克羅恩?。–rohn's disease，CD）是一種腸道的持續(xù)性慢性炎癥疾病，其發(fā)病機制至今未明[1]，且病變呈跳躍性分布，病變腸段之間可存在正常腸段，病變腸段與正常腸段的分布尚無明顯規(guī)律可循。是何種機制造成了CD發(fā)病部位差異性如此巨大的特點？大量研究表明CD的病變部位分布可能與淋巴細胞歸巢有關，歸巢受體的表達差別可能決定了病變腸段的分布。那么淋巴細胞歸巢又受何種上游炎癥途徑調(diào)控與介導？這一現(xiàn)象值得深入研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 對象 選取廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院于2014年1月—2017年12月經(jīng)腸鏡及病理確診為CD的22例患者作為研究對象，年齡為18～39歲，平均年齡（27.0±4.2）歲；其中，男性12例，女性10例。另設10名行腸鏡示正常的健康人作為空白對照。

1.1.2 材料和儀器 CCR9、TLR4引物來源于北京鼎國生物技術有限公司。9700PCR儀來源于美國ABI公司。兔抗人CCR9、TLR4及羊抗兔二抗來源于美國SantCruz公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標本的采集 22例患者于腸鏡下分別在病變腸段及正常腸段取得黏膜組織，10名健康人亦于腸鏡下取組織標本。

1.2.2 RT-PCR檢測CCR9、TLR4在核酸水平的表達 提取結腸組織RNA后RT-PCR檢測CCR9、TLR4的表達，95℃ 3 min，95℃40 sec；54 ℃ 50 sec（β-actin），59 ℃ 50 sec（CCR9、TLR4）；72℃ 50 sec共30循環(huán)；72℃ 10 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳，計算積分光密度。

1.2.3 Western blotting檢測CCR9、TLR4在蛋白水平的表達 結腸標本蛋白提取后上樣于凝膠，于86 V下電泳80 min，轉膜1 hr，封閉1 hr。分別加入一抗1 hr。洗去一抗；封閉液處理。加入對應二抗1 hr。洗去二抗。顯色4 min，顯影1 min，定影5 min。計算條帶的積分密度。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，計量資料以（均數(shù)±標準差）表示，采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。Pearson分析法分析各計量資料之間的相關性。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測CCR9、TLR4在CD患者腸道不同病變部位的表達

CD患者病變腸段組CCR9、TLR4的表達高于CD患者正常腸段組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CD患者正常腸段組、CD患者病變腸段組均高于正常組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。正常人結腸內(nèi)未觀察到CCR9、TLR4表達。見圖1，表1。

圖1 RT-PCR檢測CCR9、TLR4的表達

表1 RT-PCR檢測各組樣本CCR9、TLR4的表達（±s）

表1 RT-PCR檢測各組樣本CCR9、TLR4的表達（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與CD患者正常腸段組比較，#P＜0.05

正常組（n=10） 0 0 CD患者正常腸段組（n=22） 0.54±0.18＊ 0.11±0.02＊CD患者病變腸段組（n=22） 0.85±0.23＊# 0.32±0.07＊#

2.2 Western blotting檢測CCR9、TLR4在CD患者腸道不同病變部位的表達

CD患者病變腸段組織中CCR9、TLR4的表達高于CD患者正常腸段，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CD患者正常腸段組、CD患者病變腸段組均高于正常組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。正常人結腸內(nèi)未觀察到CCR9、TLR4表達。見圖2，表2。

圖2 Western blotting檢測CCR9、TLR4的表達

表2 Western blotting檢測各組樣本CCR9、TLR4的表達（±s）

表2 Western blotting檢測各組樣本CCR9、TLR4的表達（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與CD患者正常腸段組比較，#P＜0.05

?

2.3 CCR9與TLR4表達水平的相關性

CCR9與TLR4在核酸表達水平呈明顯正相關（r=0.842，P＜0.05）。CCR9與TLR4在蛋白表達水平上亦呈明顯正相關（r=0.791，P＜0.05）。

3 討論

CD的發(fā)病機制一直是當前胃腸道疾病的研究熱點之一。有學者提出了淋巴細胞歸巢（lymphocyte homing，LH）可能作為CD發(fā)病的始動因素[2]。國內(nèi)外已有動物試驗證實在IBD的動物模型中，可觀察到LH的活化水平升高。類似的研究都表明，LH水平的升高是腸道細胞免疫的炎癥反應中重要的一環(huán)，其與IBD的發(fā)病密切相關[3-4]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，在CD患者病變部位，趨化因子受體9（chemokine receptor 9，CCR9）的表達明顯升高，CCR9是淋巴細胞歸巢重要的受體之一，其升高說明局部淋巴細胞歸巢的活化，而CCR9的升高程度與病變部位的炎癥反應呈正比，說明淋巴細胞歸巢介導了下游炎癥反應的產(chǎn)生，其表達的升高與發(fā)病部位相關[5-8]。這與已有的動物實驗結果是相一致的。雖然淋巴細胞歸巢參與了CD的發(fā)病機理，但什么原因?qū)е铝薈D局部病變部位炎癥的起始及放大，使得相對整個腸道來說，只有局部特定部位才會出現(xiàn)淋巴細胞歸巢水平的升高？本研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細胞歸巢的受體CCR9與Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）密切相關，在CD患者的病變部位，不僅可觀察到TLR4的明顯升高，而且CCR9也與其保持一致；CD患者腸道的正常部位仍有TLR4的升高，且CCR9亦與其保持一致，這一現(xiàn)象值得進一步探討。已有相當多的研究表明，CD的發(fā)病與TLR4密切相關[9-10]。結合本試驗結果，我們推測，TLR4不但參與了CD的發(fā)病，而且其介導的淋巴細胞歸巢也是形成CD病變處于腸道不同部位的重要原因。Toll樣受體率先對原本耐受的微生物或其成分形成應答而不再耐受，Toll樣受體活化后即通過其跨膜傳遞信號的特點相繼激活下游炎癥因子，將免疫失衡的信號放大傳遞給細胞及體液免疫系統(tǒng)，由此最終導致淋巴細胞歸巢的水平變化，不僅如此，腸道不同部位的免疫穩(wěn)態(tài)并不一定一致，在免疫嚴重失衡的部位，調(diào)控淋巴細胞歸巢水平的免疫因素也更加活躍，這一系列反應最終導致歸巢的淋巴細胞大量游出并粘附至相關病變部位，最終導致了病變的發(fā)生[11-14]，這即可能成為CD的發(fā)病機制。

綜上所述，本試驗認為引起CD病變部位不同的機制可能與CCR9、TLR4介導的淋巴細胞歸巢有關，其具體機制為Toll樣受體介導的免疫失衡引起了病變部位淋巴細胞歸巢的活化。