不確定度2個(gè)指標(biāo)[1-2]。近年來，不確定度在藥物分析領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛[3-8]，如今在EDQM的能力驗(yàn)證中，組織方亦要求參與者報(bào)告測定結(jié)果的不確定度值，讓能力驗(yàn)證的參與者能夠?qū)⒆约旱牟淮_定度估計(jì)值與其他實(shí)驗(yàn)室的估計(jì)值進(jìn)行比較。因此，測量不確定度的評(píng)定逐漸引起了廣大藥物分析人員的重視。正確表達(dá)和評(píng)定測量方法的測量不確定度將逐步成為國際通用的要求。

阿司匹林為非甾體抗炎藥，主要的治療功效是解熱、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕、抑制血小板聚集等作用。該品種在各國藥典中均有收載，對(duì)羥基苯甲酸為《歐洲藥典》[9]阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)中的特定雜質(zhì)A。本研究為本實(shí)驗(yàn)室在參加EDQM液相色譜法能力驗(yàn)證中以《歐洲藥典》阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下收載的方法對(duì)雜質(zhì)對(duì)羥基苯甲酸的含量進(jìn)行測定，參考相關(guān)資料并結(jié)合EDQM測量不確定度評(píng)定的核心文件[10]，對(duì)《歐洲藥典》阿司匹林中的對(duì)羥基苯甲酸測定的不確定度進(jìn)行了分析，以期為有效控制對(duì)羥基苯甲酸測定方法的準(zhǔn)確性，以及對(duì)今后各實(shí)驗(yàn)室參加EDQM能力驗(yàn)證時(shí)評(píng)定不確定度提供參考。

1 藥品與試劑

對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品(由EDQM能力驗(yàn)證組織方提供，含量為100.0%)；乙腈為色譜級(jí)；磷酸為分析級(jí)；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

安捷倫1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；XS205DU電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司)；10 ml量瓶(A級(jí))、25 ml量瓶(A級(jí))、100 ml量瓶(A級(jí))、1 ml單標(biāo)移液管(A級(jí))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

測定方法：依據(jù)《歐洲藥典》10.0版阿司匹林有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下雜質(zhì)A的測定方法及EDQM能力驗(yàn)證文件ProficiencyTestingSchemeonLiquidChromatography(PTS208)[11]。

色譜條件：采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，以磷酸-乙腈-水(2∶400∶600)為流動(dòng)相，檢測器為紫外檢測器，檢測波長237 nm，進(jìn)樣量為10 μl，流速為1.0 ml/min。

對(duì)照品溶液配制：取對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品約 50 mg，精密稱定，置于25 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.00 ml該溶液至100 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液配制：取阿司匹林供試品約0.1 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

樣品測定：取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μl，分別注入高效液相色譜儀并測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算對(duì)羥基苯甲酸的含量。

3 測量模型的建立

按公式計(jì)算對(duì)羥基苯甲酸含量：

則：

其中，X為供試品中對(duì)羥基苯甲酸含量(%)；CT為供試品濃度(mg/ml)；CS為對(duì)照品濃度(mg/ml)；WT為供試品的取樣量(g)；WS為對(duì)照品的取樣量(g)；AT為供試品溶液色譜圖中對(duì)羥基苯甲酸的峰面積；AS為對(duì)照品溶液的主峰面積；VT為供試品的稀釋體積(ml)；VS為對(duì)照品的稀釋體積(ml)；ωS為對(duì)照品的含量(%)。

實(shí)際上X的測得值是3份平行試樣的測定數(shù)據(jù)給出的，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)不確定度不可忽略。應(yīng)加入重復(fù)性修正量R，其值視為零，不確定度非零。加入后公式變?yōu)椋?/p>

X′=X+R

其中，X′為考慮重復(fù)性修正量R后的實(shí)際含量(%)；X為供試品含量(%)；R為重復(fù)性修正量(%)。

4 不確定度來源分析

不確定度來源用因果圖表示，見圖1～圖3。

圖1 X的不確定度來源因果圖

圖2 VS的不確定度來源因果圖

圖3 加入重復(fù)性后的不確定度來源因果圖

5 評(píng)定對(duì)羥基苯甲酸含量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[u(X)]

5.1 評(píng)定對(duì)照品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(WS)]

5.1.1評(píng)定u(WS)

u(WS)由天平示值誤差的不確定度u1(WS)和天平稱量重復(fù)性的不確定度u2(WS)合成，均屬于B類測量不確定度。

故：

①u1(WS)：對(duì)照品稱量約為50 mg，查天平(XS205DU)檢定證書，所用電子天平(d=0.01 mg)的最大允差為±0.05 mg，認(rèn)為矩形分布：

②u2(WS)：稱量對(duì)照品所用天平的檢定證書給出的重復(fù)性誤差為0.01 mg，認(rèn)為矩形分布：

則單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程使用減重法，故不確定度為：

5.1.2評(píng)定urel(WS)

對(duì)照品稱樣量分別為0.050 10和0.049 85 g，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

=1.177×10-3(mg)

5.2 評(píng)定供試品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(WT)]

5.2.1評(píng)定u(WT)

u(WT)由天平示值誤差的不確定度u1(WT)和天平稱量重復(fù)性的不確定度u2(WT)合成，均屬于B類測量不確定度。

故：

①u1(WT)：供試品稱量約為0.1 g，查天平(XS205DU)檢定證書，所用電子天平(d=0.01 mg)的最大允差為±0.05 mg，認(rèn)為矩形分布：

②u2(WT)：稱量對(duì)照品所用天平的檢定證書給出的重復(fù)性誤差為0.01 mg，認(rèn)為矩形分布：

則單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程使用減重法，故不確定度為：

5.2.2評(píng)定urel(WT)

對(duì)照品稱樣量分別為0.099 51、0.100 20和0.099 70 g，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(WT)=0.722×10-3(mg)

5.3 評(píng)定對(duì)照品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(AS)]

對(duì)照品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要來源為進(jìn)樣重復(fù)性，屬A類不確定度，取2份對(duì)照品溶液分別連續(xù)進(jìn)樣3次，對(duì)照品峰面積測定結(jié)果見表1，用極差法計(jì)算對(duì)照品峰面積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

表1 對(duì)照品峰面積測定結(jié)果

=0.494×10-3

=0.383×10-3

則對(duì)照品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

5.4 評(píng)定供試品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(AT)]

2份供試品溶液分別連續(xù)進(jìn)樣2次，峰面積測定結(jié)果見表2，用極差法計(jì)算供試品峰面積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

表2 供試品峰面積測定結(jié)果

=2.546×10-3

=2.157×10-3

=1.453×10-3

則供試品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

=3.639×10-3

5.5 評(píng)定對(duì)照品稀釋體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(VS)]

對(duì)照品溶液稀釋過程的不確定度由25 ml量瓶引入的不確定度u(VS1)和100 ml量瓶引入的不確定度u(VS3)、1 ml單標(biāo)移液管引入的不確定度u(VS2)合成，分別計(jì)算每一步稀釋過程引入的不確定度。

采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算：

5.5.1評(píng)定urel(VS1)

u(VS1)由25 ml量瓶最大允差引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(VS1)和溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(VS1)合成。

①u1(VS1)：在初始溶解對(duì)照品時(shí)，用到25 ml量瓶，查量瓶檢定規(guī)程JJF196—2006《常用玻璃量器》，使用的25 ml量瓶最大允許誤差絕對(duì)值為0.03 ml，歷年檢定結(jié)果顯示誤差均較小，視為三角分布：

②u2(VS1)：實(shí)驗(yàn)在控溫環(huán)境下進(jìn)行，室溫控制在(20±5) ℃,水的體積膨脹系數(shù)為0.000 21/℃，按操作描述得初步定容體積為25 ml。因此控溫范圍產(chǎn)生的體積增量半寬分別為25×0.000 21×5=0.026 25(ml)。因?yàn)橛?jì)算結(jié)果時(shí)不做溫度體積修正，此處將體積變化作為不確定度處理，溫度導(dǎo)致的體積變化為矩形分布，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成得到：

則：

5.5.2評(píng)定urel(VS2)

u(VS2)由1 ml單標(biāo)移液管最大允差引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(VS2)和溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(VS2)合成。

①u1(VS2)：對(duì)照品兩步稀釋時(shí)，用到1 ml單標(biāo)移液管，查檢定規(guī)程JJF196—2006《常用玻璃量器》，使用的A級(jí)1 ml單標(biāo)移液管最大允許誤差絕對(duì)值為0.007 ml，歷年檢定結(jié)果顯示誤差均較小，視為三角分布:

②u2(VS2)：實(shí)驗(yàn)在控溫環(huán)境下進(jìn)行，室溫控制在(20±5) ℃,水的體積膨脹系數(shù)為0.000 21/℃，按操作描述吸液體積為1 ml。因此,控溫范圍產(chǎn)生的體積增量半寬分別為1×0.000 21×5=0.001 05(ml)。因?yàn)橛?jì)算結(jié)果時(shí)不做溫度體積修正，此處將體積變化作為不確定度處理，溫度導(dǎo)致的體積變化為矩形分布，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成得到：

=2.914×10-3(ml)

則：

=2.914×10-3(ml)

5.5.3評(píng)定urel(VS3)

u(VS3)由100 ml量瓶最大允差引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(VS3)和溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(VS3)合成。

①u1(VS3)：對(duì)照品第2步稀釋時(shí)，用到100 ml量瓶，查量瓶檢定規(guī)程JJF196—2006《常用玻璃量器》，使用的100 ml量瓶最大允許誤差絕對(duì)值為0.10 ml，歷年檢定結(jié)果顯示誤差均較小，視為三角分布：

②u2(VS3)：實(shí)驗(yàn)在控溫環(huán)境下進(jìn)行，室溫控制在(20±5)℃,水的體積膨脹系數(shù)為0.000 21/℃，按操作描述得初步定容體積為100 ml。因此,控溫范圍產(chǎn)生的體積增量半寬分別為100×0.000 21×5=0.1050(ml)。因?yàn)橛?jì)算結(jié)果時(shí)不做溫度體積修正，此處將體積變化作為不確定度處理，溫度導(dǎo)致的體積變化為矩形分布，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成得到：

則：

對(duì)照品溶液稀釋的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

=3.104×10-3(ml)

5.6 評(píng)定供試品稀釋體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(VT)]

u(VT)由10 ml量瓶最大允差引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(VT)和溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(VT)合成。故：

①u1(VT)：溶解供試品時(shí)用到10 ml量瓶，查量瓶檢定證書及根據(jù)檢定規(guī)程JJF196—2006《常用玻璃量器》，使用的10 ml量瓶最大允許誤差絕對(duì)值為0.020 ml，視為三角分布：

②u2(VT)：實(shí)驗(yàn)在控溫環(huán)境下進(jìn)行，室溫控制在(20±5) ℃，與20 ℃的溫差導(dǎo)致的溶液體積膨脹大于量瓶的體積膨脹，可只考慮溶液的體積膨脹。水的體積膨脹系數(shù)為0.000 21/℃，按操作描述定容體積為10 ml。因此控溫范圍產(chǎn)生的體積增量半寬分別為10×0.000 21×5=0.010 50(ml)。因?yàn)橛?jì)算結(jié)果時(shí)不做溫度體積修正，此處將體積變化作為不確定度處理，假設(shè)溫度導(dǎo)致的體積變化為矩形分布，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成得到

則：

5.7 評(píng)定對(duì)照品含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel(ωS)]

對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品(EDQM，含量：100.0%)無相關(guān)的不確定度信息，且實(shí)驗(yàn)室目前無同類具有不確定度信息的對(duì)照品替代，故忽略u(píng)rel(ωS)。

5.8 對(duì)羥基苯甲酸含量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(X)

對(duì)羥基苯甲酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

實(shí)驗(yàn)測得對(duì)羥基苯甲酸含量為3份平行樣的平均值，X=0.250%

故：

u(X)=urel(X)×X=5.120×10-3×0.250%=0.001 28%

6 評(píng)定重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[u(R)]

重復(fù)測定3份平行樣，測定結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性結(jié)果 %

用貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差：

規(guī)程中要求測定3份平行樣，則：

7 計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見公式：

8 報(bào)告測量結(jié)果

阿司匹林供試品中對(duì)羥基苯甲酸含量結(jié)果為：(0.250±0.002)%，第2項(xiàng)為標(biāo)準(zhǔn)不確定度(非擴(kuò)展不確定度)。不確定度一覽表見表4。

表4 不確定度評(píng)定一覽表

不確定度A類評(píng)定：用對(duì)觀測列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的方法來評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)不確定度；不確定度B類評(píng)定：用不同于對(duì)觀測列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的方法來評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)不確定度

9 討論

測量不確定度評(píng)定應(yīng)盡可能分析測量不確定度的所有可能來源，本文通過參考EDQM測量不確定度評(píng)定核心文件，對(duì)《歐洲藥典》[9]收載的阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)羥基苯甲酸測定過程中的不確定度各分量來源進(jìn)行分析，建立了測定阿司匹林中對(duì)羥基苯甲酸的不確定度評(píng)定方法，可為同分析方法的不確定度評(píng)定提供參考。

由表4可知，本研究不確定度分量中，對(duì)結(jié)果影響最大的分量為測量重復(fù)性。因此，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注重分析人員平行操作的重要性，在雙份樣品或多份樣品測定時(shí)，應(yīng)將測量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差控制在要求的范圍內(nèi)，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。提示可通過以下途徑降低不確定度，提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性:① 定期對(duì)液相色譜儀進(jìn)行性能確認(rèn)，加強(qiáng)日常維護(hù)保養(yǎng)，確保儀器始終處于穩(wěn)定的工作狀態(tài)并具有良好的進(jìn)樣精密度。② 在分析過程中，溶液稀釋過程應(yīng)使用經(jīng)校準(zhǔn)合格的容量儀器，合理控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度。③ 稱量應(yīng)選用經(jīng)性能確認(rèn)合格的天平，且天平精度符合使用要求。④ 實(shí)驗(yàn)人員在整個(gè)測定過程中應(yīng)注意標(biāo)準(zhǔn)操作，避免引起不必要的誤差，使測定結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。