莫家遠(yuǎn) 路玉潔 綦文晶 朱思燃 奉玲麗 高九昱 梁 靚 王 暉 蘭干球 梁 晶

(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004)

巴馬香豬由于在解剖學(xué)和生理學(xué)上與人類有很多共同之處，還具備體型小、容易控制等優(yōu)勢，可以被培育為試驗(yàn)動物用于人類研究[1-5]。食糜在動物不同腸段內(nèi)吸收的物質(zhì)并不一致，同時(shí)不同腸段內(nèi)還存在著不同的微生物群落，其豐度也有很大的差異[6-7]，這就導(dǎo)致了不同腸段內(nèi)容物的構(gòu)成具有很大的差異。因此，豬特別是與人生理狀態(tài)更相似的廣西巴馬香豬的腸道內(nèi)容物的變化引起了畜牧研究者還有醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注，理解廣西巴馬香豬的消化特征不僅利于理解豬的消化特點(diǎn)，而且更有利于理解人的消化特點(diǎn)。目前對動物體內(nèi)腸道內(nèi)容物的研究通常是使用16S RNA測序或者宏基因組測序等方法，研究其微生物菌群差異和功能[8-10]，但是對于腸道內(nèi)容物本身組成成分的研究還比較缺乏。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，各種組學(xué)手段層出不窮，代謝組學(xué)是繼轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后的新興組學(xué)技術(shù)，用于對生物樣品(如血液、尿液、糞便等)中所有小分子代謝物(<1 ku)進(jìn)行定性和定量分析，代表著機(jī)體已經(jīng)發(fā)生過的改變，對研究動物機(jī)體的動態(tài)變化具有重要意義[11]。Sinha等[12]同時(shí)使用宏基因組、微生物組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)技術(shù)研究小鼠結(jié)腸炎模型發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充次級膽汁酸會減輕腸道炎癥，這也提示我們在研究動物腸道內(nèi)容物的過程之中不應(yīng)該只研究腸道內(nèi)的菌群組成，其內(nèi)容物的物質(zhì)組成的研究同樣具有很重要的意義。因此，本研究通過采集巴馬香豬成年母豬回腸和結(jié)腸中段內(nèi)容物，利用代謝組學(xué)方法、無監(jiān)督主成分(PCA)分析和監(jiān)督正交偏最小二乘判別(OPLS-DA)分析等方法，探討巴馬香豬回腸和結(jié)腸內(nèi)容物的組成差異，以期篩選、鑒定其差異代謝物及其代謝途徑，了解巴馬香豬回腸和結(jié)腸的消化特征，為更深入理解機(jī)體的營養(yǎng)吸收過程和腸道微生物的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品采集

隨機(jī)屠宰來自于廣西壯族自治區(qū)巴瑤族自治縣巴馬原種香豬農(nóng)牧實(shí)業(yè)有限公司9頭10月齡巴馬香豬母豬，體重為(33.72±2.05)kg，采集其回腸中段和結(jié)腸中段內(nèi)容物，分為回腸組和結(jié)腸組，立即放入液氮中冷凍后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑和儀器

色譜級甲醇購自美國默克公司；色譜純甲酸購自美國西格瑪奧德里奇公司；UPLC-Q-Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀和Ultimate 3 000超高效液相色譜系統(tǒng)購自美國賽默飛世爾科技公司；高速冷凍離心機(jī)購自Eppendorf公司。

1.3 試驗(yàn)樣品處理

將回腸和結(jié)腸內(nèi)容物放入1.5 mL離心管中，加入3倍體積的甲醇，渦旋混合溶解30 s后4 ℃、13 000 r/min離心10 min并通過0.22 μm的膜過濾。

1.4 超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析條件

色譜條件：色譜柱為Hypersil GOLD C18(50 mm×2.1 mm,1.9 μm)，流動相為0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)，洗脫梯度，洗脫液配比見表1。流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積2 μL，進(jìn)樣室溫度為4 ℃，柱溫為30 ℃。

表1 UPLC-MS/MS分析洗脫梯度變化

質(zhì)譜條件：離子源為ESI源，正、負(fù)離子檢測模式，鞘氣(N2)壓力40 psi；輔助氣體(N2)壓力10 psi；噴霧電壓3.5 kV；離子傳輸管溫度320 ℃；輔助氣溫度350 ℃；質(zhì)譜掃描范圍為100～1 000 m/z，掃描模式為Full MS/dd-MS2。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Compound Discover 3.1軟件采用精確質(zhì)量匹配(<25 mg/L)和二級光譜匹配對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對代謝物進(jìn)行峰對齊，校正代謝物的保留時(shí)間，提取代謝物的峰面積。將所有代謝物的峰面積輸入SIMCA-P軟件(14.1版本，Umetrics)進(jìn)行多變量分析，包括PCA、OPLS-DA?；谀Ｐ蛯變量的解釋率(R2Y)對OPLS-DA模型進(jìn)行了驗(yàn)證，并通過200次迭代對交叉驗(yàn)證和排列檢驗(yàn)中基于模型預(yù)測能力(Q2)進(jìn)行了驗(yàn)證。使用SPSS 19.0對不同腸段的代謝物進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和倍數(shù)變化分析。采用OPLS-DA模型的變量重要性投影(VIP)評分(VIP>2)、t檢驗(yàn)的P值(P<0.01)和組間差異倍數(shù)(FC,FC>2或FC<0.5)三重標(biāo)準(zhǔn)篩選差異顯著的代謝物。使用代謝途徑分析網(wǎng)絡(luò)工具M(jìn)etaboAnalyst 5.0(http://metpa.metabolomics.ca)以及HMDB網(wǎng)站(https://hmdb.ca/metabolites/)KEGG網(wǎng)站(http://www.genome.jp/kegg/)分析差異物性質(zhì)和代謝路徑。

2 結(jié)果與分析

為了研究巴馬香豬回腸和結(jié)腸內(nèi)容物的組成差異，本研究通過UPLC-MS/MS方法進(jìn)行了非靶向代謝譜分析，正、負(fù)離子模式分別獲得了26 119和16 265個(gè)質(zhì)譜峰。使用Compound Discover 3.1軟件去除RSD大于30%的質(zhì)譜峰，經(jīng)過代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、準(zhǔn)確的質(zhì)量匹配和二級光譜搜索mzCloud和HMBD數(shù)據(jù)庫，正、負(fù)離子模式分別匹配了6 403和1 912種不同的代謝物。

2.1 不同腸段內(nèi)容物PCA分析

使用SMICA-P軟件比較正、負(fù)離子模式下各代謝物的峰面積，并進(jìn)行主成分分析結(jié)果顯示，在正、負(fù)離子模式下模型對X的解釋率(R2X)分別為0.630和0.665。9個(gè)質(zhì)量控制(QC)樣均集中分布在中心點(diǎn)，各樣品分布位于中心點(diǎn)左右，說明本研究使用的儀器穩(wěn)定性可靠，具有很好的重復(fù)性(圖1)。

圖A:正離子模式；圖B:負(fù)離子模式；H:回腸；J:結(jié)腸；QC:質(zhì)量控制樣品。圖2、圖3同。

2.2 不同腸段內(nèi)容物OPLS-DA分析

使用OPLS-DA模式分析2組間代謝物的差異，結(jié)果顯示，2組代謝物的分離度好，在正離子模式下R2Y為0.989，Q2為0.947；在負(fù)離子模式下R2Y為0.971，Q2為0.939(圖2)，表明OPLS-DA模式下的模型穩(wěn)定、可靠，得到的差異代謝物可以反映不同腸段內(nèi)容物之間的差異。

圖2 OPLS-DA得分圖

2.3 不同腸道內(nèi)容物迭代驗(yàn)證

對交叉驗(yàn)證和排列檢驗(yàn)中基于模型的預(yù)測能力進(jìn)行200次迭代驗(yàn)證，結(jié)果顯示，正、負(fù)離子模式下的預(yù)測能力回歸直線截距分別為-0.705和-0.892(圖3),說明本研究的模型擬合良好，沒有出現(xiàn)過度擬合的現(xiàn)象。

R2Y:模型對Y變量的解釋率；Q2:模型預(yù)測能力。

2.4 極顯著差異代謝物篩選

采用VIP>2(圖4)、P<0.01和FC>2或FC<0.5三重標(biāo)準(zhǔn)篩選極顯著差異代謝物，結(jié)果顯示，共有42種極顯著差異代謝物被篩選出來(表2)，正離子模式35種，負(fù)離子模式8種，其中十二烷二酸在2種模式下均被鑒定為極顯著差異代謝物。

表2 極顯著差異代謝物性質(zhì)

圖A、圖B:正離子模式；圖C、圖D：負(fù)離子模式。Figures A and B: the model of positive ion；figures C and D: the model of negative ion.

2.5 代謝途徑分析

使用Metaboanalyst 5.0對極顯著差異代謝物進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，L-苯丙氨酸、甘鵝去膽酸、苯丙氨酸、纈氨酸、?；悄懰?、酪氨酸、煙酸鹽、sn-甘油-3-磷酸膽堿、肌酸、蛋氨酸、花生酮、4,4-二甲基-5α-膽固醇-8,14,24-三烯-3β-醇、L-酪氨酸和甘膽酸共14種代謝物共參與了19條代謝途徑(表3和圖5)。

表3 差異代謝物參與的代謝途徑

圖5 KEGG通路圖

3 討 論

腸道是動物的消化吸收器官分為小腸與大腸2個(gè)部分，食糜在動物體內(nèi)先后經(jīng)過十二指腸、空腸和回腸被吸收大量營養(yǎng)物質(zhì)后到達(dá)結(jié)腸、直腸，進(jìn)一步被重吸收水分和無機(jī)鹽等物質(zhì)，最終成為糞便排出體內(nèi)。脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)都需要在腸道內(nèi)分解成為小分子物質(zhì)才能被吸收進(jìn)入體內(nèi)，提供動物生命活動所需要的能量。食糜在經(jīng)過不同腸段后其組成成分均會有所差異，主要是因?yàn)槟c道的消化吸收作用和腸道微生物的分解分泌作用。代謝組學(xué)在1999年出現(xiàn)后逐漸被研究者關(guān)注[13]，但是主要集中在人類的研究上面[14-16]。由于代謝組學(xué)本身是研究物質(zhì)的組成的一種技術(shù)，可以對組成復(fù)雜的物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，因此利用代謝組學(xué)可以充分地分析動物腸道內(nèi)不同腸段的內(nèi)容物組成，從而研究豬腸道內(nèi)容物組成的差異，能為研究者更深入理解機(jī)體的營養(yǎng)吸收過程和腸道微生物的作用機(jī)制提供新的見解，以期更進(jìn)一步理解機(jī)體的生命變化過程。

3.1 巴馬香豬回腸、結(jié)腸代謝組學(xué)質(zhì)控

本研究使用SMICA-P軟件進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析，結(jié)果顯示PCA分析R2X模型解釋率超過0.6，且9個(gè)QC樣均集中分布在中心點(diǎn)；OPLS-DA分析R2Y和Q2均超過為0.93；200次迭代驗(yàn)證的Q2截距均小于0.05，說明本研究的儀器穩(wěn)定性和分析模式穩(wěn)定性均良好，沒有出現(xiàn)過度擬合現(xiàn)象，分析得到的結(jié)果可以代表巴馬香豬回腸、結(jié)腸內(nèi)容物的差異。本研究將極顯著差異代謝物的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為同時(shí)滿足VIP>2、P<0.01和FC>2或FC<0.5 3個(gè)條件，比一般的代謝組學(xué)研究標(biāo)準(zhǔn)更嚴(yán)格[17-19]，因此篩選得到的42種極差異代謝物更能代表回腸內(nèi)容物和結(jié)腸內(nèi)容物的真實(shí)差異，并有可能作為回腸和結(jié)腸內(nèi)容物的生物標(biāo)志物。

3.2 高膽汁酸吸收效率是回腸的消化特征

本研究篩選到了42種差異代謝物，并進(jìn)行代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)。42種差異代謝物包含了甘鵝去氧膽酸、甘鵝去氧膽酸(鈉鹽)、甘膽酸、豬去氧膽酸、?；悄懰帷⒚撗跄懰?、牛去氧膽酸、?；悄懰?、?；酋Ｃ撗跄懰岷团；酋Ｃ撗跄懰?鈉鹽)共10種不同種類的與膽酸相關(guān)的代謝物，均在回腸內(nèi)容物中的含量高于結(jié)腸內(nèi)容物90～20 574倍。同時(shí)VIP值超過10的6種代謝物有4種是與膽酸相關(guān)的代謝物，分別為甘鵝去氧膽酸、甘鵝去氧膽酸(鈉鹽)、甘膽酸和豬去氧膽酸，說明膽汁酸在回腸內(nèi)容物和結(jié)腸內(nèi)容物的含量差異巨大。而甘鵝去氧膽酸、?；悄懰岷透誓懰?種膽酸相關(guān)的代謝物參與了初級膽汁酸生物合成以及?；撬岷偷团；撬岽x2條代謝途徑，其中膽汁酸在腸道主要起到分解脂肪等作用，已經(jīng)在各種脂肪相關(guān)的疾病中被廣泛報(bào)道[20-22]。膽汁酸從肝臟中分泌到膽囊儲存后輸入腸道內(nèi)促進(jìn)脂肪的乳化，到達(dá)回腸后段被重吸收到膽囊池中進(jìn)行儲存，只有5%被排出體內(nèi)[23-25]，與本研究中發(fā)現(xiàn)回腸內(nèi)容物的各類膽汁酸相關(guān)的物質(zhì)均高于結(jié)腸內(nèi)容物的結(jié)果一致。同時(shí)膽汁酸的合成還是膽固醇分解的主要途徑[20,26]，本研究中4,4-二甲基膽甾-8,14,24-三醇作為膽固醇的衍生物在結(jié)腸內(nèi)容物中的含量比回腸內(nèi)容物高137倍，這也符合回腸、結(jié)腸的生理特性。因此可以證明膽汁酸在小腸中消化脂肪類物質(zhì)之后，在回腸末端被吸收回肝臟儲存，只有小部分會進(jìn)入結(jié)腸中，被結(jié)腸中的微生物利用或者排除體內(nèi)，高膽汁酸吸收效率是回腸的消化特征。

3.3 高氨基酸吸收效率是回腸的消化特征

在42種差異代謝物中存在苯丙氨酸、正亮氨酸、DL-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸和L-蛋氨酸6種氨基酸，其中苯丙氨酸、DL-色氨酸和L-纈氨酸3種氨基酸為必需氨基酸，6種氨基酸在回腸內(nèi)容中含量均高于結(jié)腸內(nèi)容物5～21倍。L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、蛋氨酸、纈氨酸和肌酸5種代謝物參與了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路、苯丙氨酸代謝通路、氨酰tRNA生物合成通路、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成通路、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路、半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路以及酪氨酸代謝通路共9條與氨基酸合成與代謝相關(guān)的通路。研究表明，部分氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸等能逃過小腸的吸收作用到達(dá)結(jié)腸等大腸腸段被微生物利用，產(chǎn)生吲哚等物質(zhì)[27-29]。同樣地，肌酸作為精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸合成的氨基酸衍生物[30-31]也與苯丙氨酸等6種氨基酸一樣在回腸內(nèi)容物中的含量高于結(jié)腸內(nèi)容物，這也充分說明了大量的苯丙氨酸、正亮氨酸、DL-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-蛋氨酸和肌酸在回腸被吸收進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，以供機(jī)體的生命活動使用，但是還有部分氨基酸進(jìn)入結(jié)腸等腸段，高氨基酸吸收效率是回腸的消化特征。

3.4 高微生物代謝產(chǎn)物是結(jié)腸消化特征

十二烷二酸在正、負(fù)離子模式中均被鑒定為差異代謝物，且2種模式下在結(jié)腸內(nèi)容物中的含量比回腸內(nèi)容物分別高404和1 327倍，研究發(fā)現(xiàn)十二烷二酸是一種水溶性的脂類和碳水化合物代謝的中間產(chǎn)物[32]，可以通過微生物方法合成[33-34]，這提示結(jié)腸內(nèi)十二烷二酸含量的升高可能是由于脂類和碳水化合物代謝與微生物合成的雙重原因?qū)е碌?。同時(shí)，3-甲基二氧吲哚作為結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生的色氨酸代謝產(chǎn)物3-甲基吲哚的體內(nèi)氧化產(chǎn)物[35]，在本研究中其在結(jié)腸內(nèi)容物中的含量比回腸中高970倍。十二烷二酸和3-甲基二氧吲哚都在結(jié)腸內(nèi)容物中含量比回腸高約1 000倍，且2種物質(zhì)為回腸、結(jié)腸含量差異最大的2種差異代謝物，因此認(rèn)為高微生物代謝產(chǎn)物是結(jié)腸消化特征。

4 結(jié) 論

本研究通過非靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析了巴馬香豬回腸和結(jié)腸的消化特征，PCA分析發(fā)現(xiàn)儀器穩(wěn)定、可靠；OPLS-DA分析發(fā)現(xiàn)模型穩(wěn)定性良好，沒有出現(xiàn)過度擬合現(xiàn)象；共有42種極顯著差異代謝物被篩選出來，正離子模式35種，負(fù)離子模式8種；共14種代謝物參與了19條代謝途徑；高膽汁酸和氨基酸吸收效率是回腸的消化特征；高微生物代謝產(chǎn)物是結(jié)腸消化特征。