徐孝宙，胡元亮

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095;2. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400)

幾千年前，微生物發(fā)酵已經(jīng)在中國(guó)傳統(tǒng)中藥中得到應(yīng)用。例如，六神曲、淡豆豉等中藥都是由霉菌、酵母菌等微生物發(fā)酵而成。傳統(tǒng)發(fā)酵中草藥是將中藥和輔料混合均勻，在溫度、營(yíng)養(yǎng)條件都適宜的前提下，經(jīng)微生物發(fā)酵獲得提高藥效、改善藥性、降低毒性的目的[1]。部分中草藥的大量有效成分存在于細(xì)胞壁內(nèi)，由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)的雙重阻礙等影響[2]，所以需要微生物產(chǎn)生的大量纖維素酶、半纖維素酶等多種胞外酶破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及細(xì)胞壁與細(xì)胞間質(zhì)的阻礙，使中藥的有效成分和活性物質(zhì)有足夠的、最大限度的提取[3]。宋艷秋等[4]對(duì)紅曲霉轉(zhuǎn)化中藥葛根固態(tài)發(fā)酵條件的研究表明，利用發(fā)酵條件可以提高葛根中主要活性成分的含量，進(jìn)一步說(shuō)明利用微生物轉(zhuǎn)化提高中藥功效是可行的。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是芽孢桿菌屬的一種，是一類內(nèi)生芽孢的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌[5]。該菌生理特征多樣，在自然界中分布廣泛，易于分離培養(yǎng)，對(duì)人畜無(wú)害，能分泌多種酶和抗菌肽等活性物質(zhì)，具有良好的發(fā)酵性和抗逆性，應(yīng)用廣泛?？莶菅挎邨U菌比其他益生菌更有優(yōu)勢(shì)，制備而成的微生態(tài)制劑具有：①能調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群平衡，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高抗病力；②在不利環(huán)境條件下能以孢子形式存在，在飼料制粒、貯存及胃酸環(huán)境中仍能保持高活性；③能刺激動(dòng)物免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育，激活淋巴細(xì)胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能，提高機(jī)體免疫力；④能自身合成消化性酶類，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶等，與內(nèi)源消化酶共同發(fā)揮作用，促進(jìn)養(yǎng)分消化吸收等優(yōu)良特性[6]。閆鳳蘭等[7]以添加枯草芽孢桿菌的飼料飼喂肉仔雞發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌穩(wěn)定性較好，并能起到抑制消化道中的大腸桿菌、沙門菌和促進(jìn)乳酸桿菌生長(zhǎng)的作用?？莶菅挎邨U菌已被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖、醫(yī)藥、植物生防等多個(gè)領(lǐng)域[8]。

靈芝，擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤靈芝和紫靈芝的總稱，具有補(bǔ)中、固腎、補(bǔ)肺、止血的功效，對(duì)多種慢性病有一定療效[9]。靈芝對(duì)人體具有雙向調(diào)節(jié)作用，能治療多種疾病，涉及心腦血管、消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌、呼吸、運(yùn)動(dòng)等多個(gè)系統(tǒng)，特別對(duì)腫瘤、肝臟病變和失眠等的防治作用最為顯著[10]。靈芝對(duì)于動(dòng)物也具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性，何嘉烽等[11]研究表明，給小鼠飼喂靈芝發(fā)酵干粉后，中、高劑量組小鼠的吞噬能力、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、NK細(xì)胞的殺傷活性和血清溶血素含量顯著提高，具有一定的調(diào)節(jié)免疫活性作用，發(fā)酵后的靈芝添加入飼料中，有利于畜禽的健康。范明君等[12]發(fā)現(xiàn)用靈芝菌糠飼料飼喂家禽、豬、反芻及水產(chǎn)動(dòng)物，既能預(yù)防動(dòng)物疾病、減少動(dòng)物生產(chǎn)中抗生素的使用，同時(shí)還能促生長(zhǎng)、降低飼養(yǎng)成本，證明了靈芝具有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值和利用前景。本試驗(yàn)研究枯草芽孢桿菌發(fā)酵靈芝的最優(yōu)條件，為進(jìn)一步將靈芝發(fā)酵應(yīng)用在動(dòng)物生產(chǎn)中提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 靈芝

江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院江蘇省食用菌研究所提供。將靈芝用粉碎機(jī)粉碎成蓬松的粉末狀，倒入密封袋，標(biāo)注日期，置冰箱冷藏保存待用。

1.1.2 菌種來(lái)源

枯草芽孢桿菌由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏提供，編號(hào)：14246。40%無(wú)菌甘油-20 ℃冷凍保存的枯草芽孢桿菌，經(jīng)牛肉膏蛋白胨液體肉湯2～3次傳代，置冰箱冷藏保存待用。

1.1.3 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基

取牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、蛋白胨10 g加純凈水1 000 mL加熱攪拌，調(diào)pH值至7.2～7.4，加入瓊脂25 g攪拌混勻，倒入錐形瓶，121.3 ℃高壓滅菌15～20 min，倒入高溫滅菌的培養(yǎng)皿制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，等待凝固倒置于冰箱冷藏保存。傳代用液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.1.4 孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基

取蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、孟加拉紅0.03 g、氯霉素0.1 g，調(diào)pH值至7.2～7.4，加入瓊脂15 g攪拌混勻，倒入錐形瓶，121.3 ℃高壓滅菌15～20 min，倒入高溫滅菌的平板制備孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，等待凝固倒置于冰箱冷藏保存。

1.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.1 活菌計(jì)數(shù)方法的優(yōu)化

稱取發(fā)酵后的靈芝粉末1 g，加入9 mL純凈水，震蕩混勻。按10倍比稀釋成6個(gè)階梯濃度，分別取10-5、10-6稀釋后的菌液0.1 mL，涂布到5個(gè)直徑為9 cm的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。觀察固體培養(yǎng)基上芽孢桿菌的生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

稱取發(fā)酵后的靈芝粉末各1 g，加入100 mL純凈水震蕩混勻稀釋至10-2，再按10倍比稀釋成5個(gè)階梯濃度，分別取10-5、10-6稀釋后的菌液0.1 mL，涂布到5個(gè)直徑為9 cm的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。觀察固體培養(yǎng)基上芽孢桿菌的生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

每克樣品活菌數(shù)(CFU)=平均菌落數(shù)(CFU)×10×稀釋倍數(shù)。其中，平均菌落數(shù)是指取菌落數(shù)20～200個(gè)的平板3個(gè)或3個(gè)以上，計(jì)數(shù)平板內(nèi)菌落的平均數(shù)。

1.2.2 枯草芽孢桿菌接種比例的優(yōu)化

采用單因素設(shè)計(jì)，分為3步：①選擇最小接種比例。稱取5組靈芝粉末各5 g，分別接種1、2、5、10 和20 mL枯草芽孢桿菌菌液，即菌液與靈芝粉之比分別為1∶5、1∶2.5、1∶1、1∶0.5和1∶0.25，攪拌混勻，用封口膜封口，放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)18 h，活菌計(jì)數(shù)。②測(cè)定不同接種比例下枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)情況。稱取5 g靈芝粉，分別滴入0.5、1和2 mL枯草芽孢桿菌菌液，即菌液與靈芝粉之比分別為1∶10、1∶5和1∶2.5，攪拌混勻，用封口膜封口，放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)18 h，活菌計(jì)數(shù)。③驗(yàn)證最佳接種比例。稱取50 g靈芝粉末，分別按比例滴入5、10和20 mL的枯草芽孢桿菌液，即菌液與靈芝粉之比分別為1∶10、1∶5和1∶2.5，攪拌混勻，用封口膜封口，37 ℃培養(yǎng)18 h，活菌計(jì)數(shù)。

小比例接種時(shí)，采用“等量遞增法”混勻接種。例如：1∶10比例接種時(shí)，先用0.5 mL菌液接種于2 g靈芝粉末，再與5 g靈芝粉末混勻。

1.2.3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

采取枯草芽孢桿菌菌液與靈芝粉末1∶5比例接種，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃分別培養(yǎng)16、18、20、22和24 h，活菌計(jì)數(shù)。

1.3 質(zhì)量檢測(cè)

1.3.1 發(fā)酵產(chǎn)物活菌計(jì)數(shù)

靈芝發(fā)酵產(chǎn)物置于干燥通風(fēng)處放置，稱取室溫放置30 d的靈芝發(fā)酵產(chǎn)物1 g，按1.2.1方法操作，培養(yǎng)18 h，計(jì)數(shù)檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中活芽孢桿菌數(shù)量。

1.3.2 霉菌檢測(cè)

肉眼觀察法：靈芝發(fā)酵產(chǎn)物置于干燥通風(fēng)處放置30 d，肉眼觀察發(fā)酵靈芝是否有霉菌生長(zhǎng)。

平板計(jì)數(shù)法：按1.2.1方法操作，1 g發(fā)酵靈芝加入100 mL純凈水稀釋到10-2，放入振蕩培養(yǎng)箱均勻振蕩，取稀釋到10-3和10-4的菌液0.1 mL涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基，貼上封口膜，培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)霉菌數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 活菌計(jì)數(shù)方法優(yōu)化

發(fā)酵靈芝粉末1 g，加入9 mL純凈水，10倍比稀釋取10-5、10-6稀釋的菌液0.1 mL涂布到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；罹?jì)數(shù)結(jié)果存在菌落數(shù)與稀釋濃度不匹配的現(xiàn)象，如表1。分析原因認(rèn)為靈芝粉為蓬松粉末，靈芝粉與水按1∶10混合，稀釋混勻不充分，需提高稀釋倍數(shù)。

發(fā)酵靈芝粉末1 g，加入100 mL純凈水，震蕩混勻稀釋至10-2，10倍比稀釋取10-5、10-6稀釋的菌液0.1 mL涂布到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；罹?jì)數(shù)結(jié)果顯示菌落數(shù)與稀釋濃度呈正相關(guān)，如表1。

表1 優(yōu)化前后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果 個(gè)

2.1.2 接種量對(duì)芽孢桿菌含量的影響

最小接種量比例試驗(yàn)，5 g靈芝粉末按1∶5、1∶2.5、1∶1、1∶0.5和1∶0.25接種枯草芽孢桿菌菌液，培養(yǎng)18 h均無(wú)肉眼可見(jiàn)霉菌生長(zhǎng)，枯草芽孢桿菌活菌計(jì)數(shù)則隨著接種量的增加而增長(zhǎng)，呈線性關(guān)系。以1 mL菌液接種于5 g靈芝粉(1∶5)為最小接種比例活菌數(shù)量級(jí)達(dá)到108(圖1)。

圖1 不同接種比例枯草芽孢桿菌活菌數(shù)

最佳接種比例試驗(yàn)，5 g靈芝粉末按1∶10、1∶5和1∶2.5接種枯草芽孢桿菌菌液，結(jié)果顯示活菌數(shù)與接種量呈線性關(guān)系。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與之一致(圖2)。

圖2 最佳接種比例及驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)3次試驗(yàn)的對(duì)比與分析，綜合生產(chǎn)成本等因素，優(yōu)化選用1∶5接種枯草芽孢桿菌菌液，靈芝粉末發(fā)酵良好，節(jié)約原材料，降低生產(chǎn)成本。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)芽孢桿菌含量的影響

按1∶5接種量比例，37 ℃培養(yǎng)16、18、20、22 和24 h。結(jié)果顯示最佳發(fā)酵時(shí)間為22 h，培養(yǎng)20～24 h活菌數(shù)最多(圖3)。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間枯草芽孢桿菌活菌數(shù)

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物活菌計(jì)數(shù)

室溫放置30 d的靈芝發(fā)酵產(chǎn)物，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果與細(xì)菌穩(wěn)定期內(nèi)計(jì)數(shù)無(wú)明顯差異，活菌數(shù)為1×108CFU/g。

2.3 霉菌含量的計(jì)數(shù)

靈芝發(fā)酵產(chǎn)物室溫放置30 d，觀察結(jié)果顯示無(wú)肉眼可見(jiàn)霉菌生長(zhǎng)，孟加拉紅培養(yǎng)基上也無(wú)霉菌生長(zhǎng)。

3 討論

靈芝粉粗纖維含量高，粉碎后直接飼喂動(dòng)物適口性差，免疫活性物質(zhì)吸收利用率低，益生菌發(fā)酵能提高靈芝的利用率。靈芝基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量低，不利于乳酸桿菌等益生菌生長(zhǎng)，枯草芽孢桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)及水分要求不高，利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵靈芝可降解纖維素，還可以將部分大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可以直接吸收利用的小分子物質(zhì)[13]。

枯草芽孢桿菌具有抗逆性強(qiáng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不嚴(yán)格的特性，在低營(yíng)養(yǎng)的條件下，以芽孢形式休眠，在適宜條件下，芽孢會(huì)萌發(fā)繁殖生長(zhǎng)[14]。因此本研究使用枯草芽孢桿菌為對(duì)象，開(kāi)展靈芝發(fā)酵試驗(yàn)。固態(tài)發(fā)酵加水量少，發(fā)酵完成后，由于產(chǎn)品水分含量低，不易霉變，且枯草芽孢桿菌在利用靈芝的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行克隆繁殖，發(fā)酵產(chǎn)熱，會(huì)進(jìn)一步降低發(fā)酵物質(zhì)的水分，制成預(yù)混料后，便于飼料混合。因而，本研究采用固態(tài)發(fā)酵形式。

通過(guò)枯草芽孢桿菌與靈芝粉的不同接種比例的摸索，結(jié)果表明枯草芽孢桿菌在低接種比例時(shí)，具有較好的發(fā)酵效果，凸顯枯草芽孢桿菌的優(yōu)良生長(zhǎng)特性?？莶菅挎邨U菌菌液按1∶5接種于粉碎的靈芝，其適應(yīng)期8～10 h，培養(yǎng)10 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。芽孢桿菌在適宜條件下，如在液態(tài)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，其適應(yīng)期約為6 h[15]。由于固態(tài)發(fā)酵中水分和營(yíng)養(yǎng)成分均低于營(yíng)養(yǎng)瓊脂，本次試驗(yàn)中芽孢桿菌在靈芝發(fā)酵中的適應(yīng)期延長(zhǎng)。后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，至培養(yǎng)22 h，隨著靈芝中的營(yíng)養(yǎng)成分被枯草芽孢桿菌所利用，細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，數(shù)量不再上升。

徐亞英等[16]研究表明，枯草芽孢桿菌液發(fā)酵最佳溫度范圍為32～37 ℃，對(duì)營(yíng)養(yǎng)含量高利于發(fā)酵與產(chǎn)熱的基質(zhì)，可以選擇32 ℃發(fā)酵，而靈芝營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量低，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)熱量少，當(dāng)發(fā)酵溫度是37 ℃時(shí)，其菌體生長(zhǎng)量達(dá)到最高；溫度高于或低于37 ℃，含菌數(shù)都有所下降。本研究選用37 ℃發(fā)酵溫度達(dá)到滿意的效果。

4 結(jié)論

本研究枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵靈芝表明，1∶5接種比例，37 ℃發(fā)酵22 h，至發(fā)酵完成枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)可達(dá)到1.0×108CFU/g，符合國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求(NY/T1461—2007)。固態(tài)發(fā)酵接種活菌量少，在滿足細(xì)菌生長(zhǎng)的同時(shí)節(jié)約了成本；同時(shí)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物易于干燥與保存，常溫下保存不易發(fā)霉，利于畜牧業(yè)的運(yùn)輸與應(yīng)用。但靈芝本身成本較高，如何去降低成本適應(yīng)用量大、成本低的畜牧業(yè)應(yīng)用需求，或應(yīng)用于高回報(bào)的領(lǐng)域尚需進(jìn)一步深入研究。