◎ 李 濱，張俊杰，徐 潔，張 磊

（江蘇海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222000）

隨著我國對(duì)牛奶中抗生素殘留問題關(guān)注度的提高和部分乳制品企業(yè)“無抗奶”目標(biāo)的制定和提出，抗生素殘留成為了人們關(guān)注的食品健康問題，“無抗奶”這個(gè)名詞也成為了生產(chǎn)者和消費(fèi)者重點(diǎn)關(guān)注的話題。β-內(nèi)酰胺酶作為一種常見的抗生素分解酶常被不法商販用來掩蓋牛奶中的抗生素殘留[1]。目前市場上用來檢測抗生素殘留的方法有微生物法、碘量法、酸量法、顯色頭孢菌素法和高效液相色譜法等。其中微生物法與碘量法都因其具有成本低[2]、操作簡單[3]等特點(diǎn)而被實(shí)驗(yàn)室廣泛使用，但前者檢測時(shí)間過長[4]，且無法定性、定量分析抗生素種類及含量[5]，而后者反應(yīng)靈敏度低[6]，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性也較差[7]，因此二者均難以在市場推廣。酸量法與顯色頭孢菌素法原理相似，均利用顏色的變化對(duì)β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢測分析，但酸量法無法區(qū)分內(nèi)源性和外源性的β-內(nèi)酰胺酶且不能用酶動(dòng)力學(xué)分析[8]，而顯色頭孢菌素法則由于假陽性概率較大[9]，同樣無法滿足市場需求。高效液相色譜法是目前被廣泛應(yīng)用的一種理化檢測方法，該方法靈敏度較高、檢測時(shí)間短、效率高且自動(dòng)化程度高[10]，但檢測成本也高，樣品前處理較煩瑣[11]，檢測程序復(fù)雜、費(fèi)用較高[12]，一般在大型實(shí)驗(yàn)室使用，更適合于精確測定。

本研究根據(jù)β-內(nèi)酰胺酶的性質(zhì)以及其分解產(chǎn)物（青霉素噻唑酸）的性質(zhì)作為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行研究，設(shè)計(jì)出一種新的檢測方法——硫酸銅-紫外分光光度計(jì)法。該方法操作簡單，檢測成本極低，有效降低了β-內(nèi)酰胺酶的最低檢出限，滿足市場檢測需求，為β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法開發(fā)提供了新的解決思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

市售鮮牛奶（新希望乳業(yè)有限公司），牛奶β-內(nèi) 酰胺酶快速檢測試紙條（深圳市易瑞生物科技有限公司），青霉素鉀標(biāo)準(zhǔn)品（合肥博美生物科技有限公司），β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品（上海阿拉丁生化科技有限公司），硫酸銅（南京化學(xué)試劑一廠），三氯乙酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甲基紅指示劑，氫氧化鈉，頭孢硝噻吩（長沙俄里翁生物科技有限公司），二甲基亞砜（麗媛棠科教儀器商城）

1.1.2 儀器

電熱恒溫水浴鍋（HW-YS，浙江舟山市定海區(qū)海源儀器廠）；自動(dòng)純水蒸餾器（SZ-93，上海亞榮生化儀器廠）；電子天平（BP221S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；立體式冰箱（BCD-205F/T，青島海爾電器有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)（TL-5.0，上海市離心機(jī)械研究所）；精密pH計(jì)（PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司-雷磁儀器）；測色色差計(jì)（WSC-S，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司）；超聲波清洗儀（JPS-100AL，上海煜南儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

按質(zhì)量比無抗奶粉∶蒸餾水=1∶10配制含青霉素鉀質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1，β-內(nèi)酰胺酶濃度 60 U·mL-1的樣品牛奶溶液及空白（不含β-內(nèi)酰胺酶）牛奶溶液，在最適酶促反應(yīng)溫度32.5 ℃水浴 50 min[13]；取空白牛奶（不含β-內(nèi)酰胺酶）5 mL，加入5 mL的三氯乙酸（TCA），用旋渦混合器充分振蕩，使其混合均勻，然后放入多用途臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1[14]，離心15 min，離心后取上清液10 mL放入燒杯，添上標(biāo)簽樣品1；取含β-內(nèi)酰胺酶及青霉素鉀的樣品牛奶溶液5 mL，加入5 mL的TCA，用旋渦混合器充分振蕩，使其混合均勻，然后放入多用途臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1，離心15 min，離心后取上清液10 mL放入燒杯，添上標(biāo)簽樣品2；在樣品1和樣品2中分別加入0.2 mol·L-1的硫酸銅溶液3 mL作為反應(yīng)劑和顯色劑[15]，測定溶液OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 各個(gè)影響因素的優(yōu)化

2.1.1 樣品最大吸光度的測定

在最適酶促反應(yīng)條件下，分別測定溶液在波長200～600 nm的OD值。如圖1所示，在200～263 nm階段，OD值呈上升趨勢，隨后下降直至平穩(wěn)，溶液在263 nm處有最大吸收峰。

圖1 樣品最大吸收波長的測定圖

2.1.2 底物青霉素鉀與硫酸銅用量及樣液添加量優(yōu)化

由圖2可知，當(dāng)酶濃度達(dá)到2 mg·mL-1時(shí)其峰值與5 mg·mL-1基本相同，由于5 mg·mL-1青霉素鉀濃度是過量的，且青霉素鉀濃度過高時(shí)會(huì)自身分解，所以5 mg·mL-1以上不再試驗(yàn)。出于節(jié)約材料、高效實(shí)驗(yàn)的目的選擇底物青霉素鉀用量為2 mg·mL-1。

圖2 不同青霉素鉀用量的樣品檢測光譜圖

由圖3可知，0.2 mol·L-1的硫酸銅試劑添加量為 0.150 mL時(shí)其光譜的峰值最大，但0.100 mL和0.150 mL的硫酸銅試劑添加量的光譜圖基本相同，出于節(jié)約材料以及硫酸銅添加量不宜過多方面考慮，0.2 mol·L-1的硫酸銅試劑最適添加量為0.100 mL。

圖3 不同硫酸銅添加量的樣品光譜圖

由圖4可知，樣液添加量為2.7 mL時(shí)，該樣液的光譜峰值最大，所以樣液的最佳添加量為2.7 mL。

圖4 不同樣液添加量的樣品光譜圖

綜上所述，可知最佳條件為底物濃度2 mg·mL-1， 0.2 mol·L-1的硫酸銅試劑添加量為0.100 mL，樣液添加量為2.7 mL，反應(yīng)時(shí)間為18 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢出限的確定

紫外-可見分光光度計(jì)分別測定β-內(nèi)酰胺酶的濃 度 為5 U·mL-1、15 U·mL-1、30 U·mL-1、60 U·mL-1和100 U·mL-1的5組樣品在263 nm處的吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。β-內(nèi)酰胺酶與其在263 nm處的OD值呈比較好的線性關(guān)系，由此可以初步確定其最低檢出限為5 U·mL-1。

圖5 不同酶濃度樣品峰值的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3 結(jié)論

運(yùn)用紫外-可見分光光度計(jì)掃描得到絡(luò)合物在263 nm 處有最大吸收峰，底物濃度2 mg·mL-1，0.2 mol·L-1的硫酸銅試劑添加量為0.100 mL，樣液添加量為2.7 mL，反應(yīng)時(shí)間為18 min的最優(yōu)條件下建立β-內(nèi)酰胺酶檢測線性關(guān)系，R2為0.976 1，相關(guān)性良好，最低檢出限為5 U·mL-1。該硫酸銅-紫外分光光度計(jì)法是一種檢測成本低、易于操作、檢出限較低的檢測β-內(nèi)酰胺酶方法，該方法可基本滿足目前市場需求。