趙亞星 白 晨* 敖長金 呂可欣 徐珊珊 王曉淵 包志碧

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市畜牧工作站，巴彥淖爾 015000)

隨著2020年1月我國“禁抗令”的實施，天然、健康、無殘留、無毒副作用的植物提取物成為養(yǎng)殖業(yè)和飼料行業(yè)開發(fā)和研究的熱點，并作為飼料添加劑廣泛地應用在畜禽養(yǎng)殖中[1]。植物精油是從植物體內(nèi)提煉出的一類揮發(fā)性芳香物質(zhì)，主要包括萜類、酮類、醇類和醛類[2]。作為一種提取物，植物精油主要存在于植物的花、莖、葉、根和果實中[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加植物精油可影響反芻動物瘤胃發(fā)酵，能夠降低瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮(NH3-N)和乙酸濃度，提高瘤胃內(nèi)丙酸濃度[4]。飼糧中添加植物精油可調(diào)控瘤胃發(fā)酵狀態(tài)，進而改善動物生產(chǎn)性能和機體各項機能。Kholif等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳期母羊飼糧中添加辣椒精油可顯著改善母羊的免疫機能和健康狀況。Parvar等[6]在肉羊飼糧中添加500 mg/kg的阿魏精油，結(jié)果表明肉羊的干物質(zhì)采食量(DMI)顯著提高，且羊肉中n-3多不飽和脂肪酸含量顯著提高。

沙蔥(AlliummongolicumRegel)，別名蒙古韭，主要生長在我國西北部干旱地區(qū)，是一種營養(yǎng)物質(zhì)豐富的蔥屬植物[7]。沙蔥中含有多種活性成分，根據(jù)理化特性可分為黃酮類化合物、多糖和精油等[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥黃酮和沙蔥多糖在提高瘤胃內(nèi)微生物蛋白(MCP)濃度和維持瘤胃液pH等方面均具有積極作用[9-10]。但沙蔥精油對肉羊瘤胃發(fā)酵的研究鮮有報道。開展肉羊體內(nèi)試驗之前需要確定沙蔥精油是否對肉羊體外瘤胃發(fā)酵具有負面作用。因此，本試驗旨在研究體外條件下不同水平沙蔥精油對瘤胃發(fā)酵和底物干物質(zhì)(DM)降解率的影響，為未來沙蔥精油在肉羊體內(nèi)試驗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 沙蔥精油的制備

試驗所需的沙蔥粉(沙蔥風干后粉碎制得)由阿拉善盟某生物科技有限公司提供。沙蔥精油的制備參照烏仁張嘎[11]的方法。準確稱取沙蔥粉500 g，按料液比1∶(10～11)浸泡于蒸餾水中1.5 h，超聲波處理20 min，置于圓底燒瓶蒸餾3.5 h，于蒸餾出的液體中加入適量碳酸鈉，用石油醚萃取沙蔥精油，35 ℃回收石油醚，最終得到的淡黃色沙蔥精油保存于-20 ℃冰箱中備用。沙蔥精油得率為0.4%。通過氣相色譜法測得沙蔥精油中的主要活性成分為三硫化甲基烯丙基(21.30%)、二甲基三硫(10.77%)、二烯丙基三硫醚(7.65%)、2-甲基己烷(6.09%)等。

1.2 試驗動物及飼糧

選擇3只體況健康、體重為(37.1±0.5)kg的3月齡杜寒雜交羊作為瘤胃液供體羊。試驗羊進行單籠飼養(yǎng)，飼喂全混合日糧，參照我國《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T 816—2004)配制，精粗比為4∶6，全混合日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗羊每天飼喂2次(07:00和18:00)，自由飲水。

表1 全混合日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 試驗設(shè)計

試驗采取單因素完全隨機試驗設(shè)計。在發(fā)酵瓶(100 mL)中添加2 g底物，并分別添加0(對照組)、0.02(T1組)、0.04(T2組)、0.06(T3組)、0.08(T4組)、0.10(T5組)和0.12 mg(T6組)的沙蔥精油，每個培養(yǎng)瓶中加入10 mL瘤胃液和20 mL瘤胃緩沖液。沙蔥精油的添加水平參照包玲玲[9]和張宇宏[13]的試驗結(jié)果。每組設(shè)3個重復。底物與全混合日糧組成成分相同。培養(yǎng)時間為24 h。

1.4 體外發(fā)酵培養(yǎng)

1.4.1 瘤胃緩沖液的配制

瘤胃緩沖液的配制參照Menke等[14]的方法。分別準確量取微量元素液0.12 mL、碳酸鹽緩沖液237.00 mL、磷酸鹽元素液237.00 mL、指示劑1.22 mL，保持在39 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)，通入二氧化碳(CO2)至飽和，然后加入還原劑溶液(49.50 mL)，并加入蒸餾水使溶液總體積定容到1 000 mL，持續(xù)通入CO2使溶液由藍色變?yōu)榉圩仙?，最后變?yōu)闊o色。還原劑溶液需當天配制。

表2 瘤胃緩沖液各組分組成

1.4.2 體外發(fā)酵培養(yǎng)

于晨飼前通過口腔采集器采集供體羊瘤胃液，經(jīng)1層無菌無酶紗布過濾后放入保溫桶中迅速帶回實驗室，采用注射器將瘤胃液與瘤胃緩沖液(瘤胃液10 mL+瘤胃緩沖液20 mL)混合后分裝到100 mL已提前加入2 g底物的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶持續(xù)通入CO2。培養(yǎng)瓶于38 ℃、120×g的恒溫氣浴搖床中培養(yǎng)24 h，到達規(guī)定時間后迅速將培養(yǎng)瓶取出，進行冰浴，終止發(fā)酵。

1.4.3 樣品收集與處理

收集發(fā)酵前底物，分為3個平行樣，測定其營養(yǎng)成分。發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液無損轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中400×g離心，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中備用，下層沉淀物置于電熱鼓風干燥箱中105 ℃烘干24 h。恒重后使用電子分析天平進行稱重，計算底物DM降解率。上清液用于測定NH3-N、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、MCP濃度。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 飼糧中營養(yǎng)成分的測定

DM、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、鈣(Ca)、磷(P)含量參考AOAC(1990)[15]的方法測定，中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量參照Van Soest等[16]的方法測定。

1.5.2 pH的測定

發(fā)酵至24 h時，收集好各組發(fā)酵液，經(jīng)4層紗布過濾后立即使用預先校正好的便攜式手持pH計進行測定。

1.5.3 NH3-N、MCP和VFA濃度的測定

參照Broderick等[17]的方法測定發(fā)酵液NH3-N濃度，參照Wu等[18]的方法測定發(fā)酵液VFA濃度，參照Makkar等[19]的方法測定發(fā)酵液MCP濃度。

1.5.4 底物DM降解率的測定

底物DM降解率(%)=100×(發(fā)酵前底物DM含量-發(fā)酵后底物DM含量)/發(fā)酵前底物DM含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行初步整理，采用SAS 9.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 沙蔥精油對瘤胃體外發(fā)酵液pH及MCP、NH3-N濃度的影響

由表3可見，在體外培養(yǎng)24 h后，T2、T3、T4、T6組的發(fā)酵液pH顯著低于對照組(P<0.05)，T1、T5組的發(fā)酵液pH與對照組差異不顯著(P>0.05)。T1、T2、T3組的發(fā)酵液NH3-N濃度顯著高于對照組(P<0.05)，T4組的發(fā)酵液NH3-N濃度顯著低于對照組(P<0.05)，T5、T6組的發(fā)酵液NH3-N濃度與對照組差異不顯著(P>0.05)。T4組的發(fā)酵液MCP濃度顯著高于對照組(P<0.05)，T1、T2、T3、T5、T6組的發(fā)酵液MCP濃度與對照組差異不顯著(P>0.05)。

2.2 沙蔥精油對瘤胃體外發(fā)酵液VFA濃度的影響

由表3可見，在體外培養(yǎng)24 h后，T4組的發(fā)酵液丁酸和戊酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)，T1、T2、T3、T5、T6組的發(fā)酵液丁酸和戊酸濃度與對照組差異不顯著(P>0.05)。T1、T2、T3、T4、T5、T6組的發(fā)酵液總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度顯著高于對照組(P<0.05)。各組之間乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸濃度及乙酸/丙酸差異不顯著(P>0.05)。

表3 沙蔥精油對瘤胃體外發(fā)酵液pH及MCP、NH3-N濃度的影響

表4 沙蔥精油對瘤胃體外發(fā)酵液VFA濃度的影響

2.3 沙蔥精油對瘤胃體外DM降解率的影響

由表5可見，在體外培養(yǎng)24 h后，T4和T5組的底物DM降解率顯著高于對照組(P<0.05)。T1、T2、T3、T6組的底物DM降解率與對照組差異不顯著(P>0.05)。

表5 沙蔥精油對瘤胃體外底物DM降解率的影響

3 討 論

3.1 沙蔥精油對瘤胃體外發(fā)酵液pH的影響

瘤胃是天然的發(fā)酵罐，可利用在瘤胃內(nèi)棲息的大量微生物降解飼糧中的營養(yǎng)物質(zhì)[20]。瘤胃內(nèi)環(huán)境指標和營養(yǎng)物質(zhì)消化能力是評估瘤胃健康和反芻動物機體健康的重要指標[21]。

反芻動物瘤胃pH的波動能夠直接反映瘤胃內(nèi)環(huán)境狀態(tài)，pH的變化受飼糧結(jié)構(gòu)、唾液和瘤胃內(nèi)酸堿物質(zhì)的排出等多種因素的影響[22]。正常的瘤胃pH在5.00～7.50[23]。當pH在6.2～6.8時，瘤胃中纖維降解菌的活性最高；當pH在5.2～6.0時，瘤胃內(nèi)淀粉降解菌的活性最高；當pH小于5.5時，瘤胃內(nèi)原蟲的活性降低，反芻動物易發(fā)生瘤胃酸中毒[24]。本試驗發(fā)酵液的pH在6.15～6.35波動，均處于正常范圍內(nèi)，表明沙蔥精油對瘤胃微生物正常發(fā)酵代謝沒有產(chǎn)生不利影響。添加沙蔥精油導致pH下降的原因可能是沙蔥精油中的硫化物能夠促進發(fā)酵液中微生物對碳水化合物等底物進行降解，進而使VFA不斷積累，pH下降。

3.2 沙蔥精油對瘤胃體外發(fā)酵液NH3-N濃度的影響

NH3-N是瘤胃內(nèi)環(huán)境中一個重要指標，NH3-N濃度能夠反映瘤胃內(nèi)氮的供應與利用情況[25]。適宜的NH3-N濃度對于瘤胃微生物的生長以及MCP的合成具有重要意義[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，在體外條件下，適合瘤胃微生物生長的發(fā)酵液NH3-N濃度在5～8 mg/dL[27]。韓正康等[23]研究發(fā)現(xiàn)，當瘤胃發(fā)酵液NH3-N濃度為8.5 mg/dL，瘤胃微生物利用氮源合成MCP的能力達到飽和。本試驗中，發(fā)酵液NH3-N濃度在6.20～8.07 mg/dL，屬于微生物生長和蛋白質(zhì)合成的最佳范圍，并未對瘤胃發(fā)酵沒有產(chǎn)生不利影響。在體外培養(yǎng)24 h后，添加0.08 mg沙蔥精油時發(fā)酵液NH3-N濃度顯著降低，原因可能是沙蔥精油降低了瘤胃微生物對含氮物質(zhì)的分解作用，導致NH3-N濃度的降低，而未被瘤胃微生物分解的含氮物質(zhì)被微生物利用合成了MCP。

3.3 沙蔥精油對瘤胃體外發(fā)酵液MCP濃度的影響

瘤胃微生物可將飼糧中的蛋白質(zhì)降解為NH3-N，并利用NH3-N合成MCP為動物機體提供營養(yǎng)物質(zhì)[28]。MCP能夠滿足反芻動物蛋白質(zhì)需求量的40%～80%[1]。瘤胃中MCP濃度可反映瘤胃內(nèi)微生物數(shù)量以及攝取和利用NH3-N的能力[29]。本試驗結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)24 h后，添加沙蔥精油能夠提高發(fā)酵液MCP濃度，且添加0.08 mg時效果顯著，究其原因可能是MCP合成需要源源不斷的能量供應，能量供應充足能夠使瘤胃微生物最大程度利用NH3-N合成MCP。VFA是合成過程中主要的能量供應者，而本試驗發(fā)現(xiàn)，添加沙蔥精油能夠促進發(fā)酵液中微生物對碳水化合物等底物進行降解，使得TVFA濃度顯著增加，為MCP合成過程提供了更多的能量。原蟲與細菌存在拮抗作用，有研究發(fā)現(xiàn)植物精油對原蟲有抑制或殺滅作用[30]。因此，添加沙蔥精油可能通過抑制原蟲進而提高了發(fā)酵液中細菌數(shù)量，最終提高發(fā)酵液MCP濃度。

3.4 沙蔥精油對瘤胃體外發(fā)酵液VFA濃度的影響

瘤胃中VFA主要是由微生物發(fā)酵飼糧中碳水化合物生成，可為反芻動物提供所需能量的70%～80%[31]。瘤胃內(nèi)VFA的組成是反映微生物消化與代謝的關(guān)鍵指標[32]。本試驗結(jié)果表明，添加0.06和0.08 mg沙蔥精油提高了發(fā)酵液乙酸和丙酸濃度，降低了乙酸/丙酸。乙酸/丙酸是反映瘤胃發(fā)酵模式變化的重要指標[33]。當乙酸/丙酸>2.5時為乙酸型發(fā)酵，相反，當乙酸/丙酸<2.5時為丙酸型發(fā)酵[34]。乙酸型發(fā)酵的特點是能量利用率較低，丙酸型發(fā)酵的特點是丙酸產(chǎn)量較高，而丙酸是糖異生的重要前提物質(zhì)，因此，反芻動物可以利用更多的丙酸合成葡萄糖為機體提供能量[35]。在本試驗中，體外培養(yǎng)24 h后，添加不同水平的沙蔥精油均降低了發(fā)酵液乙酸/丙酸，且乙酸/丙酸<2.5，表明沙蔥精油可改變瘤胃的發(fā)酵類型，使瘤胃發(fā)酵向丙酸型發(fā)展，為機體提供更多的能量，有利于提高反芻動物的生產(chǎn)性能和飼料利用率。

3.5 沙蔥精油對瘤胃體外底物DM降解率的影響

體外營養(yǎng)物質(zhì)降解率能夠反映飼料在發(fā)酵體系中被瘤胃微生物的降解程度，是評價瘤胃發(fā)酵的重要指標之一[14]。體外DM降解率越高，說明瘤胃內(nèi)環(huán)境適合微生物繁殖、發(fā)酵，有利于提高飼料的營養(yǎng)物質(zhì)利用率[33]。本試驗研究結(jié)果表明，添加低水平的沙蔥精油對底物DM降解率沒有顯著影響，而添加0.08和0.10 mg沙蔥精油顯著提高了底物DM降解率，這表明沙蔥精油對底物的降解率與其添加水平密切相關(guān)。添加高水平的沙蔥精油可降低瘤胃發(fā)酵液的pH和MCP的合成效率，進而促進瘤胃內(nèi)微生物的大量繁殖，影響飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的降解。

4 結(jié) 論

沙蔥精油對肉羊體外瘤胃發(fā)酵有積極影響，添加0.08 mg沙蔥精油顯著降低了發(fā)酵液pH和NH3-N濃度，顯著提高了發(fā)酵液MCP、丁酸、戊酸、TVFA濃度以及底物DM降解率。