王蕾 黃耿 葉志華 姜衛(wèi)東 柯霓

1鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院超聲影像科 435000；2鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科 435000；3腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室，黃石 435000

前列腺癌是最常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，手術(shù)治療和內(nèi)分泌治療是前列腺癌的主要治療方式［1］。盡管前列腺癌的治療取得了較大進展，然而多數(shù)晚期前列腺癌患者的療效并不理想［2］。探究前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制對前列腺癌的臨床診療意義重大。微小RNA（microRNA，miRNA）是由18～25 個核苷酸組成的內(nèi)源性RNA，不能翻譯為蛋白質(zhì)［3］。miRNA 通過與其靶基因mRNA 特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達，在細胞的各種生理和病理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用［4］。研究表明，miRNA 在包括前列腺癌在內(nèi)的腫瘤中起到促癌因子或抑癌因子的作用［5］。miR-6893-5p 是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，長度為21 個核苷酸，其在腫瘤中的表達及作用機制尚不清楚。本研究旨在探討miR-6893-5p 和前列腺癌的關(guān)系，觀察miR-6893-5p 對靶基因的調(diào)控作用及對前列腺癌細胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、KSFM 培養(yǎng)基購自美國HyClone 公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司。正常前列腺上皮細胞RWPE-1和前列腺癌細胞系DU-145、PC-3、C4-2B、LNCaP 購自上海生命科學(xué)院細胞所。實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-qPCR）試劑盒購自日本TaKaRa 公司。攜帶miR-6893-5p 序列的重組慢病毒、攜帶無意義序列的重組慢病毒、熒光素酶報告載體［S100 鈣結(jié)合蛋白A16，S100 calcium binding protein A16（S100A16）野生型及突變型］、miR-NC、miR-6893-5p購自廣州銳博生物科技有限公司。雙熒光素酶報告檢測試劑盒購自美國Promega 公司。四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色（MTT）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。S100A16、GAPDH、N-cadherin、CDK4 抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和感染 將DU-145、PC-3、C4-2B、LNCaP 細胞分別置于含10%胎牛血清RPMI 1640 培養(yǎng)基中，將RWPE-1 細胞置于含10%胎牛血清的KSFM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的LNCaP 細胞，分別感染攜帶無意義序列的重組慢病毒（NC組）和攜帶miR-6893-5p 序列的重組慢病毒（miR-6893-5p組）。RT-qPCR檢測感染效果。

1.3 RT-qPCR 檢測細胞中miR-6893-5p 和S100A16 mRNA的表達 用TRIzol 提取上述細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照RT-qPCR 試劑盒說明書制備反應(yīng)體系，反應(yīng)參數(shù)為95 ℃2 min、95 ℃20 s、62 ℃35 s、72 ℃35 s，40 個循環(huán)。采 用2-ΔΔCt方法計算，以U6 和GAPDH 為內(nèi)參計算miR-6893-5p 和S100A16 mRNA的相對表達量。RT-qPCR引物見表1。

表1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)引物序列

1.4 MTT 法檢測LNCaP 細胞增殖 將兩組LNCaP 細胞以4×103個/孔接種到96 孔板，每組4 個平行孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于接種后第1、2、3、4、5 天，加入15 μl/孔MTT 溶液，避光孵育4 h，棄去孔內(nèi)液體，加入150 μl/孔DMSO，充分震蕩后酶標儀檢測460 nm 處的每孔吸光度值（A490值），繪制LNCaP細胞生長曲線。

1.5 劃痕實驗檢測LNCaP 細胞遷移 將兩組LNCaP細胞以8×105個/孔接種到6 孔板，每組4 個平行孔。細胞融合度為95%時，利用10 μl 槍頭沿6 孔板底部直線劃痕，磷酸鹽緩沖液清洗，每孔加入2 ml無血清培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察測量劃痕距離L1。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，顯微鏡下觀察測量劃痕距離L2，LNCaP細胞遷移率=（L1－L2）/L1×100%。

1.6 雙熒光素酶報告基因檢測 采用miRNA 靶基因預(yù)測軟件miRWalk 2.0 預(yù)測miR-6893-5p 可能調(diào)控的特異性靶基因。將重組S100A16 基因野生型及突變型熒光素酶報告基因質(zhì)粒盒和miR-NC、miR-6893-5p共轉(zhuǎn)染LNCaP 細胞，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測每組細胞的熒光素酶活性。

1.7 Western blot 檢測S100A16 及NF-κB 信號通路蛋白表達 兩組LNCaP 細胞采用磷酸鹽緩沖液清洗，加入裂解液提取總蛋白。每個樣品孔加入30 μg蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜。采用5%脫脂奶粉封閉，分別加入一抗4 ℃下孵育過夜。加入二抗在室溫下孵育3 h，加入ECL發(fā)光試劑，曝光、顯影。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)相比采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-6893-5p在前列腺癌細胞系中的表達 與正常前列腺上皮細胞RWPE-1 相比，前列腺癌細胞系DU-145、PC-3、C4-2B、LNCaP 中miR-6893-5p 表達水平均明顯降低（均P＜0.05），LNCaP 細胞中miR-6893-5p的表達最低（P＜0.01），見圖1。

圖1 miR-6893-5p在正常前列腺上皮細胞與前列腺癌細胞系中的表達

2.2 慢病毒感染后LNCaP 細胞中miR-6893-5p的表達 NC組和miR-6893-5p組LNCaP 細胞中miR-6893-5p相對表達量分別為（1.07±0.21）和（9.61±1.15），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.32，P＜0.01），提示攜帶miR-6893-5p 序列的慢病毒感染成功。

2.3 上調(diào)miR-6893-5p 對LNCaP 細胞增殖能力的影響 MTT 檢測結(jié)果顯示（圖2），與NC組相比，miR-6893-5p組LNCaP細胞從第2天開始，增殖能力明顯降低（P＜0.05）。

圖2 兩組重組慢病毒上調(diào)miR-6893-5p 對LNCaP細胞增殖能力的影響

2.4 上調(diào)miR-6893-5p 對LNCaP 細胞遷移能力的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示，NC組和miR-6893-5p組LNCaP 細胞遷移率分別為（72.64±5.69）%和（27.97±5.63）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.58，P＜0.05）。與NC組相比，上調(diào)miR-6893-5p后LNCaP細胞的遷移能力被抑制。

2.5 miR-6893-5p 靶向結(jié)合S100A16 mRNA miRNA靶基因預(yù)測軟件miRWalk 2.0 預(yù)測顯示（圖3），S100A16 可能為miR-6893-5p調(diào)控的靶基因。雙熒光素酶檢測系統(tǒng)顯示（圖4），相比miR-NC，miR-6893-5p的相對熒光素酶活性顯著下降（t=13.10，P＜0.01），提 示miR-6893-5p 與S100A16 mRNA存在堿基互補配對。

圖3 miR-6893-5p與S100A16 mRNA的堿基互補配對位點

圖4 雙熒光素酶檢測系統(tǒng)驗證miR-6893-5p的靶基因

2.6 上調(diào)miR-6893-5p 對LNCaP 細胞中S100A16 mRNA 表達的影響 NC組和miR-6893-5p組LNCaP 細胞中S100A16 mRNA 相對表達量分別為（1.01±0.07）和（0.22±0.06），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.77，P＜0.01）。與NC組相比，上調(diào)miR-6893-5p 可抑制LNCaP 細胞中S100A16 mRNA的表達。

2.7 上調(diào)miR-6893-5p 對S100A16 蛋白表達的影響Western blot 結(jié)果顯示（圖5），與NC組相比，上調(diào)miR-6893-5p 后，LNCaP 細胞中S100A16 蛋白表達明顯降低，細胞增殖蛋白CDK4、細胞遷移蛋白N-cadherin 表達均降低。

圖5 兩組重組慢病毒W(wǎng)estern blot 檢測miR-6893-5p對S100A16蛋白表達的影響

3 討 論

有研究表明，miRNA在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［6］。miRNA 通過抑制靶基因的表達，表現(xiàn)為腫瘤抑制因子或癌基因作用，miRNA 如miR-29b-3p［7］、miR-16-5p［8］、miR-233-5p［9］等在前列腺癌組織和細胞系中高表達或低表達，與腫瘤大小、臨床分期、患者預(yù)后等密切相關(guān)。miRNA已成為前列腺癌研究領(lǐng)域的熱點。miR-6893-5p 是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，其在前列腺癌細胞中的功能和作用機制并不明確。本研究結(jié)果顯示，miR-6893-5p 在前列腺癌細胞系中表達明顯下調(diào)，miR-6893-5p 可能在前列腺癌細胞中發(fā)揮腫瘤抑制因子。通過感染慢病毒構(gòu)建miR-6893-5p穩(wěn)定高表達的LNCaP細胞系，MTT 實驗和劃痕實驗顯示，LNCaP 細胞的增殖和遷移能力均明顯降低，進一步表明miR-6893-5p 在前列腺癌中具有抑癌作用。

為進一步研究miR-6893-5p 在前列腺癌中的作用機制，通過生物信息學(xué)和熒光素酶檢測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)S100A16 基因是miR-6893-5p的靶基因。S100A16 蛋白是一種小分子酸性鈣結(jié)合蛋白，屬于S100 蛋白家族［10］。S100A16 蛋白在胃癌、膀胱癌等許多腫瘤組織中表達增加，與腫瘤的發(fā)生、進展密切相關(guān)［11-12］。S100A16 蛋白在前列腺癌組織和細胞系中表達上調(diào)，抑制S100A16 蛋白表達可明顯降低前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力［13］。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-6893-5p 后，LNCaP 細胞中S100A16 表達明顯降低，進一步表明miR-6893-5p 可靶向抑制S100A16 蛋白的表達。Western blot 結(jié)果顯示，miR-6893-5p 下調(diào)S100A16 表達后，細胞增殖蛋白CDK4、細胞遷移蛋白N-cadherin 表達均降低，提示LNCaP細胞的增殖和遷移能力均被抑制。

綜上所述，miR-6893-5p 在前列腺癌細胞系中低表達，上調(diào)miR-6893-5p 可通過靶向S100A16 基因抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移，miR-6893-5p 可能成為前列腺癌潛在的治療靶點。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。