王海波 秦士貞 李金錄 武真邑 龔莉媛 裴文剛 車育彥 楊敏敏 史兆國

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070)

鋅作為家禽維持機體正常生理和生化代謝所必需的第一限制性微量元素，為六大酶類的組分或輔助因子，在免疫系統(tǒng)的發(fā)育、監(jiān)視、應答中發(fā)揮調(diào)控功能，維持淋巴細胞、T細胞及自然殺傷細胞等免疫細胞的結構和功能，參與特異性或非特異性免疫反應及金屬酶的催化調(diào)控發(fā)揮重要功能[1-5]。但飼糧中常以硫酸鋅(ZnSO4)為鋅源，其吸收利用率低，過度排放到環(huán)境中易造成鋅污染[3]。蒙脫石屬于2∶1型層狀硅鋁酸鹽礦物，每層結構由2個共頂聯(lián)接的硅氧四面體片中間夾著1個共棱聯(lián)接的鋁氧八面體片構成，已探明其儲量位居世界第一，且具有表面積大及強離子交互性，畜牧生產(chǎn)實踐中常用來抗腹瀉、治療腸道疾病，還可以作為控釋載體、吸附劑[6-7]。研究顯示，通過離子交換對沸石、蒙脫石等黏土礦物富集微量元素，可使微量元素在動物腸道內(nèi)合理釋放，持久被機體利用，提高微量元素的利用率，減少微量元素對環(huán)境的污染[8]，改善腸道形態(tài)與結構，提高腸黏膜的免疫功能[5]，緩解細菌造成氧化應激[9]，降低肉雞沙門氏菌和大腸桿菌的數(shù)量，提高沙門氏菌感染肉雞腸道的免疫能力[10]。同時，載鈣蒙脫石能有效扭轉(zhuǎn)黃曲霉毒素B1(AFB1)對肉鴨造成的免疫抑制，提高免疫器官指數(shù)及血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)的含量[11]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，鋅和載鋅沸石增強肉雞、仔豬的免疫功能[10,12]。然而，脾臟作為動物機體最大的免疫器官，參與產(chǎn)生抗體和初始免疫球蛋白、防御素、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等細胞因子，在先天性免疫和適應性免疫發(fā)揮應答調(diào)控[13-14]。添加載鋅沸石可改善肉雞微量元素代謝與生產(chǎn)性能[5]；本試驗前期研究發(fā)現(xiàn)，肉雞玉米-豆粕型基礎飼糧中添加40 mg/kg(以鋅含量計)的載鋅蒙脫石(zinc-montmorillonite, Zn-MMT)對肉雞42日齡平均日增重無顯著影響，但顯著降低肉雞料重比，提高十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度(VH)和絨毛高度/隱窩深度(V/C)，促進腸道發(fā)育[15]；且低蛋白質(zhì)水平飼糧添加Zn-MMT相比添加ZnSO4，可顯著提高肉雞免疫器官指數(shù)，提高小腸VH和V/C，降低隱窩深度(CD)，促進肉雞腸道發(fā)育[16]。Zn-MMT作為飼料添加劑對肉雞免疫調(diào)控及含鋅酶活性的研究相對較少。因此，本試驗旨在研究低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞免疫功能及肝臟含鋅酶活性的影響，為Zn-MMT作為飼料添加劑在肉雞生產(chǎn)中的應用提供參考理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用載鋅蒙脫石經(jīng)蘭州中檢科測試技術有限公司檢測，鋅含量為10 408.80 mg/kg。

1.2 試驗設計

采用單因子完全隨機試驗設計，選取1日齡健康科寶公雛240只，按體重隨機分成5組，每組6個重復，每個重復8只仔雞。對照組飼喂玉米-豆粕型基礎飼糧，4個試驗組分別在基礎飼糧中替代預混料載體(次粉)添加20、40、60和80 mg/kg Zn-MMT(均以鋅含量計算)。

1.3 飼養(yǎng)管理

2019年10月26日至2019年12月7日在甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院實訓中心進行飼養(yǎng)試驗，試驗期為42 d。試驗采用3層籠養(yǎng)。飼養(yǎng)管理和常規(guī)免疫按照《科寶肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊》進行。采用24 h恒定光照，雞只自由采食、飲水。

1.4 基礎飼糧

基礎飼糧參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)及NRC(1994)配制為玉米-豆粕型粉料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.5 測定指標與方法

1.5.1 血清免疫球蛋白及細胞因子含量的測定

在試驗第42天時，每組選取6只接近平均體重的肉仔雞進行翅下靜脈采血5 mL，離心管分裝，-20 ℃保存，并送于北京華英生物技術研究所用免疫比濁法測定血清免疫球蛋白(Ig)A和IgM含量，并通過酶聯(lián)免疫吸附法測定血清細胞因子白細胞介素(IL)-6、IL-4、IL-2、IL-1β、干擾素-γ(IFN-γ)含量。

1.5.2 空腸黏膜IgG、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量的測定

在試驗第21和42天時，每組選取6只接近平均體重的肉仔雞收集空腸黏膜，液氮速凍后，在-80 ℃冰箱中保存，并送甘肅碩聯(lián)生物技術有限公司采用酶聯(lián)免疫吸附法測定空腸黏膜IgG、sIgA含量。

1.5.3 肝臟含鋅酶活性的測定

在試驗第21和42天時，每組選取6只接近平均體重的肉仔雞采集肝臟組織，液氮速凍后，在-80 ℃冰箱中保存，并送甘肅碩聯(lián)生物技術有限公司采用酶聯(lián)免疫吸附法測定肝臟銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)活性。

1.5.4 脾臟免疫相關基因表達

表2 目的基因及內(nèi)參基因引物

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013處理后，采用SPSS 26.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法進行多重比較，試驗結果均以平均值±標準差(SD)表示，P<0.05表示顯著水平。

2 結果與分析

2.1 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞血清免疫球蛋白及細胞因子含量的影響

由表3可見，低鋅飼糧添加Zn-MMT顯著影響血清中IFN-γ的含量(P<0.05)，但對血清中IgA、IgM、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6的含量無顯著影響(P>0.05)。相比CK組，添加40和60 mg/kg的Zn-MMT顯著提高肉雞血清中IFN-γ的含量(P<0.05)。

表3 低鋅飼糧添加Zn-MMT對42日齡肉雞血清免疫球蛋白及細胞因子含量的影響

2.2 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞空腸黏膜免疫球蛋白含量的影響

由表4可見，相比CK組，低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞21和42日齡空腸黏膜的IgG、sIgA的含量均無顯著影響(P>0.05)。

表4 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞空腸黏膜免疫球蛋白含量的影響

2.3 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞肝臟含鋅酶活性的影響

由表5可見，相比CK組，低鋅飼糧添加Zn-MMT顯著影響肉雞21和42日齡肉雞肝臟中Cu-Zn SOD活性(P<0.05)，但對ALP、LDH、MDH活性均無顯著影響(P>0.05)。相比CK組，低鋅飼糧添加Zn-MMT顯著提高肉雞21和42日齡肉雞肝臟中Cu-Zn SOD活性(P<0.05)。

表5 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞肝臟含鋅酶活性的影響

2.4 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞脾臟免疫功能的影響

由表6可見，低鋅飼糧添加Zn-MMT顯著影響肉雞42日齡脾臟核轉(zhuǎn)錄因子-κBp65(NF-κBp65)、腫瘤壞死因子受體相關因子-2(TRAF-2)、腫瘤壞死因子受體超家族1(TNFRSF1B)、核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β4(TFG-β4)、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10基因相對表達量(P<0.05)。相比CK組，低鋅飼糧添加40 mg/kg的Zn-MMT顯著提高肉雞脾臟NF-κBp65、TRAF-2、TNFRSF1B、IκB-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10基因相對表達量(P<0.05)，但對TFG-β4、IFN-γ基因相對表達無顯著影響(P>0.05)。同時，低鋅飼糧添加20 mg/kg Zn-MMT顯著提高肉雞脾臟TNFRSF1B基因相對表達量(P<0.05)，且添加80 mg/kg Zn-MMT顯著提高肉雞脾臟TRAF-2、IL-1β、IL-6基因相對表達量(P<0.05)。

表6 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞脾臟免疫相關基因表達的影響

3 討 論

3.1 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞血清免疫球蛋白及細胞因子含量的影響

機體許多器官和系統(tǒng)都受到鋅缺乏的負面影響。在體內(nèi)，幾乎先天免疫和適應性免疫的所有方面都受到鋅的影響，缺鋅能改變中性粒細胞、單核細胞、自然殺傷細胞、T細胞和B細胞的數(shù)量和功能，這表明鋅在免疫防御方面具有重要意義[22]。免疫球蛋白參與介導體液免疫，其功能隨含量升高而增強[23-24]。細胞因子在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間起到雙向通信的作用的可溶性小分子多肽[25-26]，由Thl細胞分泌的IL-2、IFN-γ及TNF-α等協(xié)助T細胞的增殖，啟動細胞介導的免疫反應[27]；而Th2細胞分泌的IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子，刺激B細胞增殖并產(chǎn)生抗體，參與體液免疫[28]；以及活化的巨噬細胞分泌的IL-1、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α等多種細胞因子[29]，共從參與機體的免疫調(diào)控。詹小立等[23]研究發(fā)現(xiàn)，改性蒙脫石對斷奶仔豬血清IgG、IgA和IgM含量無顯著差異；但血清中IL-2含量的升高，能夠促進IFN-γ的產(chǎn)生[30]。在本試驗中，相比對照組，低鋅飼糧添加40和60 mg/kg的Zn-MMT對血清IL-2的含量有提高的趨勢，且添加40和60 mg/kg的Zn-MMT顯著提高肉雞血清中IFN-γ的含量，雞IFN-γ可針對不同的病原感染與相應的細胞因子協(xié)同作用進行免疫調(diào)節(jié)，完成免疫系統(tǒng)的防御功能[31]，有效提高免疫功能。

3.2 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞空腸黏膜免疫球蛋白含量的影響

家禽腸道中的sIgA能與微生物和黏膜中的抗原結合，限制微生物和抗原進入腸道，IgM參與機體原發(fā)性免疫反應，使可溶性抗原發(fā)生沉淀，提高機體吞噬、清除抗原的能力，維持腸道免疫屏障功能[32-34]。研究證實，鋁硅酸鹽可提高小鼠白細胞的吞噬活性，刺激脾臟B淋巴細胞分化，指導免疫球蛋白合成[35]。載鋅沸石[36]、凹凸棒石[37]、凹凸棒石和沸石混合物[38]等均能提高空腸黏膜中IgG、sIgA含量，增強腸道免疫力。但本試驗研究發(fā)現(xiàn)，低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞空腸黏膜免疫球蛋白含量無顯著差異，這可能與Zn-MMT覆蓋在健康腸道黏膜表面，減少了抗原對黏膜表面的直接刺激，使腸道免疫系統(tǒng)處于較低的免疫激活狀有關[39]。

3.3 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞肝臟含鋅酶活性的影響

鋅在動物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，適量補鋅可影響動物體內(nèi)抗氧化酶活性和金屬硫蛋白表達，進而保護動物機體免受自由基損傷，其中最具有代表性的為酶催抗氧化Cu-ZnSOD和糖代謝中的ALP[3,5,40]；并緩解機體因重金屬中毒、細菌、球蟲感染導致的氧化應激，增加肝臟中Cu-ZnSOD活性[10,41-42]，且對MDH活性[43]有提高趨勢，但對LDH活性影響表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。飼糧中添加0.11%～0.46%載鋅沸石可增加蛋雞肝臟ALP、MDH活性，且LDH活性在0.23%時最高，隨后呈下降趨勢[40]。本試驗結果表明，低鋅飼糧添加Zn-MMT對肝臟ALP、LDH、MDH活性均無顯著影響，這與馬芳[44]的研究不同鋅水平對肉雞ALP、LDH活性無顯著影響的結果相似。但與李林楓[40]在蛋雞中添加載鋅沸石提高肝臟ALP、LDH、MDH活性的研究結果出現(xiàn)差異。其原因可能是基礎飼糧中的鋅能夠滿足肉雞ALP、LDH、MDH對鋅的正常需求，且劉澤輝[43]報道發(fā)現(xiàn)，鋅水平對肉雞肝臟MDH活性無顯著影響。陳志敏等[45]的研究表明，飼糧中添加硫酸鋅顯著影響肝臟Cu-ZnSOD活性。本試驗發(fā)現(xiàn)，低鋅飼糧添加Zn-MMT顯著提高肉雞21和42日齡肉雞肝臟中Cu-ZnSOD活性，這與陳剛耀[3]在肉雞中添加載鋅沸石提高肝臟中Cu-ZnSOD活性研究結果相似。硅酸鹽黏土中金屬離子能在動物胃腸道內(nèi)緩慢釋放，持久維持組織細胞中鋅含量，并參與維持Cu-ZnSOD結構穩(wěn)定，抑制有害菌增殖，防止蛋白質(zhì)或氨基酸巰基的氧化，減少機體在代謝過程中產(chǎn)生的羥自由基[10,46-48]。

3.4 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞脾臟免疫功能的影響

鋅對維持動物機體的免疫器官的結構和功能具有重要作用，缺鋅或鋅過量會直接造成免疫器官萎縮或病變、免疫細胞數(shù)減少、抗體含量降低[46]。脾臟作為動物機體最大的免疫器官，參與機體免疫調(diào)控，經(jīng)T淋巴細胞以及B淋巴細胞主導的NF-κB通路調(diào)節(jié)獲得性免疫反應，同時參與胚胎發(fā)育、淋巴細胞生成及調(diào)控骨形成；NF-κB通常被隔離在未受刺激的細胞的細胞質(zhì)中，與IκB結合形成一個保守的三聚體復合物p50-p65-IκB，掩蓋了核定位序列，核定位序列暴露后能與IκB-α核導出序列結合，使IKB-α與NF-κB二聚體的復合物在細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)穿梭運動，轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與其相應的DNA序列結合從而促進靶基因的轉(zhuǎn)錄。另外，TRAF能直接或間接與受體結合，介導NF-κB通路信號轉(zhuǎn)導[49-51]。IL-4和IL-10通過Toll樣受體4(TLR4)、NF-κB和其他信號通路調(diào)節(jié)免疫反應以維持腸道健康的抗炎因子[52-54]。陳娜娜等[55]研究結果表明，適量的蛋氨酸鋅可顯著增加蛋雞盲腸內(nèi)容物中雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量，顯著減少大腸桿菌數(shù)量，但1 400 mg/kg蛋氨酸鋅反而極顯著增加了大腸桿菌數(shù)量，導致腸道菌群失調(diào)，生物屏障遭到破壞；且雙歧桿菌[56]能促進B淋巴細胞的分化成熟，誘導T淋巴細胞的增殖并參與T淋巴細胞、自然殺傷細胞及LAK的細胞分化，促進機體免疫器宮的生長、發(fā)育、成熟。羅有文[46]研究發(fā)現(xiàn)，一定量的載鋅凹土可以抑制肉雞空腸大腸桿菌的增殖，并適當增加乳酸桿菌的數(shù)量。本試驗研究表明，相比CK組，肉雞低鋅飼糧添加40 mg/kg的Zn-MMT顯著提高肉雞脾臟NF-κBp65、TRAF-2、TNFRSF1B、IκB-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10基因相對表達量。體內(nèi)的微生態(tài)系統(tǒng)與動物免疫之間的關系極為密切。Zn-MMT進入動物腸道后，可以吸附其中的氨、氨氣等極性分子，為嗜酸性的乳酸桿菌提供更優(yōu)良的生長環(huán)境，促進了有益菌的增殖，改善了腸道微生態(tài)系統(tǒng)，維持機體免疫功能。

4 結 論

① 低鋅玉米-豆粕型基礎飼糧中添加Zn-MMT可提高21和42日齡肉雞肝臟Cu-ZnSOD活性，增強肝臟抗氧化能力；但對42日齡肉仔雞血清和空腸黏膜中免疫球蛋白含量無顯著影響。

② 低鋅玉米-豆粕型基礎飼糧中添加40 mg/kg的Zn-MMT可顯著提高脾臟免疫相關基因的表達。