張爽，郝鵬飛，伊立超1,，姜宇航，郝嘉翼，李樂天，時(shí)小雙，徐鵬，金寧一，賈立軍，李昌*

(1. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院人獸共患病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新單元，吉林 長(zhǎng)春 130122)

豬δ冠狀病毒(porcine delta corona virus,PDCoV)是套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒亞科(Coronavirinae)、δ冠狀病毒屬(Deltacoronavirus)成員[1]，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種豬腸道致病性冠狀病毒，可以感染各年齡段豬群，哺乳期仔豬最易感。臨床癥狀表現(xiàn)為急性水樣腹瀉、嘔吐、脫水等[2]，具有較強(qiáng)的致病性，哺乳仔豬感染后死亡率可高達(dá)30%～40%[3]。PDCoV在2012年由Woo等[4]在我國香港家豬的糞便樣本中首次發(fā)現(xiàn)，2014年在美國俄亥俄州腹瀉仔豬和母豬的糞便中再次檢測(cè)到PDCoV，并迅速波及美國多洲及加拿大部分地區(qū)。之后在韓國、中國大陸、日本、越南、泰國等地也檢測(cè)到了PDCoV毒株，對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[5-9]，但目前關(guān)于PDCoV的致病機(jī)制及其與宿主細(xì)胞的相互作用關(guān)系仍不是很清楚。

PDCoV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為25.4 kb，其病毒粒子直徑約為60～180 nm，呈球形或橢圓形，外層有冠狀纖突囊膜包裹，整體呈“皇冠”狀[10]。與其他冠狀病毒一樣，PDCoV由4種主要結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成：即刺突蛋白(spike protein，S)、包膜蛋白(envelope protein，E)、膜蛋白(membrane protein，M)、核衣殼蛋白(nuecleocapsid protein，N)。其中S蛋白是Ⅰ型跨膜糖蛋白，能夠介導(dǎo)細(xì)胞黏附、促進(jìn)病毒與細(xì)胞膜融合，從而介導(dǎo)病毒入侵，此外S蛋白還能介導(dǎo)某些中和抗體的產(chǎn)生。S蛋白包括S1和S2兩個(gè)部分，S1主要負(fù)責(zé)與受體細(xì)胞的識(shí)別與結(jié)合，S2則與膜融合相關(guān)。冠狀病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(receptor-binding domain，RBD)是S1區(qū)域高度保守的一段序列，位于其結(jié)構(gòu)域殘基的318～510處[11]，理論上RBD結(jié)合功能性受體(ACE2)的親和力高于完整S1結(jié)合功能受體的親和力[12]，RBD區(qū)域決定病毒的宿主范圍及嗜性，也是影響病毒與受體之間相互作用的重要因素。

目前尚無有效的藥物和疫苗針對(duì)PDCoV，因此，本試驗(yàn)以PDCoV受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域RBD蛋白為研究對(duì)象，通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)RBD蛋白，為今后PDCoV的診斷和新型疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞

桿狀病毒雙表達(dá)載體pFastBacTM、DH10 Bac感受態(tài)大腸桿菌購自Thermo Scientific公司；SF9昆蟲細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所保存。

1.2 主要試劑

昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基SF900 Ⅱ SFM購自GIBCO公司；轉(zhuǎn)染試劑CellfectinTMⅡ Reagent購自Thermo Fisher公司；2×PCR mix buffer、T4-DNA連接酶、DNA Marker、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞均購自大連TaKaRa公司；pFastBacTM雙載體、EcoRⅠ、XbaⅠ均購自Thermo Scientific公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Beyotime公司；Anti-strep tag抗體購自Abcam公司；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG、Cy3標(biāo)記山羊抗鼠IgG購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 目的基因的設(shè)計(jì)

根據(jù)PDCoV的S蛋白氨基酸序列(GenBank:QAA06990.1)，選取其受體結(jié)合域RBD基因序列，并在N端插入Strep-tag標(biāo)簽，上下游分別添加EcoRⅠ和XbaⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，將該段序列進(jìn)行桿狀病毒表達(dá)偏愛密碼子優(yōu)化，交由南京金斯瑞公司合成。

1.4 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)pFast Bac Dual載體序列設(shè)計(jì)合成檢測(cè)重組桿狀病毒的通用引物。引物由吉林省庫美生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將合成并測(cè)序正確的的基因PDCoV-RBD亞克隆至桿狀病毒雙表達(dá)載體的PH啟動(dòng)子下游，命名為pFBD-PDR(圖1)，提取質(zhì)粒后利用EcoRⅠ、XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

圖1 pFBD-PDR重組質(zhì)粒設(shè)計(jì)示意

1.6 重組桿粒的制備

將重組質(zhì)粒pFBD-PDR轉(zhuǎn)化到DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于藍(lán)白斑篩選平板：含有四環(huán)素(10 mg/L)、硫酸卡鈉霉素(50 mg/L)、慶大霉素(7 mg/L)、IPTG(40 mg/L)、X-Gal(100 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃避光培養(yǎng)48 h以上。挑取較大的白色菌落在上述固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線接種，37 ℃避光培養(yǎng)48 h以上。挑取劃線平板上較大的白色菌落接種至含四環(huán)素(10 mg/L)、硫酸卡鈉霉素(50 mg/L)、慶大霉素(7 mg/L)的三抗液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。以PH-F和M13-R游引物進(jìn)行菌液PCR鑒定(上游引物5′-TTCATACCGTCCCACCAT-3′；下游引物：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)，驗(yàn)證桿狀病毒基因組是否轉(zhuǎn)座成功。并提取驗(yàn)證正確的菌株桿粒，命名為Bacmid-PDR。

1.7 重組桿狀病毒的拯救

提前準(zhǔn)備細(xì)胞密度為1.5×106～2.5×106個(gè)/mL且狀態(tài)良好的SF9細(xì)胞6孔板，將培養(yǎng)基更換為1 mL雙無Grace’s培養(yǎng)基。并另取2個(gè)100 μL雙無Grace’s培養(yǎng)基，分別加入4 μL CellfectinTMⅡ Reagent 轉(zhuǎn)染試和4 μg陽性重組桿粒，并輕輕混勻后靜置15 min，再將二者輕輕混勻，靜置20 min后緩慢、均勻加入到6孔板中。27 ℃培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)基為2 mL SF9Ⅱ完全培養(yǎng)基。27 ℃培養(yǎng)5～7 d，待大部分細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變(CPE)后收取細(xì)胞上清液為第一代重組桿狀病毒，命名為rBV-PDR，后繼續(xù)盲傳3代。

1.8 間接免疫熒光法(IFA)鑒定目的蛋白的表達(dá)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SF9細(xì)胞均勻鋪入6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%，每孔接種20 μL的P2代rBV-PDR，27 ℃培養(yǎng)48 h后棄掉培養(yǎng)基。用PBS輕洗3次，加入細(xì)胞固定液固定30 min，PBS洗3次；Trion X-100透化處理10 min，PBS清洗1次；5%脫脂乳封閉1 h，PBST洗3次；1∶1 000稀釋Anti-strep tag一抗37 ℃孵育2 h，PBST洗3次；1∶2 000稀釋Cy3-標(biāo)記的山羊抗鼠IgG室溫避光孵育40 min，PBST洗2次。熒光顯微鏡觀察。

1.9 Western blot檢測(cè)

PDCoV-RBD蛋白表達(dá)4 000 r/min離心5 min收集感染第3代rBV-PDR的SF9細(xì)胞，加入適量IP裂解液裂解破碎后12 000 r/min離心3 min，收取上清后制備蛋白樣品。通過SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上，以1∶1 000稀釋的Anti-strep tag為一抗，1∶5 000稀釋的山羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行Western blot鑒定。

2 結(jié)果

2.1 目的序列分析

PDCoV-RBD氨基酸同源性分析與序列比對(duì)見圖2。

圖2 PDCoV-RBD氨基酸同源性分析(A)與序列比對(duì)(B)

選取的目的氨基酸序列來自于中國南方流行株CC-HN2K-02株S蛋白(GenBank:QAA06990.1)的302～422 aa處，將其與NCBI上我國其他已知典型毒株S蛋白上對(duì)應(yīng)的RBD氨基酸序列(23條)進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，該氨基酸序列完全一致(圖略)；將其與國外流行株進(jìn)行對(duì)比(圖2)，同源性介于98.3%～100%，除泰國的3株毒株氨基酸序列(ANK58278.1 Thailand 2015、AMN91712.1 Thailand 2015、AMN91700.1 Thailand 2015)第46位與48位分別突變?yōu)長(zhǎng)與R外，其余毒株均未發(fā)生變化，表明RBD氨基酸序列具有高度保守性。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

利用EcoRⅠ、XbaⅠ對(duì)重組質(zhì)粒pFBD-PDR進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)1%瓊脂糖電泳，結(jié)果顯示，得到1條636 bp左右的目的條帶(圖3)，與預(yù)期合成片段大小一致；膠回收DNA片段后測(cè)序，驗(yàn)證該序列為目的序列，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M．DL5000 Marker；1.重組質(zhì)粒；2.重組質(zhì)粒雙酶切

2.3 重組桿粒Bacmid-PDR的鑒定

利用PH-F和M13-R引物對(duì)Bacmid-PDR 菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到1條1 200 bp左右的條帶(圖4)，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組桿粒Bacmid-PDR構(gòu)建成功。

2.4 重組桿狀病毒rBV-PDR的拯救

重組桿粒rBV-PDR轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞產(chǎn)生P1代毒。與正常SF9細(xì)胞(圖5A)相比，轉(zhuǎn)染P3代毒的細(xì)胞在72～96 h后與出現(xiàn)典型CPE(圖5B、5C)出現(xiàn)變大、變圓、細(xì)胞邊界模糊、貼壁細(xì)胞數(shù)量減少、部分細(xì)胞破碎漂浮等情況，表明重組桿狀病毒rBV-PDR拯救成功。

2.5 IFA鑒定PDCoV-RBD蛋白的表達(dá)

利用Strep-tag抗體對(duì)感染重組桿狀病毒rBV-PDR的SF9細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示，正常SF9細(xì)胞未出現(xiàn)特異性熒光，而感染重組桿狀病毒rBV-PDR的SF9細(xì)胞出現(xiàn)特異性紅色熒光(圖6)，表明成功表達(dá)外源蛋白且表達(dá)的外源蛋白位于細(xì)胞核外。

A.正常SF9細(xì)胞；B.重組桿粒Bacmid-PDR轉(zhuǎn)染72 h的SF9細(xì)胞;C.P3代重組桿狀病毒感染120 h的SF9細(xì)胞

圖6 IFA鑒定PDCoV-RBD蛋白的表達(dá)(400×)

2.6 Western blot檢測(cè)PDCoV-RBD蛋白的表達(dá)

收集感染rBV-PDR的SF9細(xì)胞沉淀，進(jìn)行裂解和破碎，12 000 r/min離心3 min后取上清裂解液制備蛋白樣品。SDS-PAGE后，以Strep-tag抗體為一抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，與正常SF9細(xì)胞裂解液相比，感染rBV-PDR的SF9細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到約22 kDa的蛋白條帶(圖7)，與預(yù)期蛋白大小一致。進(jìn)一步表明桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠表達(dá)PDCoV-RBD蛋白。

M.蛋白Marker；1.正常細(xì)胞；2.重組病毒感染細(xì)胞

3 討論

PDCoV作為一種2012年新發(fā)現(xiàn)的豬腹瀉病毒，常與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)等其他病原發(fā)生混合或繼發(fā)感染的情況，給多國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[13-15]。冠狀病毒的S蛋白具有識(shí)別受體、介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞的功能，同時(shí)S蛋白也是決定病毒宿主范圍及組織趨向性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[16-18]。另外，S蛋白作為重要抗原，能夠刺激天然宿主產(chǎn)生中和抗體[19-21]。S蛋白由受體結(jié)合亞結(jié)構(gòu)S1蛋白和膜融合亞結(jié)構(gòu)S2蛋白組成，其中，S1結(jié)構(gòu)域不止包含多個(gè)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的中和表位[22]，同時(shí)也具有識(shí)別受體、結(jié)合細(xì)胞的重要作用。候林杉等[23]以PDCoVHB-BD株的S1蛋白為基礎(chǔ)，利用pET-32a載體構(gòu)建了pET-32a-S1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)后利用His標(biāo)簽純化蛋白，Western blot結(jié)果表明該方法表達(dá)的S1蛋白具有良好的免疫反應(yīng)活性。Thachil等[24]利用真核表達(dá)載體成功表達(dá)了S1-Fc融合蛋白，在純化后去除Fc標(biāo)簽，得到了PDCoV IA2014-1株(GenBank:KM613173)S1蛋白(氨基酸序列1～573)，該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。S1結(jié)構(gòu)域因其參與病毒入侵受體細(xì)胞、誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，成為PDCoV的重點(diǎn)研究區(qū)域。理論上PDCoV RBD結(jié)構(gòu)域是S1蛋白的截短表達(dá)，含有多個(gè)抗原表位，是重要的免疫原性區(qū)域。Shang等[25]發(fā)現(xiàn)PDCoVS蛋白的S1-CTD區(qū)域能夠與宿主表面的未識(shí)別受體結(jié)合，推測(cè)該段包含主要RBD，為PDCoV RBD的研究奠定了基礎(chǔ)。

昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是以桿狀病毒為載體、在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)不但能對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行糖基化、乙?；?、硫酸化、寡聚化、折疊等多種翻譯后修飾，還因?yàn)榫哂懈叨鹊姆N屬特異性，對(duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物無致病性的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的生物安全性[26-28]。因此，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是以桿狀病毒為載體的一種成熟、高效、安全的真核表達(dá)系統(tǒng)。本試驗(yàn)利用分子克隆技術(shù)將修飾后的PDCoV-RBD基因重組到桿狀病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建了pFBD-PDR質(zhì)粒，將獲得的穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SF9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒。經(jīng)間接免疫熒光和Western blot證明了感染rBac-PDR的SF9細(xì)胞能夠正確表達(dá)PDCoV-RBD蛋白。

綜上，本試驗(yàn)利用昆蟲桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了PDCoV-RBD蛋白，為進(jìn)一步研究PDCoV-RBD蛋白的生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)，也為后續(xù)PDCoV診斷試劑的研發(fā)、亞單位疫苗的制備等提供了新的思路。