陸 歡，徐 寧，劉建輝，王小艷，夏義良

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學院 食用菌研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部應用真菌資源與利用重點開放實驗室/國家食用菌工程技術(shù)研究中心/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海 201403；2.湖南省食用菌研究所，湖南 長沙 410013；3.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210023）

田頭菇（Agrocybe praecox），又名春生田頭菇，通常生長于林地或草地，在洞庭湖流域常生長在蘆葦叢中或蘆葦濕地附近，當?shù)厝朔Q其為蘆葦菇，是一種豐富營養(yǎng)、口感獨特、風味濃郁、高蛋白質(zhì)低脂肪、高鉀低鈉的食用菌[1-3]，具有很高的食用藥用和商業(yè)價值。目前報道已知的田頭菇屬有近百種，我國記錄的有十多種[4-7]，大部分已成功馴化并實現(xiàn)了人工栽培。

頂空固相微萃取是20世紀90年代新發(fā)展起來的一種用于食品風味物質(zhì)分析檢測的技術(shù)，通過頂空固相微萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（head space solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GCMS）技術(shù)對揮發(fā)性成分進行測定和分析[8-9]，可以為揮發(fā)性成分的鑒定提供依據(jù)。該方法具有更高的準確度和更好的重復性，在揮發(fā)性成分分析方面已得到廣泛利用。殷朝敏[10]等利用此方法測定出平菇、香菇、雙孢蘑菇金針菇和杏鮑菇鮮品中關(guān)鍵揮發(fā)性風味成分；李文[11]等利用該方法綜合評價了柱狀田頭菇子實體揮發(fā)性成分；李曄[12]通過該方法分析了灰樹花中的揮發(fā)性成分以及在草菇、竹蓀、榆黃蘑、糙皮側(cè)耳、秀珍菇、紅平菇、美味牛肝菌、羊肚菌、猴頭菇、雙孢蘑菇等方面的應用[13-20]。

作者采用頂空固相微萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過對冷凍干燥-超微粉碎制得春生田頭菇干燥樣品進行揮發(fā)性成分測定，探究春生田頭菇子實體菌蓋和菌柄中的揮發(fā)性成分物質(zhì)。通過分析比較春生田頭菇中主要揮發(fā)性物質(zhì)，為春生田頭菇后續(xù)綜合開發(fā)利用提供新的方向，也為富集有效活性成分的春生田頭菇新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

作者使用的材料采集于洞庭湖大通湖區(qū)蘆葦濕地，野生菌株通過組織分離、馴化得到純菌株，再在岳陽市湘陰縣人工栽培獲得的田頭菇子實體。馴化菌株保存于湖南省食用菌研究所，菌株ITS的GenBanK登錄號為MN475785。取田頭菇的菌蓋和菌柄進行試驗。

GC/MS Solution色譜工作站和Thermo NIST MS Search2.3質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫、Thermo 1300氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Thermo公司產(chǎn)品；固相微萃取器手柄、30/50μm DVB/PDMS固相微萃取纖維頭：Supelco公司產(chǎn)品；頂空萃取瓶：上海安譜實驗科技股份有限公司產(chǎn)品；FD-2C真空冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)品；XDW-15B低溫超微粉碎機：濟南達微機械有限公司產(chǎn)品；MS-TS分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱：蘇州江東精密儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 樣品制備

先將田頭菇鮮品置于烘干機中低溫烘干，再將菌蓋和菌柄分開，分別經(jīng)超微粉碎機粉碎，置于-80℃冰箱中24 h后取出，放入真空冷凍干燥機中48 h后制得干燥樣品，再將菌蓋和菌柄樣品分別過100目篩，置于避光陰涼處密封保存。精密稱取菌蓋和菌柄樣品各0.1 g置于10 mL頂空萃取瓶中，隔墊密封待測。

1.3 萃取方法

稱取適量樣品，于頂空瓶中，加入飽和氯化鈉，壓蓋，置于80℃水浴中平衡20 min，再將固相微萃取針扎進頂空中，繼續(xù)放入80℃水浴中20 min，待上機解析5 min。

1.4 GC-MS條件

TG-5色譜柱（30.0 m×0.25μm，0.25 mm，賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品）；柱升溫程序：初始溫度60℃，保持5 min，以3.5℃/min升至100℃，保持5 min，再以8℃/min升至200℃，保持5 min；再以15℃/min升至280℃，保持15 min；進樣口溫度250℃；進樣量1μL，載氣流量1.2 mL/min；載氣為高純He（含有量99.999%）；進樣方式：不分流。

電子轟擊離子源（EI源）；離子源溫度150℃，接口溫度280℃；電子能量70 eV；燈絲發(fā)射電流200μA；質(zhì)荷比掃描范圍：35～350；質(zhì)譜圖利用NIST譜庫進行檢索比對和CAS編碼查詢，并結(jié)合有關(guān)文獻進行鑒定。

2 結(jié)果與分析

春生田頭菇子實體菌蓋和菌柄的揮發(fā)性成分GC-MS分析經(jīng)過NIST.17質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，從各離子的相對峰度等方面進行比對，選取相似度80以上的化合物，用面積歸一法對各部位色譜峰占總峰面積百分比進行計算，共鑒定出79個化合物。其中，菌蓋和菌柄分別鑒定出48種和47種揮發(fā)性物質(zhì)，分別占總揮發(fā)性物質(zhì)的60.76%和59.45%。

2.1 春生田頭菇子實體菌蓋中揮發(fā)性化合物及分析

春生田頭菇子實體菌蓋總離子流圖譜見圖1，所檢測出的48種揮發(fā)性物質(zhì)中（見表1），含有烷類11種，酮類8種，酯類6種，醛類5種，苯胺類3種，酸類2種，醇類2種，酚類2種，酰胺類2種，烯烴類1種，呋喃類1種，吡嗪類1種，胺類1種，其他類3種。烷類化合物為整個揮發(fā)性化合物主要成分，占總比例22.92%，其次為酮類、酯類化合物，分別占16.67%、12.50%；醛類、苯胺類化合物分別占8.33%、6.25%。酸類、醇類、酚類和酰胺類化合物均占4.17%。烷類化合物主要為十甲基環(huán)五硅氧烷、十二甲基環(huán)六硅氧烷和八甲基環(huán)四硅氧烷，相對質(zhì)量分數(shù)分別為0.058%、0.051%、0.027%；酮類化合物主要為2-甲基-3-庚酮和1-丁基-2，5-吡咯烷二酮，相對質(zhì)量分數(shù)分別為1.000%、0.027%；酯類化合物主要為醋酸-2-乙基己酯和丙位壬內(nèi)酯，相對質(zhì)量分數(shù)分別為0.039%、0.036%；醛類化合物主要為苯甲醛，相對質(zhì)量分數(shù)為0.022%；苯胺類化合物主要為4'-甲氧基甲酰苯胺，相對質(zhì)量分數(shù)為0.041%；酸類化合物主要為苯乙酸，相對質(zhì)量分數(shù)為0.029%；醇類化合物主要為2-乙基己醇，相對質(zhì)量分數(shù)為0.022%；酚類化合物主要為3-烯丙基-6-甲氧基酚，相對質(zhì)量分數(shù)為0.073%；酰胺類化合物主要為N-異戊基乙酰胺，相對質(zhì)量分數(shù)為0.017%，烯烴類化合物為1，3-聯(lián)二苯-1-（三甲基硅氧基）-庚烯，相對質(zhì)量分數(shù)分別為0.005%；呋喃類化合物主要為2-戊基呋喃，相對質(zhì)量分數(shù)為0.014%；吡嗪類化合物為2-乙基-3，5-二甲基吡嗪，相對質(zhì)量分數(shù)為0.015%；胺類化合物主要為（4-乙氧苯基）乙胺，相對質(zhì)量分數(shù)為0.039%；其他化合物為二甲胺嗪、4-乙基-1-甲基-2-吡唑啉和3，5-二羥基戊苯，相對質(zhì)量分數(shù)分別為0.007%、0.010%、0.007%。

圖1 春生田頭菇子實體菌蓋總離子流圖譜Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile compositions of the pileus of Agrocybe praecox

2.2 春生田頭菇子實體菌柄中揮發(fā)性化合物及分析

春生田頭菇子實體菌柄總離子流圖譜見圖2，所檢測出的47種揮發(fā)性物質(zhì)中（見表2），含有烷類7種，酯類7種，酸類6種，酮類4種，酰胺類4種，醛類3種，腈類2種，吡唑啉類2種，胺類2種，烯烴類1種，酚類1種，嘧啶類1種，蒽醌類1種，吲哚類1種，呋喃類1種，其他類4種。烷類和酯類化合物為整個揮發(fā)性化合物主要成分，均占總比例14.89%，其次為酸類、酮類、酰胺類化合物，分別占12.77%、8.51%、8.51%；醛類化合物占6.38%。烯烴類、腈類、吡唑啉類和胺類化合物均占4.26%。烷類化合物主要為硅二醇乙烷、十二甲基環(huán)六硅氧烷和十甲基環(huán)五硅氧烷，相對質(zhì)量分數(shù)分別為1.32%、0.76%、0.57%；酯類化合物主要為亞油酸乙酯和棕櫚酸乙酯，相對質(zhì)量分數(shù)分別為0.71%、0.17%；酸類化合物主要為乙酸、苯乙酸和棕櫚酸，相對質(zhì)量分數(shù)分別為0.87%、0.18%、0.13%；酮類化合物主要為2-甲基-3-庚酮和3，3-二甲基-1-吡咯烷-1-丁酮，相對質(zhì)量分數(shù)分別為1.00%、0.15%；酰胺類化合物主要為N-芐基-N-乙基-對異丙基苯甲酰胺和N-（3-甲基丁基）乙酰胺，相對質(zhì)量分數(shù)分別為0.55%、0.13%；醛類化合物主要為苯甲醛，相對質(zhì)量分數(shù)為0.10%；腈類化合物主要為5-氨基-7-（4-甲氧基-苯基）-2苯基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-6-腈，相對質(zhì)量分數(shù)為0.06%；吡唑啉類化合物主要為4-乙基-1-甲基-2-吡唑啉，相對質(zhì)量分數(shù)為0.06%；胺類化合物主要為（4-乙氧苯基）乙胺，相對質(zhì)量分數(shù)為0.05%；烯烴類化合物主要為4-叔丁氧基苯乙烯，相對質(zhì)量分數(shù)為0.09%；酚類化合物為3-烯丙基-6-甲氧基酚，相對質(zhì)量分數(shù)為0.20%；嘧啶類化合物為4-羥基嘧啶，相對質(zhì)量分數(shù)為0.07%；蒽醌類化合物為1，1-亞氨基二蒽醌，相對質(zhì)量分數(shù)為0.11%；吲哚類化合物為吲哚，相對質(zhì)量分數(shù)為0.06%；呋喃類化合物為2-戊基呋喃，相對質(zhì)量分數(shù)為0.04%。

表1 春生田頭菇菌蓋揮發(fā)性成分分析表Table 1 GC-MS analytical results of chemical composition of volatile compositions of pileus from Agrocybe praecox

續(xù)表1

圖2 春生田頭菇子實體菌菌柄總離子流圖譜Fig.2 Total ion current chromatogram of volatile compositions of the stipe of Agrocybe praecox

表2 春生田頭菇菌柄揮發(fā)性成分分析表Table 2 GC-MS analytical results of chemical composition of volatile compositions of stipe from Agrocybe praecox

續(xù)表2

續(xù)表2

2.3 春生田頭菇子實體菌蓋和菌柄中揮發(fā)性化合物測定比較

圖3 春生田頭菇子實體菌蓋揮發(fā)性化合物質(zhì)量分數(shù)Fig.3 Proportion of volatile components substances in the pileus of Agrocybe praecox

圖4 春生田頭菇子實體菌柄揮發(fā)性化合物質(zhì)量分數(shù)Fig.4 Proportion of volatile components substances in the stipe of Agrocybe praecox

春生田頭菇子實體菌蓋中檢測出的揮發(fā)性化合物質(zhì)量分數(shù)見圖3，春生田頭菇子實體菌柄中檢測出的揮發(fā)性化合物質(zhì)量分數(shù)見圖4。菌蓋和菌柄中兩者均含有六甲基環(huán)三硅氧烷，十甲基環(huán)五硅氧烷，十二甲基環(huán)六硅氧烷，2-甲基-3-庚酮，丙位壬內(nèi)酯，3-羥基扁桃酸乙酯，N-苯基-丙氨酸乙酯，苯甲醛，5-（1-哌啶）-糠醛，乙酸，苯乙酸，3-烯丙基-6-甲氧基酚，2-正戊基呋喃，（4-乙氧苯基）乙胺，4-乙基-1-甲基-2-吡唑啉和3，5-二羥基戊苯。

3 討論

目前食品中風味物質(zhì)的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、頂空收集法、同時蒸餾萃取法及固相微萃取法；而微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物一般含量較低，主要檢測方法有氣相色譜法、質(zhì)譜法、電子鼻法和高效液相色譜法等。由于提取時長、提取效率、檢測靈敏度、樣品數(shù)量和要求、重現(xiàn)性等問題，每種方法都有一定的缺陷性和限制性。固相微萃取技術(shù)是在固相萃取的基礎(chǔ)上，集采樣、萃取、濃縮、進樣一體化，操作簡單便捷，對環(huán)境污染小，符合全球綠色友好可持續(xù)發(fā)展理念，結(jié)合GC-MS技術(shù)被廣泛運用在各個方面。

食用菌中的揮發(fā)性物質(zhì)主要由八碳揮發(fā)性化合物、含硫化合物、醇類、酯類、酸類、醚類、酮類、醛類等化合物構(gòu)成，風味物質(zhì)主要由揮發(fā)性呈香物質(zhì)和非揮發(fā)性呈味物質(zhì)組成，各類化合物相互協(xié)調(diào)造就不同食用菌獨特的香味和風味[21]。其中烯烴類化合物和酯類化合物是構(gòu)成食用菌呈香的主要物質(zhì)，烷類化合物雖不是構(gòu)成食用菌呈香的主要物質(zhì)，但是主要的輔助物質(zhì)，醛類化合物具有特殊的香氣，酮類化合物伴有花香和果香風味，醇類化合物在一定程度中對食用菌風味有貢獻，大多數(shù)酚類化合物對食用菌的風味貢獻不大，但有助于提升整體風味，呋喃、吡嗪等化合物也都具有特殊的氣味。

殷朝敏[10]等對平菇、香菇、雙孢蘑菇金針菇和杏鮑菇鮮品中關(guān)鍵揮發(fā)性風味成分進行測定，發(fā)現(xiàn)平菇鮮品中主體揮發(fā)性香氣成分為1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇和3-辛酮；香菇鮮品中主體揮發(fā)性香氣成分為二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、1-辛烯-3-酮和甲硫醇；雙孢蘑菇和金針菇鮮品中主體揮發(fā)性香氣成分為1-辛烯-3-酮、3-辛酮和3-辛醇；而杏鮑菇鮮品中的主體揮發(fā)性香氣成分是1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇。李文[11]等對香菇中揮發(fā)性成分進行了研究，發(fā)現(xiàn)八碳化合物是構(gòu)成香菇香氣的主要物質(zhì)之一，主要以1-辛烯-3-醇為主。Cho[22]等對松茸菌蓋和菌柄的揮發(fā)性成分進行了比較研究，在菌蓋和菌柄中分別檢測出24種和21種揮發(fā)性成分，兩者的主要揮發(fā)性成分分別為肉桂酸甲酯和1-辛烯-3-醇。Malheiro[23]等通過固相微萃取聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對6種不同的野生食用菌揮發(fā)性成分進行了研究，結(jié)果表明八碳化合物是這6種食用菌的主要揮發(fā)性成分，其中3-辛醇、1-辛醇和3-辛酮含量較高。殷朝敏[15]等對14種側(cè)耳屬食用菌干品揮發(fā)性香味成分進行了分析，發(fā)現(xiàn)不同食用菌干品揮發(fā)性成分的種類和含量差異很大，主要為1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇和正辛醛，此外，側(cè)耳屬食用菌中還存在一些重要的修飾性香氣成分，如1-己醇、正己醛、2-丁基-2-辛烯醛、正辛醇、2-辛烯-1-醇、1-辛烯-3-酮和3-辛酮等，這些眾多組分相互作用形成了側(cè)耳屬食用菌干品的獨特香氣。孫燕[14]對不同品種竹蓀的揮發(fā)性成分及風味特性進行分析，發(fā)現(xiàn)不同溫度竹蓀品種所含揮發(fā)性成分不同，氣味表現(xiàn)物質(zhì)不同，其風味特征不同。溫泉[24]等運用主成分分析研究不同培養(yǎng)料與草菇子實體揮發(fā)性成分的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)異戊醛、已醛、1-辛烯-3-醇、甲硫醇、2-戊基呋喃、二甲基硫醚為影響草菇子實體香氣的特征性風味成分。李曄[12]等對灰樹花中揮發(fā)性成分進行分析，發(fā)現(xiàn)酯類、烷烴類、醛類和萜烯類化合物為主要成分。李翔[17]等對人工和野生羊肚菌中的揮發(fā)性成分進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)共有揮發(fā)性成分為3-甲基丁醛、戊醇、正己醛、3-甲基丁酸、甲酸己酯、庚醛、γ-戊內(nèi)酯、1-辛烯-3-醇、正庚酸、反-2-辛烯醛，其中野生羊肚菌關(guān)鍵風味物質(zhì)主要為3甲基丁醛、正己醛、庚醛、1-辛烯-3-醇、正庚酸、反-2-辛烯醛、壬醛；人工栽培羊肚菌關(guān)鍵風味物質(zhì)主要為3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、正己醛、1-辛烯-3-醇。樂之歆[25]等對猴頭菇的揮發(fā)性成分進行了研究，共鑒定出干猴頭菇中的揮發(fā)性成分71種，其中醛類化合物的種類最多。陳智毅[26]對白金針菇的揮發(fā)性成分進行了分析，發(fā)現(xiàn)干金針菇的香氣成分主要來源于其脂肪。馮濤[27]對松露揮發(fā)性風味成分進行了對比分析，發(fā)現(xiàn)1-辛烯-3-醇、對甲酚甲醚、3-甲基丁醛、二烯丙基二硫醚和二甲基硫醚在新鮮松露中的含量較高；對甲酚甲醚、己酸、右旋檸檬烯、二甲基砜、烯丙基甲基三硫醚在干制松露中含量較高。

采用頂空固相微萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對春生田頭菇子實體菌蓋和菌柄的揮發(fā)性成分進行測定和分析，完善了春生田頭菇揮發(fā)性成分的化學信息。本次研究共鑒定出79個化合物，菌蓋鑒定出48種揮發(fā)性物質(zhì)，分別占總揮發(fā)性物質(zhì)60.76%；菌柄中共鑒定出47種揮發(fā)性物質(zhì)，占總揮發(fā)性物質(zhì)的59.45%。烷類化合物相對含量最高，其次為酮類化合物、酯類化合物、酸類化合物和醛類化合物，此外，還分析鑒定出春生田頭菇還含有醇類、烯烴類，酰胺類，苯胺類、苯類，酚類，腈類、胺類，呋喃類，吡嗪類，嘧啶類、蒽醌類和其他類化合物。其中，烷類化合物主要以十二甲基環(huán)六硅氧烷和十甲基環(huán)五硅氧烷為主；酯類化合物主要為丙位壬內(nèi)酯，濃時有椰子香味，稀釋時有杏仁味或桃花香，以及亞油酸乙酯；酸類化合物主要為乙酸和苯乙酸，苯乙酸在低濃度時具有甜蜂蜜味；醇類化合物主要為2-乙基己醇，具有芳香氣味；酮類化合物主要為2-甲基-3-庚酮，具有類似香檸檬和香葉的香氣；2-甲基吡嗪具有焙烤香；糠醛具有焦糖香；2-戊基呋喃具有烘烤香味；吲哚具有花香氣味；未檢測出蘑菇特征揮發(fā)性物質(zhì)1-辛烯-3-醇，原因可能是此特征物質(zhì)在春生田頭菇中含量極低，未達到檢測限值。

4 結(jié)語

對春生田頭菇子實體揮發(fā)性成分進行了分析鑒定研究，試驗鑒定得到79個揮發(fā)性化合物，其中碳氫類化合物含量最多，明確了春生田頭菇所含的特征性風味物質(zhì)種類，其中起主要作用的揮發(fā)性物質(zhì)為烷類、酯類、酮類和酸類化合物。對于相對含量較高的化合物之間的比例、閾值等是否是形成春生田頭菇香味和風味物質(zhì)的關(guān)鍵，還需進一步深入研究。本研究的結(jié)果可用于建立和完善食用菌香氣數(shù)據(jù)庫，為春生田頭菇的綜合利用提供參考依據(jù)。