王 鑫，范群艷，連建梅，鄒鋒揚，王雅馨，李建貴，陳茂深*，鐘 芳，李 玥

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.廈門市燕之屋絲濃食品有限公司，福建 廈門 361101）

燕窩為雨燕科金絲燕屬鳥類分泌的唾液與其羽絨混合凝結而成的物質，營養(yǎng)價值豐富，具有多種生物活性[1]。燕窩主要營養(yǎng)成分為蛋白質、碳水化合物、唾液酸，同時含有微量的脂質和無機元素。唾液酸是燕窩的核心物質，是腦神經節(jié)苷脂的有益成分。燕窩的生物活性和其消化特性有關。研究發(fā)現(xiàn)，燕窩經過消化后抗氧化活性顯著提高，能夠保護細胞免受氧化損傷[2]。Ghassem等發(fā)現(xiàn)燕窩模擬消化產物中的多肽組分具有較高的抗氧化能力，分離純化發(fā)現(xiàn)其中PFHPY和LLGDP兩種肽能夠保護HepG2細胞免受H2O2誘導的氧化損傷[3]。Wong等研究發(fā)現(xiàn)，消化后的燕窩具有更強的美白活性和成骨活性，能夠抑制酪氨酸酶的活性，減少小鼠黑色素瘤細胞中的黑色素分泌量，同時促進成骨細胞增殖，增加小鼠的骨強度和真皮厚度[4]。

唾液酸對酪氨酸酶活性具有劑量依賴性的抑制作用，對皮膚有美白功效[5]。多肽和唾液酸是消化產物中的主要功能活性成分。目前關于燕窩的研究主要集中在原料的品質偽劣鑒定和生物活性評價，關于燕窩消化特性的研究沒有詳盡的報道。作者采用Standard法模擬燉煮燕窩體外胃腸的消化，對燕窩蛋白和碳水化合物的含量和組成進行了全面的測定分析，為進一步開發(fā)高胃腸消化特性的燕窩新產品提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

燕窩：市售；胃蛋白酶、胰蛋白酶：Sigma公司產品；鼠李糖，半乳糖，甘露糖，鄰苯二胺鹽酸鹽，國藥化學試劑有限公司產品；氨基葡萄糖、D-半乳糖胺鹽酸鹽、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸：上海創(chuàng)賽有限公司產品；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

傅立葉紅外光譜儀：美國賽默飛世爾科技公司；PowerPacTMBasic Power Supply基礎電泳儀電源：伯樂生命醫(yī)學產品上海有限公司產品；搖擺式高速萬能粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司產品；DL-5-A低速臺式大容量離心機、KDN-08C數(shù)顯溫控消化爐：上海新嘉電子有限公司產品；UV-2802紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司產品；KDN-103F凱氏定氮儀：上海纖檢儀器有限公司產品；高效液相色譜儀Waters 2695（Waters 2475熒 光 檢 測 器、Waters 2998紫 外 檢 測 器）：美 國Waters公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理將燕窩研磨成粉末，用60目篩子過濾，收集過濾粉末，裝袋，-20℃貯藏。

1.3.2 模擬體外消化過程利用Standard法模擬胃腸消化：稱量0.8 g燕窩粉末，溶于10 mL水中，沸水水浴1 h，冷卻至室溫[6]。將燕窩溶液與10 mL的模擬胃液混合于50 mL離心管內，37℃恒溫振蕩水浴，HCl調節(jié)pH使其始終保持在2.0±0.2，在100 r/min的速度下模擬胃階段消化，每個時間點單獨做一個消化管，每隔30 min依次用堿液調節(jié)pH至8.0滅酶，以4 500 g離心分離上清液，-20℃貯藏，分析0，30，60，90，120 min的消化情況。胃消化結束后，進入小腸消化階段。加入16 mL模擬腸液，NaOH調節(jié)pH使其始終保持在7.0±0.2，補水使體系達到40 mL。繼續(xù)在100 r/min的攪拌速度、37℃的溫度下進行腸階段體外消化，每個時間點單獨做一個消化管，每隔30 min將一個離心管進行沸水浴滅酶，4 500 g離心分離，上清液-20℃貯藏，離心沉淀物進行凍干儲藏，分析150，180，210，240 min的消化情況。

1.3.3 基本成分測定蛋白質含量測定：參照國標GB 5009.5—2016凱氏定氮法，蛋白質折算系數(shù)6.25，分別測定燕窩原料蛋白質含量和消化上清液中的水溶性蛋白質含量；總糖含量測定：參照國標GB/T15672—2009苯酚硫酸法，葡萄糖為標準品，分別測定燕窩原料總糖含量和消化上清液中的總糖含量。

1.3.4 水解度測定參考楊文博等人的方法，采用甲醛滴定法[7]。水溶性蛋白質水解度（%）=ρ×V/m （1）式中：ρ為消化上清液中游離氨基酸態(tài)氮質量濃度，g/mL；V為消化液體積，mL；m為消化上清液中的燕窩蛋白總氮質量，g。

1.3.5 多肽測定方法參考GB31645—2018膠原蛋白肽的測定。色譜條件：TSK gel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；柱溫：30℃；流動相：乙腈∶水∶三氟乙酸，體積比為40∶60∶0.05。檢測器：紫外檢測器220 nm；流量：0.5 mL/min；進樣體積10μL。

1.3.6 蛋白質二級結構測定方法采用Nicolet iS50 FTIR型傅立葉變換紅外光譜儀測定。掃描次數(shù)32次，入射角45°，掃描波數(shù)范圍4 000~600 cm-1，分辨率為4 cm-1。測試樣品粉末衰減全反射紅外光譜（ATR-FTIR），每個樣品重復采集3次。

1.3.7 唾液酸測定方法參考袁玲和張啟偉等人的方法，采用領苯二胺（OPD）柱前衍生法測定燕窩原料和消化上清液的唾液酸含量[8-9]。

取50 mg原料溶解在40 mL的體積分數(shù)1%磷酸溶液中，沸水浴水解20 min，冷卻后加入20 mg/mL的鄰苯二氨鹽酸鹽溶液1 mL，80℃避光水浴40 min，水系濾膜過濾，準備進樣。

游離態(tài)唾液酸測定，取1 mL液體樣品，加入20 mg/mL的鄰苯二氨鹽酸鹽溶液1 mL，50℃避光水浴2.5 h，改變溫度至4℃繼續(xù)衍生48 h，水系濾膜過濾，準備進樣。

聚糖態(tài)唾液酸測定，取1 mL液體樣品，按 體積比1∶1加入Sevage試劑（V（三氯甲烷）∶V（正丁醇）=4∶1）反復萃取除去蛋白質，加入20 mg/mL的鄰苯二氨鹽酸鹽溶液1 mL，80℃避光水浴40 min，水系濾膜過濾，準備進樣。

蛋白態(tài)唾液酸測定，取1 mL消化上清液酸解，測定清液中唾液酸總量。

未溶解唾液酸測測定，取50 mg燕窩消化后的離心沉淀物，溶解在40 mL的1%體積分數(shù)磷酸溶液中，沸水浴水解20 min，80℃避光水浴40 min，水系濾膜過濾，準備進樣。

1.3.8 單糖測定方法參考戴軍等人方法，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色譜法測定燕窩原料和消化上清液的單糖組成[10]。

1.3.9 蛋白質相對分子質量測定方法取消化液與上樣緩沖液等體積均勻混合，100℃加熱3 min變性處理，8 000 r/min離心3 min。還原電泳條件：10 g/dL分離膠，5 g/dL濃縮膠，上樣量10μL。對燕窩糖蛋白中的蛋白和糖鏈分別進行單獨染色，考馬斯亮藍R-250進行蛋白染色，高碘酸-席夫堿法進行糖染色[11]。Image Lab圖像軟件用于SDS-PAGE凝膠分析。

1.3.1 0數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析所有數(shù)據(jù)均進行3次重復測定，采用SPSS19.0和Origin 8.0進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2.1 燕窩主要組成成分

蛋白質和碳水化合物是人類生命活動的必需營養(yǎng)物質，而唾液酸是腦神經節(jié)苷脂的重要組分，直接參與神經系統(tǒng)改善和大腦發(fā)育。燕窩蛋白主要為唾液酸糖蛋白，其主要成分如表1所示。

表1 主要化學成分Table 1 Main chemical composition of samples

蛋白質質量分數(shù)為67.86%，唾液酸質量分數(shù)13.25%，其余單糖的總質量分數(shù)16.45%。燕窩的化學組成與其品種、產地關系緊密，Hamzah等對馬來西亞、印度尼西亞等不同產地燕窩的蛋白質和唾液酸分析，蛋白質質量分數(shù)在59.8%~73.8%，唾液酸質量分數(shù)10%左右，與研究結果一致[1]。研究發(fā)現(xiàn)，日常飲食中的高蛋白質食物如黃豆，其蛋白質質量分數(shù)僅為36.3%，遠低于燕窩[12]。燕窩是唾液酸質量分數(shù)最高的食物，而奶粉中的唾液酸質量分數(shù)僅為0.05%[13]。

對燕窩中單糖組成進行測定，結果如表2所示?？梢钥闯鲅喔C總糖主要由6種單糖組成，其中，半乳糖質量分數(shù)最高，達到6.59%，其次為N-乙酰半乳糖胺4.15%和甘露糖3.22%。研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)如越南、印度尼西亞和泰國的燕窩單糖組成中，N-乙酰葡萄糖胺（4.76%~5.64%）、N-乙酰半乳糖胺（3.79%~4.54%）和半乳糖（4.58%~5.43%）質量分數(shù)較高，在其他定量中，發(fā)現(xiàn)鼠李糖（0.02%）和木糖（0.21%）。燕窩單糖質量分數(shù)的差異受產地和加工過程影響[1]。

表2 燕窩原料單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of raw materials of bird’s nest

2.2 消化過程中溶解燕窩蛋白質、總糖、唾液酸溶解度變化

燕窩的生物活性和其消化特性有關，對燕窩消化過程中蛋白質、總糖、唾液酸的溶解性進行研究，結果如圖1所示。

圖1 消化過程中燕窩蛋白質、總糖、唾液酸溶解度變化Fig.1 Changes of solubility of protein,total sugar and sialic acid during digestion of bird’s nest

消化初始階段，燕窩蛋白質溶解度為13.85%，胃階段消化2 h后增加到28.75%，腸階段繼續(xù)消化2 h后增加到47.23%?？偺侨芙舛葹?.49%，經過胃消化2 h后增加到24.92%，腸消化2 h后增加到39.02%。整個消化過程中蛋白質和總糖的溶解度呈顯著線性正相關（r=0.984，P＜0.01），溶解速率較為一致，糖與蛋白質結合緊密，共同溶解到消化上清液中。唾液酸溶解度的變化情況與蛋白質、總糖不同，燉煮燕窩消化開始時刻的唾液酸溶解度為18.69%，胃消化前30 min內溶解度快速增加，達到31.45%，30 min后溶解速率降低，溶解度緩慢增加，胃消化2 h后僅為35.34%。腸消化過程中唾液酸溶解度的變化與胃階段類似，前30 min內唾液酸溶解度再次快速增加，達到42.85%，30 min后溶解度趨于平緩，腸消化2 h后為44.24%。

2.3 消化過程中蛋白質水解度和多肽相對分布

水解度可以表征蛋白質肽鍵的斷裂程度，多肽相對分布表征蛋白質水解產物的具體情況。燕窩蛋白質的水解度如圖2（a）所示。

胃腸消化后，燕窩總蛋白質的水解度分別為5.47%、12.12%。消化上清液中水溶性蛋白質的水解度分別為13.48%、18.13%。胃消化階段，水溶性蛋白質的水解主要發(fā)生在消化前30 min。腸消化階段，水溶性蛋白和總蛋白質的水解度呈現(xiàn)顯著正相關，胰蛋白酶有助于提高燕窩蛋白的溶解度。郭立春等用胰蛋白酶水解膠原的總蛋白質水解度為20%，和膠原蛋白相比，燕窩水解度較低[14]。

圖2 燕窩消化過程中水解度和多肽相對質量分數(shù)變化Fig.2 Changes of hydrolysis degree and molecular weight of polypeptide during digestion of bird’s nest

多肽相對分布如圖2（b）所示，消化開始時刻，燉煮燕窩溶液中主要為蛋白質。胃消化前30 min，燕窩中的水溶性蛋白質被快速水解成低聚肽（＜1 000）和中等相對分子質量肽（1 000~5 000），而大相對分子質量肽段（5 000~10 000）和蛋白質（＞10 000）相對質量分數(shù)較少。30 min后多肽相對分布趨于穩(wěn)定，低聚肽和蛋白質質量分數(shù)略有增加，中等相對分子質量和大相對分子質量肽段相對質量分數(shù)減少。胃消化2 h后，低聚肽、中等相對分子質量肽段和大相對分子質量肽段的相對質量分數(shù)分別為36.6%、45%、5.96%，而蛋白質相對質量分數(shù)為12.47%。燕窩蛋白為酸性蛋白質，其中相對分子質量1.28×105和1.06×105蛋白質為相對質量分數(shù)最高的蛋白質，這兩種蛋白的等電點pH≤3，進入胰階段，消化液pH由酸性變成中性，蛋白質更易溶解從而被胰蛋白酶水解。腸消化前30 min，在胰蛋白酶的作用下，多肽相對分布發(fā)生顯著變化。低聚肽和蛋白質相對質量分數(shù)分別增加15.28%、23.06%，中等相對分子質量肽減少39.3%，大相對分子質量肽相對質量分數(shù)沒有顯著變化，30 min后多肽相對分布趨于穩(wěn)定。腸消化2 h后，低聚肽、中等相對分子質量肽段和大相對分子質量肽段相對質量分數(shù)分別為51.88%、5.65%、6.94%，蛋白質相對質量分數(shù)為35.53%。

2.4 消化過程中單糖質量分數(shù)變化

Yagi等研究發(fā)現(xiàn)燕窩中的糖與蛋白質共價結合，同時含有O連接型和N連接型糖蛋白[15]。N型和O型糖蛋白的糖鏈并不是單一的直鏈糖，存在多個分支。N-乙酰半乳糖胺是O型糖蛋白中特有的單糖，可以表征O型糖蛋白的溶解度。N型糖蛋白中復雜型聚糖結構的唾液酸含量最高，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖和甘露糖是N型聚糖中最主要的糖，其糖鏈的結構如圖3所示。燕窩的單糖組成有助于判斷消化過程中溶解的燕窩糖蛋白的類型。燕窩消化后的單糖包括甘露糖、鼠李糖、N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和氨基葡萄糖。不同單糖之間的溶解度存在差異，結果見表3。

圖3 燕窩唾液酸聚糖結構Fig.3 Structure of sialic acid glycan from bird’s nest

消化開始時刻N-乙酰半乳糖胺的溶解度僅為3.92%，經過胃腸消化后溶解度為24.73%，O型糖苷鍵在中性和堿性條件下一般較為穩(wěn)定，在酸性條件更易被水解。該糖溶解度低說明O型糖蛋白不易被消化。胃腸消化后，N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖和甘露糖的溶解度達到49.65%、46.61%、16.36%。N型糖蛋白溶解度更高，可能是因為N型糖苷不如O型糖苷穩(wěn)定性好，它在水中容易水解，推測溶出的N型糖蛋白以復雜型和雜合型為主。對燕窩消化離心上清液中以聚糖鏈形式存在的4種單糖相對含量進行相關性分析，結果如表4所示。糖鏈中的單糖均呈顯著正相關，說明燕窩中的糖鏈結構完整，胃腸消化過程中燕窩的糖鏈未被水解。

2.5 消化過程中唾液酸存在形式和質量分數(shù)變化

唾液酸是燕窩中最具有價值的物質，在哺乳動物大腦發(fā)育的過程中不可或缺。燕窩中的唾液酸主要結合在糖蛋白的糖鏈末端，少量以游離和聚糖的形式存在。外源性含唾液酸的食物在哺乳動物的代謝研究表明，游離唾液酸雖然有利于人體吸收，但是單體唾液酸在體內的滯留時間太短，無法充分吸收利用。與蛋白質結合的唾液酸可以延長其在體內的滯留時間，但是難以被轉化吸收。和低聚糖或者聚糖肽結合的唾液酸在體內的滯留時間合適，同時也有利于吸收利用[16]。燕窩唾液酸在消化過程中的存在形式和質量分數(shù)變如圖4所示。

表3 燕窩消化過程中單糖溶解度Table 3 Monosaccharide dissolution rate during the digestion of bird’s nest%

表4 燕窩單糖相關性分析Table 4 Correlation analysis of bird’s nest monosaccharide

圖4 燕窩消化過程中唾液酸的存在形式和質量分數(shù)變化Fig.4 Changes of sialic acid in the process of bird’s nest digestion

消化開始時刻，游離態(tài)唾液酸質量分數(shù)為6.42%，胃消化2 h后達到13.69%，腸消化2 h后達到17.41%。胃階段，游離態(tài)唾液酸質量分數(shù)明顯增加，主要是受胃階段低pH的影響。胃消化過程中，聚糖態(tài)唾液酸質量分數(shù)始終維持在1%左右，而蛋白態(tài)唾液酸質量分數(shù)在消化前30 min內增加了10%，之后一直維持在20%左右。胃消化過程中，胃蛋白酶在遠離燕窩糖基化的位點作用，唾液酸與蛋白質穩(wěn)定結合。腸階段，聚糖態(tài)唾液酸質量分數(shù)明顯增加，腸消化2 h后達到11.85%，蛋白態(tài)唾液酸質量分數(shù)減少了6.82%，推測胰蛋白酶在靠近燕窩蛋白糖基化的位點作用，生成更多的聚糖態(tài)唾液酸。原料中的唾液酸經過胃腸消化后17.41%以游離形式存在，11.85%與聚糖結合，14.98%與蛋白質結合，仍有55.76%無法溶解到消化上清液中，唾液酸總的消化利用率較低，且聚糖態(tài)唾液酸含量較少，無法被有效吸收。

2.6 消化過程中燕窩糖蛋白結合程度分析

通過電泳蛋白質染色和糖染色分析消化過程中糖鏈和蛋白質的結合程度，結果如圖5和圖6所示。

燕窩蛋白以大分子糖蛋白為主，相對分子質量128 000和108 000，糖染顏色顯著。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)相對分子質量為128 000和106 000蛋白質占總蛋白質質量分數(shù)80%左右，唾液酸化程度分別為20%、17%[17]。胃消化的前30 min大分子蛋白質顯著分解，50 000~75 000處生成明顯的蛋白質涂層，該段蛋白質的糖含量最高。37 000、20 000的蛋白糖含量較低，15 000處有小分子蛋白質的堆積條帶，糖鏈的顏色最淺。胃階段消化反應30 min后條帶的類型沒有明顯變化。腸消化過程中，100 000~150 000的大分子蛋白進一步降解，形成137 000、128 000、106 000三條清晰條帶，這些大分子蛋白質具有抗消化性。50 000~75 000模糊的蛋白質涂層降解為50 000、60 000、73 000蛋白質條帶，其中50 000蛋白糖含量最高。20 000、15 000處的蛋白質進一步降解形成多肽。整個消化過程中燕窩原料中的大分子糖蛋白被水解成集中在37 000~150 000的若干條條帶，無法被進一步水解，糖鏈與蛋白質緊密結合。

圖5 燕窩消化過程中蛋白質相對分子質量分布Fig.5 Protein molecular weight distribution during digestion of bird’s nest

圖6 燕窩消化過程中聚糖相對分子質量分布Fig.6 Glycochain molecular weight distribution during digestion of bird’s nest

2.7 消化過程中難溶性蛋白質的二級結構相對質量分數(shù)變化

蛋白質的二級結構是評價蛋白質空間構象及其穩(wěn)定性的重要指標。燕窩消化過中存在部分蛋白質始終難以溶解，現(xiàn)測定燕窩原料及消化過程中難溶蛋白的二級結構，結果如表5所示。

表5 消化過程中難溶于水的蛋白質二級結構質量分數(shù)Table 5 Secondary structure content of water insoluble protein during digestion

燕窩原料的二級結構中β折疊為51%，α螺旋17%，無規(guī)則卷曲13%，β轉角19%。整個消化過程中難溶蛋白質的二級結構以β折疊和α螺旋為主，蛋白質空間結構的穩(wěn)定性主要依靠β折疊的鏈間氫鍵和α螺旋的鏈內氫鍵等非共價鍵來維持。研究發(fā)現(xiàn)無規(guī)則卷曲、β轉角等無序結構有利于蛋白酶進行水解作用[18]。燕窩中的難溶蛋白質的無序結構含量較低，不利于酶進一步水解。

3 結語

燕窩經過燉煮消化后，蛋白質溶解度僅為47%，仍有50%以上的蛋白質未溶解，推測其溶解性與蛋白質二級結構有關。蛋白質水解度11.5%，未被全部水解成具有高抗氧化活性的低聚肽，相對分子質量50 000~150 000存在大量蛋白條帶，沒有被完全消化?？偺侨芙舛?9%，糖染結果顯示消化過程中水溶性糖蛋白中的糖鏈與蛋白質結合緊密。唾液酸作為燕窩重要功能活性成分，消化后未溶解態(tài)唾液酸質量分數(shù)達到56%，唾液酸利用率有待提高。游離態(tài)唾液酸含量有利于提高燕窩的美白活性，燕窩消化后游離態(tài)唾液酸質量分數(shù)僅為17%，需要進一步促進燕窩消化后游離態(tài)唾液酸的釋放。聚糖態(tài)唾液酸相比游離態(tài)唾液酸吸收穩(wěn)定性更強，燕窩消化后的聚糖態(tài)唾液酸質量分數(shù)僅為12%，需要進一步提高。多肽和唾液酸是燕窩的主要功能活性成分，建議通過高溫燉煮或其他酶水解等方法對燕窩進行加工，以進一步提高燕窩中蛋白質的溶解性以及燕窩消化后多肽、游離態(tài)和聚糖態(tài)唾液酸含量，提高燕窩的生物活性和生物利用度。