鄧汝森,張海龍,顏廣智,陳盛楠,2,顧萬軍,2,黃良宗,2*
(1. 佛山科學技術(shù)學院生命科學與工程學院,廣東 佛山 528000;2. 廣東方道基因科技有限公司,廣東 佛山 528000)
馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)屬于蘭氏分群的C群,是馬鏈球菌的一個亞種,具有宿主多樣性,可通過外傷、手術(shù)等途徑感染多種動物[1-3],在中國主要流行于豬群和馬群[4]。引起馬腺疫的病原體除了馬鏈球菌馬亞種,還有馬鏈球菌獸疫亞種也是主要病原體之一[5]。馬鏈球菌獸疫亞種主要引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、敗血癥以及突然死亡等[6]。該菌也可以感染人,是一種重要的人畜共患病病原體[7]。
類M蛋白(SzP)是馬鏈球菌獸疫亞種的重要毒力因子和主要的保護性抗原[8],具有多種生物學功能。SzP作為該菌菌體表面一種生物大分子,與其他表面大分子一樣經(jīng)受各種選擇性壓力作用,在進化過程中,會以一定的頻率發(fā)生變異,特別是因免疫選擇性壓力,其表面保護性抗原位點會因點突變而發(fā)生改變[9]。因此,SzP基因的變化能代表馬鏈球菌獸疫亞種的進化規(guī)律和趨勢。
2018年7月中旬,廣東省江門市某規(guī)模化豬場保育仔豬突然發(fā)生散發(fā)性急性死亡,豬場共有保育豬650頭,發(fā)病76頭,死亡17頭,發(fā)病率11.69%,死亡率2.62%。經(jīng)調(diào)查,該豬場于2018年6月初注射豬鏈球菌2型滅活疫苗,發(fā)病后未用抗菌藥物進行治療。隨后立即剖檢病豬,經(jīng)一系列細菌學檢測手段判定分離菌為馬鏈球菌獸疫亞種,通過小鼠致病性試驗研究該分離菌對小鼠的致病力以及結(jié)合體外藥敏試驗篩選敏感藥物,以期為臨床防控馬鏈球菌獸疫亞種引發(fā)的疾病提供理論依據(jù)。
豬腦組織樣品,采集于廣東省江門市某規(guī)?;B(yǎng)殖場臨床表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀的病豬。
PCR擴增試劑盒、DL2000 DNA Marker、Gold view 染料、氨芐青霉素、pMD18-T載體連接試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa 公司;細菌DNA抽提試劑盒購自美基(Magen)生物公司;大腸埃希菌DH5α和馬鏈球菌獸疫亞種質(zhì)控菌株ATCC 43079由佛山科學技術(shù)學院生命科學與工程學院預防獸醫(yī)學重點實驗室保存;藥敏紙片購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司;細菌微量生化鑒定管購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;血清營養(yǎng)瓊脂平板(含10%小牛血清)、10%小牛血清肉湯、氨芐平板及LB液體培養(yǎng)基(氨芐濃度:100 mg/mL)和鮮血營養(yǎng)瓊脂平板均由佛山科學技術(shù)學院預防獸醫(yī)重點實驗室配制。48只5~7 周齡雄性BALB/c小鼠購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心,許可證號:SCXK(粵)2019-0035。
1.3.1 細菌分離鑒定與形態(tài)學觀察
無菌操作采取腦頂葉劃線接種于血清營養(yǎng)瓊脂平板(含0.01% NAD),37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況及形態(tài),挑取疑似單菌落在血瓊脂平板純化培養(yǎng)。挑取純培養(yǎng)的單菌落制作抹片,革蘭染色,觀察細菌形態(tài)特征。
1.3.2 細菌生化鑒定
按照單盒生化鑒定管使用說明書,對分離菌進行生化鑒定,并與伯杰細菌鑒定手冊(第8版)的生化結(jié)果進行比較。
1.3.3 細菌16S rRNA基因序列分析及SzP氨基酸序列分析
挑取純培養(yǎng)單菌落接種于10% 小牛血清肉湯,37 ℃、160 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)24 h,按照細菌DNA抽提試劑盒說明書的操作過程抽提分離菌總DNA 用作PCR反應的模板。參考文獻[10]合成馬鏈球菌獸疫亞種SzP基因特異性引物,并用16S rRNA基因進行PCR擴增,引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應條件:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,將陽性產(chǎn)物做膠回收,并把回收產(chǎn)物連接到 pMD-18T 載體,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞,旋轉(zhuǎn)混勻,置冰浴30 min,42 ℃水浴熱休克90 s后,迅速置冰浴5 min,加入1 mL LB培養(yǎng)液,37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)45 min,4 500 r/min常溫離心5 min,吸取1 mL上清,將余液細胞均勻涂布于氨芐抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)16 h。各挑取5個陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司廣州分公司進行測序。
表1 引物序列信息
取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液,4 ℃、5 000 r/min離心10 min收集菌體。用生理鹽水重懸,調(diào)整原液,使100倍稀釋后的菌液OD600約為0.2,進行連續(xù)的10倍梯度稀釋并進行平板計數(shù)以確定實際接種量。同時選取4.87×104~4.87×108CFU細菌量接種5~7 周齡雄性BALB/c小鼠(腹腔注射0.1 mL/只),每組8只,另設陰性對照組注射生理鹽水,連續(xù)觀察7 d,每天記錄小鼠的死亡情況,最后采用Karber法[11]計算半數(shù)致死量(LD50)。及時解剖死亡小鼠,觀察小鼠臟器變化,取腦組織和肺臟抹片,革蘭染色鏡檢;同時取臟器涂抹鮮血平板,置37 ℃培養(yǎng)24 h后進行細菌純化鑒定。
將純培養(yǎng)的細菌致密劃線接種于血清營養(yǎng)瓊脂平板表面。用無菌鑷子將氟苯尼考、替米考星、環(huán)丙沙星、大觀霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、林可霉素、頭孢噻肟、氧氟沙星、頭孢曲松、阿莫西林、恩諾沙星、青霉素、阿米卡星、復方新諾明和復方阿莫西林16 種藥敏片均勻貼至培養(yǎng)基表面,倒置平板,37 ℃培養(yǎng)24 h,按美國臨床實驗室標準化委員會的藥敏試驗標準,根據(jù)抑菌圈直徑大小來判定結(jié)果。
用無菌接種環(huán)將分離單菌落劃線接種于鮮血平板,37 ℃培養(yǎng)24 h,可見圓形、微隆起、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、灰白色、半透明的菌落,呈現(xiàn)明顯的β溶血(圖1A),革蘭染色鏡檢可見長短不一的鏈狀球菌(圖1B),分離菌命名為SEZ20180618。通過細菌微量生化鑒定管檢測分離菌SEZ20180618的生化指標,結(jié)果馬尿酸鹽、山梨醇、海藻糖、甘油和七葉苷呈陽性,6.5%高鹽肉湯、菊糖、阿拉伯糖和甘露醇呈陰性,符合馬鏈球菌獸疫亞種生化特性。結(jié)合細菌形態(tài)和生化結(jié)果可初步判斷分離菌為馬鏈球菌獸疫亞種。
采用16S rRNA通用引物對分離菌株SEZ20180618進行PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)純化后連接pMD18-T載體測序。16S rRNA基因產(chǎn)物大小為1 466 bp(圖2)。將測序結(jié)果與GenBank中參考菌株16S rRNA基因序列進行同源性比對,發(fā)現(xiàn)分離菌株SEZ20180618的16S rRNA與馬鏈球菌獸疫亞種同源性>97%。采用MEGA7.0 軟件對分離菌株與參考菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果顯示,菌株SEZ20180618與馬鏈球菌獸疫亞種處于同一分支(圖3)。結(jié)合分離菌株SEZ20180618的形態(tài)觀察、生理生化特性鑒定、16S rRNA基因序列分析,最終判定分離菌株SEZ20180618為馬鏈球菌獸疫亞種。
A.血平板上生長;B. 革蘭染色鏡檢(1 000×)
M.DL2000 DNA Marker;1. 陰性對照; 2. 16S rRNA基因; 3. 陰性對照; 4. SzP基因
注:▲為本試驗分離株
對SzP基因進行PCR擴增,產(chǎn)物大小為364 bp(圖2),利用MegAlign軟件中的Clustal W將測序結(jié)果與GenBank登錄的SzP基因序列進行同源性比較,發(fā)現(xiàn)分離菌株SEZ20180618與馬鏈球菌獸疫亞種參考菌株CT株(GU332844.1)、Cxy012株(AY263783.1)、SH00166株(AY263784.1)、HNC01株(EF421188.1)、47A株(KF214274.1)、FC04株(EF522946.1)、SEZ9407473D株(AF519472.1)和C3株(MH287001.1)的SzP氨基酸序列同源性達100%。
小鼠腹腔按梯度注射SEZ20180618菌株死亡情況見表2。小鼠在攻毒12 h后出現(xiàn)精神沉郁、食欲降低、打堆等臨床癥狀,之后小鼠接連死亡。剖殺死亡小鼠,取脾臟、肝臟和腦等器官劃線分離細菌,均可分離出與馬鏈球菌獸疫亞種菌落形態(tài)、生長特性和生化特性相一致的細菌,并對分離菌用馬鏈球菌獸疫亞種SzP基因特異性引物PCR可擴增出與預期片段大小的條帶。根據(jù)表2計算SEZ20180618對小鼠的LD50為1.54×106CFU。
表2 SEZ20180618菌株對小鼠的LD50測定
分離菌SEZ20180618對復方阿莫西林、氟苯尼考、替米考星、環(huán)丙沙星、大觀霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、林可霉素、頭孢噻肟、氧氟沙星、頭孢曲松、阿莫西林、恩諾沙星和青霉素共14 種抗生素均敏感;對阿米卡星、復方新諾明2種抗生素中度敏感(表3)。
表3 SEZ20180618藥敏試驗結(jié)果
馬鏈球菌獸疫亞種是引起多種動物發(fā)病死亡的重要病原體,同時該菌經(jīng)特定的途徑也可感染人,是一種重要的人畜共患病病原。本試驗對采自廣東省江門市某規(guī)?;i場表現(xiàn)神經(jīng)癥狀并死亡的保育豬的腦組織樣品進行細菌分離,獲得1株革蘭陽性鏈狀排列的球菌,該株分離菌在鮮血平板上呈現(xiàn)β溶血,結(jié)合細菌生化鑒定、16S rRNA及SzP基因克隆測序分析,確定該株分離菌為馬鏈球菌獸疫亞種,命名SEZ20180618。
對分離純化培養(yǎng)的SEZ20180618進行小鼠毒力試驗,結(jié)果表明該菌株對BALB/c小鼠的LD50為1.54×106CFU,表明該株分離菌是具有較強毒力的馬鏈球菌獸疫亞種,由此推測馬鏈球菌獸疫亞種可能是該場保育豬發(fā)生神經(jīng)癥狀死亡的重要原因之一。
體外藥敏試驗對臨床篩選敏感抗菌藥物治療疾病具有指導性作用[12]。藥敏試驗結(jié)果表明:分離菌SEZ20180618對復方阿莫西林、氟苯尼考、多西環(huán)素、阿莫西林、恩諾沙星、青霉素等14種抗菌藥物均敏感;對阿米卡星、復方新諾明2種抗菌藥物中度敏感。臨床應根據(jù)體外藥敏試驗結(jié)果選擇敏感抗菌藥物進行治療,同時應將發(fā)病豬隔離飼養(yǎng),減少病原菌傳染,加強對豬舍環(huán)境的消毒工作,同時保持通風干燥的環(huán)境,減少病原菌滋生。
本研究通過實驗室診斷方法確診引起該豬場保育豬發(fā)生神經(jīng)癥狀死亡的病原是馬鏈球菌獸疫亞種,為臨床診斷和治療提供可靠依據(jù),同時對馬鏈球菌獸疫亞種感染的流行病學調(diào)查和候選疫苗菌株的選擇提供了實驗室參考依據(jù)。