方 旋 溫敬偉 陳 粵 范 敏 馬星霞

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院木材工業(yè)研究所 北京 100091；2.南越王宮博物館 廣州 510030；3.廣州市翰瑞文物保護(hù)設(shè)計研究中心 廣州 510500)

近年來，隨著文物保護(hù)事業(yè)的發(fā)展和文物保護(hù)需求的增加，微生物技術(shù)在文物保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多，發(fā)揮的作用越來越大，至2010年，文化遺產(chǎn)微生物學(xué)甚至已發(fā)展成為一門獨(dú)立的交叉學(xué)科而正式出現(xiàn)(Mitchelletal.，2010；徐潤林，2013)。我國對文化遺產(chǎn)微生物學(xué)的研究實(shí)際早已開始，特別是在古代壁畫和木質(zhì)棺槨的微生物病害方面有過很多報道(馮清平等，1998；湯顯春等，2003；葛琴雅等，2012)。

對于木質(zhì)文物，因木材為生物質(zhì)材料，故其最嚴(yán)重的生物敗壞是由真菌引起的(Zabeletal.，1992)。木材敗壞真菌按其對木材的敗壞特點(diǎn)不同可分為腐朽菌、變色菌和霉菌(馬星霞等，2011)，腐朽菌分泌降解酶，降解木質(zhì)素、纖維素或其他木材成分，導(dǎo)致木材腐朽、強(qiáng)度下降；霉菌和變色菌侵染木材表面，引起木材發(fā)霉和變色，產(chǎn)生真菌毒素，是致病性因子和過敏原，并可通過建筑從木質(zhì)構(gòu)件傳播到非木質(zhì)構(gòu)件，對建筑材料、構(gòu)筑物和居住者的健康產(chǎn)生直接或間接影響(馬星霞等，2011；Singh，1991；1996)。對于出土的飽水木質(zhì)文物，由于需要保濕保存，特別容易滋生霉菌，引起敗壞。在館藏環(huán)境中，霉菌會對博物館環(huán)境以及置身于其中的人員造成健康風(fēng)險，因此，文物保護(hù)者對防霉殺菌的研究從未中斷(Singh，2000；胡東波等，2003；李東風(fēng)等，2013；陳家昌等，2015；丁佳榮等，2018)。

廣州南越國宮署遺址是2 000多年前西漢南越國的王宮所在地，也是1 000多年前五代十國南漢國都城興王府的宮殿區(qū)和宮苑所在，遺址中的木暗渠、木質(zhì)水槽等木質(zhì)文物(圖1)是研究秦漢時期歷史、科技、經(jīng)濟(jì)以及諸侯王宮城市排水系統(tǒng)的寶貴實(shí)物資料。其中的水井展示區(qū)遺址于2006年通過考古發(fā)掘揭露出來，2009年為配合遺址博物館建館需要，采取了臨時回填保護(hù)措施，至2011年底博物館館舍建筑完成后重新清理開挖，并于2012年1月開始對外開放(溫敬偉，2019)。木質(zhì)水槽、木暗渠等木質(zhì)文物采取原位保存方式，渠體一半埋藏于地下，一半裸露展示供游客參觀，游客參觀棧道離地面約2 m。

圖1 南越國宮署遺址中的木質(zhì)水槽和木暗渠Fig.1 Wooden flume and underdrain in the Nanyue National Palace site

這些出土的飽水古木材，雖然長期埋藏于地下環(huán)境中導(dǎo)致本身的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生一些變化，但是還保持著木材的主要成分，微生物侵蝕仍是其敗壞劣化的主要因素之一(馬菁毓，2004；王亞麗，2013)。出土前，木質(zhì)文物微生物降解主要來自侵蝕細(xì)菌和軟腐真菌(Blanchetteetal.,1991；Kimetal.,1996；Bj?rdaletal.，1999)；但當(dāng)被發(fā)掘出來暴露于空氣中后，環(huán)境因素發(fā)生劇烈變化，木質(zhì)文物更易遭受一些腐生真菌侵蝕(陳家昌等，2015；陳庚齡等，2009)。據(jù)南越王宮博物館文保工作人員介紹，對南越國宮署遺址發(fā)掘現(xiàn)場的木暗渠本體木材和附近土壤分別取樣進(jìn)行微生物分離鑒定，木材樣本分離鑒定出5種菌株，土壤樣本分離鑒定出3種菌株，木質(zhì)文物存在霉變和腐朽風(fēng)險，因此博物館在對這些木質(zhì)文物進(jìn)行脫水處理后，2015年選取其中分布在遺址北部水井展示區(qū)的2段南越國木暗渠實(shí)施整體套取搬進(jìn)文物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室并進(jìn)行脫鹽脫水加固保護(hù)。在脫水加固保護(hù)過程中，借鑒以往木質(zhì)文物防腐經(jīng)驗(yàn)，首先在木暗渠構(gòu)件本體表面噴灑可降解防霉劑進(jìn)行消毒，然后用福爾馬林溶液處理木構(gòu)件以避免霉菌生長。2017年完成脫水保護(hù)后至今，在日常保濕維護(hù)中，每周至少進(jìn)行1次防霉處理，采取了比較精細(xì)的保護(hù)管理辦法(溫敬偉，2019)。

由于南越國宮署遺址出土的木質(zhì)文物原位保存，與地面是接觸狀態(tài)，為弄清楚是否存在木材腐朽菌和其他敗壞微生物生長，以及如何更好對遺址展示的木質(zhì)文物進(jìn)行本體保護(hù)，本研究對疑似真菌生長的木質(zhì)水槽和真菌子實(shí)體樣本取樣，采用傳統(tǒng)組織分離技術(shù)分離純化真菌，并采用高通量測序技術(shù)對樣本真菌組成和豐度進(jìn)行測試，以期為評估木質(zhì)水槽微生物病害以及進(jìn)一步研發(fā)本體保護(hù)方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 木質(zhì)水槽病害勘察與標(biāo)本采集

現(xiàn)場勘察南越國宮署遺址出土的木質(zhì)水槽，對其疑似真菌生長癥狀一一記錄拍攝，并用鑷子夾取帶有疑似組織的少量木材組織和子實(shí)體。為防止非靶標(biāo)菌污染，標(biāo)本采集后立即密封于牛皮紙袋中，迅速送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織分離或冷藏在冰箱內(nèi)以逐步分離。

1.2 真菌分離純化

在無菌操作臺上挑取少量木材組織浸于濃度0.1%的升汞中表面消毒3～5 min，再用無菌水漂洗3遍，然后轉(zhuǎn)移到含50 μg·mL-1氨芐青霉素的2%瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待瓊脂培養(yǎng)基長出菌落，沿菌落邊緣挑取單根菌絲在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)以獲得純化菌株；如果發(fā)現(xiàn)菌株性狀不純，則重復(fù)挑取單根菌絲培養(yǎng)直至獲得純化菌株(方中達(dá)，1998)。從土壤中采集的子實(shí)體樣本同樣進(jìn)行上述分離純化。

1.3 真菌生長特性與生長速度觀察

參照馬星霞等(2009)方法，將純化菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～10天，用內(nèi)徑5 mm的打孔器打出菌餅，接種在倒有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于溫度28 ℃、相對濕度80%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察各真菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落生長特性，測量每天生長量，并在顯微鏡下觀察其顯微形態(tài)特征，初步分辨真菌種類。

1.4 真菌分子鑒定

1.4.1 基因組DNA抽提與PCR擴(kuò)增 收集純化菌株足夠量菌絲或孢子聚集體，外加子實(shí)體材料，參照Kirker等(2012)采用SDS-CTAB法提取各菌株基因組DNA，利用rDNA-ITS序列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

DNA提取流程：取樣約0.1 g至1 mL移液管內(nèi)，向每份樣品中添加800 μL CTAB(含β-巰基乙醇)，用鉆/塑料杵研磨30 s，并在65 ℃下溫浴30 min～1 h。15 000g離心3 min后，上清液轉(zhuǎn)移到Promega Wizard SV基因組試劑盒(美國Promega)的離心柱中，按照操作流程進(jìn)行基因組DNA提取，提取的總DNA采用分光光度計(Thermo Scientific,美國)進(jìn)行定量分析。

PCR引物序列(Whiteetal.，1990；Gardesetal.，1993)分別為ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3′和ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min后，隨即進(jìn)入92 ℃變性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s的循環(huán),共進(jìn)行35個循環(huán),最后于72 ℃延伸10 min,終止溫度4 ℃。

1.4.2 序列分析與分子鑒定 將PCR產(chǎn)物送樣至北京新時代眾合科技有限公司測序，序列在www.ncbi.nlm.nih.gov的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST檢索和進(jìn)化樹分析，結(jié)合培養(yǎng)性狀進(jìn)行真菌分子鑒定。

1.5 真菌高通量測序分析

參照木材和木質(zhì)文物微生物群落研究方法(李東風(fēng)等，2013；丁佳榮等，2018)，提取樣本中所有微生物DNA，并利用PCR擴(kuò)增對DNA樣本進(jìn)行檢測，擴(kuò)增引物為真菌通用引物ITS1和ITS2：5′-GCGTTCTTCATCGATGC-3′。產(chǎn)物目的條帶大小正確且總量滿足建庫需要的送至北京奧維森科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq 2500高通量測序，得到真菌序列操作分類單元OTUs(operational taxonomic units)，通過對相似水平97%以上的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計分析歸類操作，了解樣本菌種、菌屬等數(shù)目信息。利用平臺及Qiime(Version 1.8.0，http:∥qiime.org/)和 Vsearch(2.7.1，https:∥github.com/torognes/vsearch)軟件對樣本中的微生物進(jìn)行α多樣性分析。采用BLAST等方法對OTU代表序列進(jìn)行比對，并在各分類水平(門、綱、目、科、屬、種)注釋其群落的物種信息，分析物種組成和共有核心物種，進(jìn)行樣本聚類分析和聚類heatmap圖示，通過顏色梯度和相似程度反映多份樣本在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)水槽病害勘察與標(biāo)本采集

現(xiàn)場詳細(xì)觀察木質(zhì)水槽表面狀況，對白斑、疑似微生物子實(shí)體的革質(zhì)物質(zhì)以及菌絲樣絲狀物等一一記錄拍攝，采集疑似真菌侵染的木質(zhì)樣本4份，分別標(biāo)記為YN1、YN2、YN3和YN4，在水槽附近土壤中采集擔(dān)子菌傘狀子實(shí)體1份，標(biāo)記為YN5(圖2)。

圖2 木質(zhì)水槽和木暗渠病害Fig.2 Diseases of wooden flume and underdrain

2.2 真菌分離結(jié)果與培養(yǎng)性狀觀察

4份木質(zhì)樣本經(jīng)組織分離、純化共獲得21株純化菌株，通過初步培養(yǎng)性狀觀察結(jié)合分子鑒定得到11種真菌(表1)。

表1 各樣本分離到的真菌Tab.1 Fungi species isolated from each specimen

YN1分離到3株真菌，其中2株在PDA培養(yǎng)基上生長性狀類似，菌落黃綠色，氣生菌絲在菌落中間厚重且突起，邊緣較薄且具輪紋；培養(yǎng)皿內(nèi)有多個小菌落，說明孢子在培養(yǎng)過程中易彈射形成了新的生長中心；顯微觀察其孢子囊無囊狀膨大，帚狀枝、輪生，瓶梗瓶狀，分生孢子小、球形，結(jié)合真菌PCR擴(kuò)增序列BLAST分析，鑒定其為子囊菌門(Ascomycota)散囊菌綱(Eurotiomycetes)散囊菌目(Eurotiales)曲霉科(Aspergillaceae)青霉屬(Penicillium)真菌(圖3中5號菌)；1株在PDA培養(yǎng)基上放射狀生長，菌絲灰白，菌落土黃色，粉質(zhì)，從生長性狀上難以鑒定，序列BLAST和進(jìn)化樹分析鑒定其為半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Hyphomycetales)叢梗孢科(Moniliaceae)擬青霉屬(Paecilomyces)真菌(圖3中6號菌)。

YN2分離到4株真菌，其中2株在PDA培養(yǎng)基上與YN1分離到的青霉屬真菌生長性狀類似，分子鑒定為同一種菌；1株在PDA培養(yǎng)基上菌絲白色綿狀，不產(chǎn)孢，從生長性狀上難以鑒定，序列BLAST鑒定其為子囊菌綱(Ascomycetes)球殼目(Sphaeriales)蕉孢殼科(Diatrypaceae)毛狀彎孢聚殼座菌(Eutypella)(圖3中9號菌)；1株在PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，菌絲白色，不產(chǎn)孢，從生長性狀上難以鑒定，序列BLAST鑒定其為枝頂孢霉菌(Acremonium)(圖3中4號菌)。

YN3分離到7株真菌，其中3株為木霉菌(Trichoderma)(圖3中12號菌)、2株為節(jié)菱孢霉菌(Arthrinium)(圖3中11號菌)、1株為鐮孢菌(Fusarium)(圖3中7號菌)、1株為枝孢瓶霉菌(Cladophialophora)(圖3中2號菌)。木霉菌在PDA培養(yǎng)開始為綠色孢子團(tuán)鋪開生長，后菌絲生長致密，孢子為淺綠色圓球狀，瓶梗短、小而多。節(jié)菱孢霉菌在PDA培養(yǎng)基上菌絲白色絮狀，不產(chǎn)孢。鐮孢菌菌絲白色，放射狀生長，孢子為鐮刀型典型孢子。枝孢瓶霉菌在PDA培養(yǎng)基上生長較慢，有輪紋，菌絲黑灰色，致密，不產(chǎn)孢。

YN4分離到7株真菌，其中2株為曲霉菌(Aspergillus)(圖3中3號菌)、1株為籃狀菌(Talaromyces)(圖3中1號菌)、2株為木霉菌、1株為青霉菌、1株為鐮孢菌(圖3中10號菌)。曲霉菌菌絲短，邊緣暗藍(lán)色，中間灰色、皺縮，分生孢子多、球形或近球形?；@狀菌顏色鮮艷，生長緩慢，邊緣菌絲白色，中部亮黃色突起，有小液滴滲出。鐮孢菌菌絲緊貼培養(yǎng)基生長，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，鐮刀型孢子。

從土壤中采集的子實(shí)體樣本PDA培養(yǎng)純化菌株菌絲和子實(shí)體直接進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增后測序，結(jié)合子實(shí)體性狀鑒定為純黃白鬼傘(Leucocoprinusbirnbaumii)(圖3中8號菌)，該菌在PDA培養(yǎng)基上氣生菌絲不發(fā)達(dá)，白色絮墊狀，有皺縮，生長緩慢。

圖3 分離到的真菌在PDA培養(yǎng)基上的生長性狀Fig.3 Growth characteristics of fungi isolated on PDA1.籃狀菌Talaromyces；2.枝孢瓶霉菌Cladophialophora；3.曲霉菌Aspergillus；4.枝頂孢霉菌Acremonium；5.青霉菌Penicillium；6.擬青霉菌Paecilomyces；7.鐮孢菌Fusarium；8.純黃白鬼傘Leucocoprinus birnbaumii；9.聚殼座菌Eutypella；10.鐮孢菌Fusarium；11.節(jié)菱孢霉菌Arthrinium；12.木霉菌Trichoderma.

包括子實(shí)體在培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)的菌株，所有樣本共分離到22株純化菌株，分屬于12種真菌，其中青霉菌和木霉菌分離比例較高，青霉菌在YN1、YN2和YN4樣本上共分離到5株，木霉菌在YN3和YN4樣本上共分離到4株。12種真菌生長速度差別較大，木霉菌生長最快，一般3天即可長滿培養(yǎng)皿；擬青霉菌、聚殼座菌、鐮孢菌、節(jié)菱孢霉菌生長速度正常，每天生長12～17 mm；其他菌生長很慢，每天只生長2～3 mm。

2.3 真菌多樣性分析

2.3.1 樣本真菌α多樣性 單樣本多樣性分析(α多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性。表2中凈序列為去除嵌合體、短序列后的優(yōu)質(zhì)序列，Chao1值為菌種豐富度指數(shù)，用于估計群落中操作分類單元(OTUs)數(shù)目，Chao1 值越大，微生物群落多樣性越大。凈序列采用聚類(或降噪)方式生成OTUs，4份木質(zhì)樣本含有的OTUs分別為182、168、213和191，說明每份樣本的群落多樣性均比較豐富。

表2 樣本α多樣性指數(shù)Tab.2 α diversity index of specimen

Shannon值用于估計樣本微生物群落多樣性，Shannon值越大，群落多樣性越高，4份木種樣本的Shannon值分別為4.58、2.77、2.58和3.23。Simpson 值兼顧群落豐富度和均勻度，與物種豐富度呈正相關(guān)。Good’s_coverage 是一個間接判斷測序數(shù)據(jù)是否足夠的指標(biāo)，其越接近1.0，樣本中序列被測出的概率越高，4份木質(zhì)樣本的Good’s_coverage皆為1.0，說明測出的序列比較徹底，可代表樣本中微生物的真實(shí)情況。

譜系多樣性指數(shù)兼顧物種豐度和進(jìn)化距離，基于系統(tǒng)發(fā)育樹計算，用各樣本中OTUs的代表序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹距離，將某一樣本中所有代表序列的枝長加和，數(shù)值越大，群落多樣性越高，4份木質(zhì)樣本的譜系多樣性指數(shù)最小為38.76，最大為47.01，YN2的群落多樣性較低，YN3的群落多樣性較高，與Chao1 值和OTUs反映的多樣性結(jié)果一致。

2.3.2 樣本在門、綱、目、科、屬上的物種組成 圖4顯示了相對豐度大于1%的樣本在門、屬分類水平上的真菌種類和相對豐度信息。在門水平上，4份木質(zhì)樣本均以子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)為主，且子囊菌門占比高于擔(dān)子菌門，子囊菌門占比分別為71%、78%、64%和92%，擔(dān)子菌門占比分別為18%、21%、35%和5%，YN4的子囊菌門占比最高，YN3的擔(dān)子菌門占比最高。在屬水平上，根據(jù)圖中顏色很容易看到各樣本菌落組成及大致占比和優(yōu)勢菌屬，結(jié)合圖5樣本物種組成可視化展示，能夠清楚看出各樣本在門、綱、目、科、屬、種上的真菌組成和比例以及種的分類地位。YN1占比最高的是畸腔菌(Teratosphaeria)，比例為22%；YN2的優(yōu)勢菌屬為占比53%的外瓶霉菌(Exophiala)；YN3中有2種菌的占比較大且比例相當(dāng)，一是肉座菌目(Hypocreales)的一個菌種，占比44%，無法定義到具體種；二是擔(dān)子菌純黃白鬼傘，占比34%；YN4的優(yōu)勢菌屬為占比51%的曲霉菌。

圖4 樣本在門和屬上的物種組成Fig.4 Species composition of samples on phylum and genus

圖5 樣本物種組成可視化展示Fig.5 Visualization of sample species composition

2.3.3 核心OTUs分析 Venn圖可用于統(tǒng)計多份樣本中共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，直觀表現(xiàn)環(huán)境樣本的OTU數(shù)目組成相似性和重疊情況。圖6顯示，4份木質(zhì)樣本均含有的OTUs數(shù)目33個，其中6個注釋不到具體屬種，剩余27個OTUs具體為22種真菌(表3)。

圖6 樣本VennFig.6 Venn of sample species

高山被孢霉菌和長孢被孢霉菌屬于被孢菌門(Mortierellomycota)，帚狀費(fèi)爾氏酵母、費(fèi)爾氏酵母和純黃白鬼傘屬于擔(dān)子菌門，其他屬于子囊菌門。對照分離、純化的真菌種類，土壤中的子實(shí)體培養(yǎng)物純黃白鬼傘在4份木質(zhì)樣本中均被檢測到，且在YN3中的占比較高；青霉菌以及分屬于鐮孢菌、曲霉菌、麥角菌、枝孢瓶霉菌和木霉菌的純化菌株均為4份木質(zhì)樣本中共有的真菌；枝頂孢霉菌屬于肉座菌目。4份木質(zhì)樣本在博物館不同位置和木質(zhì)水槽中采集，其共有的真菌應(yīng)屬于木質(zhì)水槽上廣泛存在的真菌，高通量測序結(jié)果與傳統(tǒng)組織分離結(jié)果互相印證、互為補(bǔ)充。

2.3.4 樣本聚類分析 圖7所示為4份木質(zhì)樣本中豐度較高的前20屬菌的聚類分析?？梢钥闯?，豐度較大的為外瓶霉菌、曲霉菌、畸腔菌、白鬼傘菌、費(fèi)爾氏酵母、木霉菌、枝孢瓶霉菌、鐮孢菌、紅酵母菌、Colacogloea、青霉菌、Papiliotrema、Acremoniopsis、Cyphellophora、Saitozyma、黑蔥花霉菌、Collarina、蠟孔菌和Uncispora，其中前11個屬于4份木質(zhì)樣本中共有的種類。表4統(tǒng)計了4份木質(zhì)樣本優(yōu)勢菌分布及所占比例，可以看作整個博物館環(huán)境及木質(zhì)水槽和木暗渠中的優(yōu)勢菌群結(jié)果，占比較大的分別為16.38%的外瓶霉菌、12.96%的曲霉菌、9.27%的畸腔菌和8.54%的純黃白鬼傘菌。

表4 樣本優(yōu)勢菌分布及所占比例Tab.4 The distribution of dominant fungi and their proportion

圖7 樣本豐度較高的前20屬菌的聚類分析Fig.7 Cluster bar tree of the top 20 genus

3 討論

廣州地區(qū)空氣干濕變化大，對展廳內(nèi)的文物會造成一定影響，如果館內(nèi)使用空調(diào)，濕度減少會使文物龜裂，如果在室內(nèi)噴灑水霧，濕度增大則增加霉菌生長機(jī)會(譚秋明等，2012)。南越王宮博物館在發(fā)掘現(xiàn)場曾對木暗渠本體木材和附近土壤分別取樣進(jìn)行微生物分離鑒定，木材樣本分離鑒定出5種菌株，分別為青霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬，土壤樣本分離鑒定出3種菌株，分別為鐮刀菌屬、青霉屬和葡萄球菌屬，在前期保護(hù)和日常維護(hù)中博物館采取了殺菌防霉措施(溫敬偉，2019)。本研究從采集到的病害標(biāo)本中仍分離到12種真菌，說明目前的保護(hù)措施未能完全抑制木質(zhì)文物的敗壞微生物生長，也說明在原位展示和目前采取的防霉措施下，敗壞微生物也發(fā)生了變化。在分離到的真菌中，有一半種類生長非常緩慢，分析也許是對目前防霉劑的一種適應(yīng)性反應(yīng)。

不同微生物對文物造成的病害不同，對文物的影響程度也不同，只有充分掌握病害微生物狀況，才能使保護(hù)措施達(dá)到預(yù)期效果(Bj?rdal，2012)。生物敗壞是群體作用而非單個微生物作用(R?llekeetal.，2000；范曉丹等，2015)，傳統(tǒng)組織分離方法不能獲取全部敗壞真菌，難于得到全面的真菌信息，而無需進(jìn)行真菌分離的基于DNA分析的擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)提供了很好地了解任何基質(zhì)上微生物群落多樣性的方法(Lindahletal.，2013；Maetal.，2017)。在文物上，這種方法常被用來分析彩塑、壁畫、墓室里以及遺址表面的微生物群落(武發(fā)思等，2012；2013；Duanetal.，2017；2018)。幸晶晶等(2018)采用該方法分析了飽水木漆器中的細(xì)菌病害信息，本研究采用高通量測序技術(shù)分析了出土原址館藏環(huán)境下的木質(zhì)文物真菌病害多樣性。一般認(rèn)為，傳統(tǒng)組織分離技術(shù)對細(xì)菌的信息獲取率不足1%，而真菌可以達(dá)到很高的獲取率(Sterflinger,2010)。從本研究結(jié)果看，傳統(tǒng)組織分離技術(shù)的作用仍然有限，每份樣本據(jù)測序超過100個OTUs，但分離僅獲取12種菌株，而且測序顯示有些豐度很高的菌并沒有分離到。測序技術(shù)為全面了解木質(zhì)文物和館藏環(huán)境微生物病害信息提供了非常好的手段，不過，如果針對病害微生物篩選藥劑、實(shí)驗(yàn)室研究防治方法等仍需要分離出純菌，通過培養(yǎng)和保存，為后期針對特定菌群的防治措施提供基礎(chǔ)。

防止博物館霉菌生長以及對污染物品制定適當(dāng)?shù)奶幚泶胧┦切迯?fù)者、博物館館長和建筑師面臨的挑戰(zhàn)，因?yàn)槠洳粌H對物品的清潔和保存技術(shù)有影響，而且對修復(fù)者和其他博物館人員的職業(yè)安全和健康也有影響(Sterflinger，2010)。采集到子實(shí)體的擔(dān)子菌純黃白鬼傘是一種有毒真菌，在土壤中生存活力非常強(qiáng)，用常規(guī)辦法難以清除，多菌靈、百菌清、土霉素、農(nóng)用鏈霉素、甲基托布津等殺菌藥劑對其都不起作用，攝入后可引起嘔吐、惡心和腹瀉等癥狀(Duttaetal.，2011)。據(jù)本研究測序得知，4份木質(zhì)樣本中均或多或少含有此菌，雖然沒有在木質(zhì)文物上長出子實(shí)體，但對木質(zhì)文物具有潛在的生物降解風(fēng)險，具體是否會引起木材降解還需進(jìn)一步研究。

測序豐度最高的外瓶霉屬真菌在組織分離中并沒有得到，分析認(rèn)為：枝孢瓶霉屬和外瓶霉屬同屬于外瓶霉科，外瓶霉科在4份木質(zhì)樣本中所占比例分別為21%、55%、5%和0.7%，平均為20.4%，在博物館木質(zhì)水槽中占比優(yōu)勢明顯，由于序列BLAST庫的差異，與分離到的2號菌株枝孢瓶霉也許為同一種真菌。外瓶霉屬真菌對五氯酚和雜酚油都有很強(qiáng)的耐藥性(袁毅等，1996)，后續(xù)篩選合適的殺菌劑是個挑戰(zhàn)。

據(jù)報道，籃狀菌能合成降解木質(zhì)纖維素的酶(Simonaetal.，2018)，本研究得到的1株籃狀菌會不會對木材和木質(zhì)文物發(fā)生降解有待進(jìn)一步研究。

其他常見的容易產(chǎn)生分生孢子、在培養(yǎng)基上也具有明顯孢子團(tuán)聚生的曲霉菌、青霉菌、木霉菌和擬青霉菌等很容易使博物館中的微生物孢子量增加造成環(huán)境污染，建議建立微生物監(jiān)測制度，獲取微生物數(shù)量、種類和多樣性變化信息，其定量和定性分析對文物本體表面和儲存環(huán)境保護(hù)均有重要意義(Lech，2015)。

4 結(jié)論

南越國宮署遺址出土的木暗渠和木質(zhì)水槽在原位保存和目前比較精細(xì)的保護(hù)措施下，依然有豐富的真菌生長。經(jīng)傳統(tǒng)組織分離方法檢測到遺址木質(zhì)文物上有11種子囊菌，超過一半在PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，土壤中采集到的子實(shí)體鑒定為有毒擔(dān)子菌純黃白鬼傘。高通量測序技術(shù)檢測到木質(zhì)文物中真菌群落組成以子囊菌門和擔(dān)子菌門為主，其中子囊菌門占比高于擔(dān)子菌門。4份木質(zhì)樣本中普遍存在22種真菌，豐度較高的4種菌為外瓶霉菌(16.38%)、曲霉菌(12.96%)、畸腔菌(9.27%)和純黃白鬼傘(8.54%)。土壤中采集分離到的擔(dān)子菌純黃白鬼傘在木質(zhì)文物中也均被檢測到。這些真菌有些對環(huán)境和人群具有潛在的健康影響，有些造成木質(zhì)文物產(chǎn)生革質(zhì)、斑點(diǎn)等污漬，有些對木質(zhì)文物具有降解風(fēng)險。通過真菌多樣性研究了解木質(zhì)文物原位保存與展示環(huán)境下微生物的種類和豐度，其定量和定性分析對木質(zhì)文物本體和儲存、展示環(huán)境保護(hù)均有重要意義。傳統(tǒng)組織分離技術(shù)得到可實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)菌株不僅實(shí)際驗(yàn)證了真菌的存在，也為進(jìn)一步了解真菌對木質(zhì)文物的危害并有針對性地篩選合適的殺菌劑奠定基礎(chǔ)。