王 鑫，范群艷，連建梅，鄒鋒揚(yáng)，王雅馨，李建貴，陳茂深*，鐘 芳，李 玥

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.廈門市燕之屋絲濃食品有限公司，福建 廈門 361101）

燕窩為雨燕科金絲燕屬鳥類分泌的唾液與其羽絨混合凝結(jié)而成的物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，具有多種生物活性[1]。燕窩主要營(yíng)養(yǎng)成分為蛋白質(zhì)、碳水化合物、唾液酸，同時(shí)含有微量的脂質(zhì)和無(wú)機(jī)元素。唾液酸是燕窩的核心物質(zhì)，是腦神經(jīng)節(jié)苷脂的有益成分。燕窩的生物活性和其消化特性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，燕窩經(jīng)過(guò)消化后抗氧化活性顯著提高，能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[2]。Ghassem等發(fā)現(xiàn)燕窩模擬消化產(chǎn)物中的多肽組分具有較高的抗氧化能力，分離純化發(fā)現(xiàn)其中PFHPY和LLGDP兩種肽能夠保護(hù)HepG2細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷[3]。Wong等研究發(fā)現(xiàn)，消化后的燕窩具有更強(qiáng)的美白活性和成骨活性，能夠抑制酪氨酸酶的活性，減少小鼠黑色素瘤細(xì)胞中的黑色素分泌量，同時(shí)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，增加小鼠的骨強(qiáng)度和真皮厚度[4]。

唾液酸對(duì)酪氨酸酶活性具有劑量依賴性的抑制作用，對(duì)皮膚有美白功效[5]。多肽和唾液酸是消化產(chǎn)物中的主要功能活性成分。目前關(guān)于燕窩的研究主要集中在原料的品質(zhì)偽劣鑒定和生物活性評(píng)價(jià)，關(guān)于燕窩消化特性的研究沒(méi)有詳盡的報(bào)道。作者采用Standard法模擬燉煮燕窩體外胃腸的消化，對(duì)燕窩蛋白和碳水化合物的含量和組成進(jìn)行了全面的測(cè)定分析，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高胃腸消化特性的燕窩新產(chǎn)品提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

燕窩：市售；胃蛋白酶、胰蛋白酶：Sigma公司產(chǎn)品；鼠李糖，半乳糖，甘露糖，鄰苯二胺鹽酸鹽，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；氨基葡萄糖、D-半乳糖胺鹽酸鹽、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸：上海創(chuàng)賽有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

傅立葉紅外光譜儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；PowerPacTMBasic Power Supply基礎(chǔ)電泳儀電源：伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司產(chǎn)品；搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品；DL-5-A低速臺(tái)式大容量離心機(jī)、KDN-08C數(shù)顯溫控消化爐：上海新嘉電子有限公司產(chǎn)品；UV-2802紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；KDN-103F凱氏定氮儀：上海纖檢儀器有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀Waters 2695（Waters 2475熒 光 檢 測(cè) 器、Waters 2998紫 外 檢 測(cè) 器）：美 國(guó)Waters公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理將燕窩研磨成粉末，用60目篩子過(guò)濾，收集過(guò)濾粉末，裝袋，-20℃貯藏。

1.3.2 模擬體外消化過(guò)程利用Standard法模擬胃腸消化：稱量0.8 g燕窩粉末，溶于10 mL水中，沸水水浴1 h，冷卻至室溫[6]。將燕窩溶液與10 mL的模擬胃液混合于50 mL離心管內(nèi)，37℃恒溫振蕩水浴，HCl調(diào)節(jié)pH使其始終保持在2.0±0.2，在100 r/min的速度下模擬胃階段消化，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)單獨(dú)做一個(gè)消化管，每隔30 min依次用堿液調(diào)節(jié)pH至8.0滅酶，以4 500 g離心分離上清液，-20℃貯藏，分析0，30，60，90，120 min的消化情況。胃消化結(jié)束后，進(jìn)入小腸消化階段。加入16 mL模擬腸液，NaOH調(diào)節(jié)pH使其始終保持在7.0±0.2，補(bǔ)水使體系達(dá)到40 mL。繼續(xù)在100 r/min的攪拌速度、37℃的溫度下進(jìn)行腸階段體外消化，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)單獨(dú)做一個(gè)消化管，每隔30 min將一個(gè)離心管進(jìn)行沸水浴滅酶，4 500 g離心分離，上清液-20℃貯藏，離心沉淀物進(jìn)行凍干儲(chǔ)藏，分析150，180，210，240 min的消化情況。

1.3.3 基本成分測(cè)定蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB 5009.5—2016凱氏定氮法，蛋白質(zhì)折算系數(shù)6.25，分別測(cè)定燕窩原料蛋白質(zhì)含量和消化上清液中的水溶性蛋白質(zhì)含量；總糖含量測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB/T15672—2009苯酚硫酸法，葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，分別測(cè)定燕窩原料總糖含量和消化上清液中的總糖含量。

1.3.4 水解度測(cè)定參考楊文博等人的方法，采用甲醛滴定法[7]。水溶性蛋白質(zhì)水解度（%）=ρ×V/m （1）式中：ρ為消化上清液中游離氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度，g/mL；V為消化液體積，mL；m為消化上清液中的燕窩蛋白總氮質(zhì)量，g。

1.3.5 多肽測(cè)定方法參考GB31645—2018膠原蛋白肽的測(cè)定。色譜條件：TSK gel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈∶水∶三氟乙酸，體積比為40∶60∶0.05。檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器220 nm；流量：0.5 mL/min；進(jìn)樣體積10μL。

1.3.6 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法采用Nicolet iS50 FTIR型傅立葉變換紅外光譜儀測(cè)定。掃描次數(shù)32次，入射角45°，掃描波數(shù)范圍4 000~600 cm-1，分辨率為4 cm-1。測(cè)試樣品粉末衰減全反射紅外光譜（ATR-FTIR），每個(gè)樣品重復(fù)采集3次。

1.3.7 唾液酸測(cè)定方法參考袁玲和張啟偉等人的方法，采用領(lǐng)苯二胺（OPD）柱前衍生法測(cè)定燕窩原料和消化上清液的唾液酸含量[8-9]。

取50 mg原料溶解在40 mL的體積分?jǐn)?shù)1%磷酸溶液中，沸水浴水解20 min，冷卻后加入20 mg/mL的鄰苯二氨鹽酸鹽溶液1 mL，80℃避光水浴40 min，水系濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

游離態(tài)唾液酸測(cè)定，取1 mL液體樣品，加入20 mg/mL的鄰苯二氨鹽酸鹽溶液1 mL，50℃避光水浴2.5 h，改變溫度至4℃繼續(xù)衍生48 h，水系濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

聚糖態(tài)唾液酸測(cè)定，取1 mL液體樣品，按 體積比1∶1加入Sevage試劑（V（三氯甲烷）∶V（正丁醇）=4∶1）反復(fù)萃取除去蛋白質(zhì)，加入20 mg/mL的鄰苯二氨鹽酸鹽溶液1 mL，80℃避光水浴40 min，水系濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

蛋白態(tài)唾液酸測(cè)定，取1 mL消化上清液酸解，測(cè)定清液中唾液酸總量。

未溶解唾液酸測(cè)測(cè)定，取50 mg燕窩消化后的離心沉淀物，溶解在40 mL的1%體積分?jǐn)?shù)磷酸溶液中，沸水浴水解20 min，80℃避光水浴40 min，水系濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

1.3.8 單糖測(cè)定方法參考戴軍等人方法，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定燕窩原料和消化上清液的單糖組成[10]。

1.3.9 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定方法取消化液與上樣緩沖液等體積均勻混合，100℃加熱3 min變性處理，8 000 r/min離心3 min。還原電泳條件：10 g/dL分離膠，5 g/dL濃縮膠，上樣量10μL。對(duì)燕窩糖蛋白中的蛋白和糖鏈分別進(jìn)行單獨(dú)染色，考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行蛋白染色，高碘酸-席夫堿法進(jìn)行糖染色[11]。Image Lab圖像軟件用于SDS-PAGE凝膠分析。

1.3.1 0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，采用SPSS19.0和Origin 8.0進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 燕窩主要組成成分

蛋白質(zhì)和碳水化合物是人類生命活動(dòng)的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而唾液酸是腦神經(jīng)節(jié)苷脂的重要組分，直接參與神經(jīng)系統(tǒng)改善和大腦發(fā)育。燕窩蛋白主要為唾液酸糖蛋白，其主要成分如表1所示。

表1 主要化學(xué)成分Table 1 Main chemical composition of samples

蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.86%，唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.25%，其余單糖的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.45%。燕窩的化學(xué)組成與其品種、產(chǎn)地關(guān)系緊密，Hamzah等對(duì)馬來(lái)西亞、印度尼西亞等不同產(chǎn)地燕窩的蛋白質(zhì)和唾液酸分析，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在59.8%~73.8%，唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%左右，與研究結(jié)果一致[1]。研究發(fā)現(xiàn)，日常飲食中的高蛋白質(zhì)食物如黃豆，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為36.3%，遠(yuǎn)低于燕窩[12]。燕窩是唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的食物，而奶粉中的唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.05%[13]。

對(duì)燕窩中單糖組成進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。可以看出燕窩總糖主要由6種單糖組成，其中，半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到6.59%，其次為N-乙酰半乳糖胺4.15%和甘露糖3.22%。研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)如越南、印度尼西亞和泰國(guó)的燕窩單糖組成中，N-乙酰葡萄糖胺（4.76%~5.64%）、N-乙酰半乳糖胺（3.79%~4.54%）和半乳糖（4.58%~5.43%）質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，在其他定量中，發(fā)現(xiàn)鼠李糖（0.02%）和木糖（0.21%）。燕窩單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異受產(chǎn)地和加工過(guò)程影響[1]。

表2 燕窩原料單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of raw materials of bird’s nest

2.2 消化過(guò)程中溶解燕窩蛋白質(zhì)、總糖、唾液酸溶解度變化

燕窩的生物活性和其消化特性有關(guān)，對(duì)燕窩消化過(guò)程中蛋白質(zhì)、總糖、唾液酸的溶解性進(jìn)行研究，結(jié)果如圖1所示。

圖1 消化過(guò)程中燕窩蛋白質(zhì)、總糖、唾液酸溶解度變化Fig.1 Changes of solubility of protein,total sugar and sialic acid during digestion of bird’s nest

消化初始階段，燕窩蛋白質(zhì)溶解度為13.85%，胃階段消化2 h后增加到28.75%，腸階段繼續(xù)消化2 h后增加到47.23%。總糖溶解度為7.49%，經(jīng)過(guò)胃消化2 h后增加到24.92%，腸消化2 h后增加到39.02%。整個(gè)消化過(guò)程中蛋白質(zhì)和總糖的溶解度呈顯著線性正相關(guān)（r=0.984，P＜0.01），溶解速率較為一致，糖與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密，共同溶解到消化上清液中。唾液酸溶解度的變化情況與蛋白質(zhì)、總糖不同，燉煮燕窩消化開(kāi)始時(shí)刻的唾液酸溶解度為18.69%，胃消化前30 min內(nèi)溶解度快速增加，達(dá)到31.45%，30 min后溶解速率降低，溶解度緩慢增加，胃消化2 h后僅為35.34%。腸消化過(guò)程中唾液酸溶解度的變化與胃階段類似，前30 min內(nèi)唾液酸溶解度再次快速增加，達(dá)到42.85%，30 min后溶解度趨于平緩，腸消化2 h后為44.24%。

2.3 消化過(guò)程中蛋白質(zhì)水解度和多肽相對(duì)分布

水解度可以表征蛋白質(zhì)肽鍵的斷裂程度，多肽相對(duì)分布表征蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的具體情況。燕窩蛋白質(zhì)的水解度如圖2（a）所示。

胃腸消化后，燕窩總蛋白質(zhì)的水解度分別為5.47%、12.12%。消化上清液中水溶性蛋白質(zhì)的水解度分別為13.48%、18.13%。胃消化階段，水溶性蛋白質(zhì)的水解主要發(fā)生在消化前30 min。腸消化階段，水溶性蛋白和總蛋白質(zhì)的水解度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，胰蛋白酶有助于提高燕窩蛋白的溶解度。郭立春等用胰蛋白酶水解膠原的總蛋白質(zhì)水解度為20%，和膠原蛋白相比，燕窩水解度較低[14]。

圖2 燕窩消化過(guò)程中水解度和多肽相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.2 Changes of hydrolysis degree and molecular weight of polypeptide during digestion of bird’s nest

多肽相對(duì)分布如圖2（b）所示，消化開(kāi)始時(shí)刻，燉煮燕窩溶液中主要為蛋白質(zhì)。胃消化前30 min，燕窩中的水溶性蛋白質(zhì)被快速水解成低聚肽（＜1 000）和中等相對(duì)分子質(zhì)量肽（1 000~5 000），而大相對(duì)分子質(zhì)量肽段（5 000~10 000）和蛋白質(zhì)（＞10 000）相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少。30 min后多肽相對(duì)分布趨于穩(wěn)定，低聚肽和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有增加，中等相對(duì)分子質(zhì)量和大相對(duì)分子質(zhì)量肽段相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少。胃消化2 h后，低聚肽、中等相對(duì)分子質(zhì)量肽段和大相對(duì)分子質(zhì)量肽段的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為36.6%、45%、5.96%，而蛋白質(zhì)相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.47%。燕窩蛋白為酸性蛋白質(zhì)，其中相對(duì)分子質(zhì)量1.28×105和1.06×105蛋白質(zhì)為相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的蛋白質(zhì)，這兩種蛋白的等電點(diǎn)pH≤3，進(jìn)入胰階段，消化液pH由酸性變成中性，蛋白質(zhì)更易溶解從而被胰蛋白酶水解。腸消化前30 min，在胰蛋白酶的作用下，多肽相對(duì)分布發(fā)生顯著變化。低聚肽和蛋白質(zhì)相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加15.28%、23.06%，中等相對(duì)分子質(zhì)量肽減少39.3%，大相對(duì)分子質(zhì)量肽相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒(méi)有顯著變化，30 min后多肽相對(duì)分布趨于穩(wěn)定。腸消化2 h后，低聚肽、中等相對(duì)分子質(zhì)量肽段和大相對(duì)分子質(zhì)量肽段相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為51.88%、5.65%、6.94%，蛋白質(zhì)相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35.53%。

2.4 消化過(guò)程中單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

Yagi等研究發(fā)現(xiàn)燕窩中的糖與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，同時(shí)含有O連接型和N連接型糖蛋白[15]。N型和O型糖蛋白的糖鏈并不是單一的直鏈糖，存在多個(gè)分支。N-乙酰半乳糖胺是O型糖蛋白中特有的單糖，可以表征O型糖蛋白的溶解度。N型糖蛋白中復(fù)雜型聚糖結(jié)構(gòu)的唾液酸含量最高，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖和甘露糖是N型聚糖中最主要的糖，其糖鏈的結(jié)構(gòu)如圖3所示。燕窩的單糖組成有助于判斷消化過(guò)程中溶解的燕窩糖蛋白的類型。燕窩消化后的單糖包括甘露糖、鼠李糖、N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和氨基葡萄糖。不同單糖之間的溶解度存在差異，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 燕窩唾液酸聚糖結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of sialic acid glycan from bird’s nest

消化開(kāi)始時(shí)刻N(yùn)-乙酰半乳糖胺的溶解度僅為3.92%，經(jīng)過(guò)胃腸消化后溶解度為24.73%，O型糖苷鍵在中性和堿性條件下一般較為穩(wěn)定，在酸性條件更易被水解。該糖溶解度低說(shuō)明O型糖蛋白不易被消化。胃腸消化后，N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖和甘露糖的溶解度達(dá)到49.65%、46.61%、16.36%。N型糖蛋白溶解度更高，可能是因?yàn)镹型糖苷不如O型糖苷穩(wěn)定性好，它在水中容易水解，推測(cè)溶出的N型糖蛋白以復(fù)雜型和雜合型為主。對(duì)燕窩消化離心上清液中以聚糖鏈形式存在的4種單糖相對(duì)含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表4所示。糖鏈中的單糖均呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明燕窩中的糖鏈結(jié)構(gòu)完整，胃腸消化過(guò)程中燕窩的糖鏈未被水解。

2.5 消化過(guò)程中唾液酸存在形式和質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

唾液酸是燕窩中最具有價(jià)值的物質(zhì)，在哺乳動(dòng)物大腦發(fā)育的過(guò)程中不可或缺。燕窩中的唾液酸主要結(jié)合在糖蛋白的糖鏈末端，少量以游離和聚糖的形式存在。外源性含唾液酸的食物在哺乳動(dòng)物的代謝研究表明，游離唾液酸雖然有利于人體吸收，但是單體唾液酸在體內(nèi)的滯留時(shí)間太短，無(wú)法充分吸收利用。與蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸可以延長(zhǎng)其在體內(nèi)的滯留時(shí)間，但是難以被轉(zhuǎn)化吸收。和低聚糖或者聚糖肽結(jié)合的唾液酸在體內(nèi)的滯留時(shí)間合適，同時(shí)也有利于吸收利用[16]。燕窩唾液酸在消化過(guò)程中的存在形式和質(zhì)量分?jǐn)?shù)變?nèi)鐖D4所示。

表3 燕窩消化過(guò)程中單糖溶解度Table 3 Monosaccharide dissolution rate during the digestion of bird’s nest%

表4 燕窩單糖相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of bird’s nest monosaccharide

圖4 燕窩消化過(guò)程中唾液酸的存在形式和質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.4 Changes of sialic acid in the process of bird’s nest digestion

消化開(kāi)始時(shí)刻，游離態(tài)唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.42%，胃消化2 h后達(dá)到13.69%，腸消化2 h后達(dá)到17.41%。胃階段，游離態(tài)唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加，主要是受胃階段低pH的影響。胃消化過(guò)程中，聚糖態(tài)唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終維持在1%左右，而蛋白態(tài)唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在消化前30 min內(nèi)增加了10%，之后一直維持在20%左右。胃消化過(guò)程中，胃蛋白酶在遠(yuǎn)離燕窩糖基化的位點(diǎn)作用，唾液酸與蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合。腸階段，聚糖態(tài)唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加，腸消化2 h后達(dá)到11.85%，蛋白態(tài)唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少了6.82%，推測(cè)胰蛋白酶在靠近燕窩蛋白糖基化的位點(diǎn)作用，生成更多的聚糖態(tài)唾液酸。原料中的唾液酸經(jīng)過(guò)胃腸消化后17.41%以游離形式存在，11.85%與聚糖結(jié)合，14.98%與蛋白質(zhì)結(jié)合，仍有55.76%無(wú)法溶解到消化上清液中，唾液酸總的消化利用率較低，且聚糖態(tài)唾液酸含量較少，無(wú)法被有效吸收。

2.6 消化過(guò)程中燕窩糖蛋白結(jié)合程度分析

通過(guò)電泳蛋白質(zhì)染色和糖染色分析消化過(guò)程中糖鏈和蛋白質(zhì)的結(jié)合程度，結(jié)果如圖5和圖6所示。

燕窩蛋白以大分子糖蛋白為主，相對(duì)分子質(zhì)量128 000和108 000，糖染顏色顯著。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為128 000和106 000蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%左右，唾液酸化程度分別為20%、17%[17]。胃消化的前30 min大分子蛋白質(zhì)顯著分解，50 000~75 000處生成明顯的蛋白質(zhì)涂層，該段蛋白質(zhì)的糖含量最高。37 000、20 000的蛋白糖含量較低，15 000處有小分子蛋白質(zhì)的堆積條帶，糖鏈的顏色最淺。胃階段消化反應(yīng)30 min后條帶的類型沒(méi)有明顯變化。腸消化過(guò)程中，100 000~150 000的大分子蛋白進(jìn)一步降解，形成137 000、128 000、106 000三條清晰條帶，這些大分子蛋白質(zhì)具有抗消化性。50 000~75 000模糊的蛋白質(zhì)涂層降解為50 000、60 000、73 000蛋白質(zhì)條帶，其中50 000蛋白糖含量最高。20 000、15 000處的蛋白質(zhì)進(jìn)一步降解形成多肽。整個(gè)消化過(guò)程中燕窩原料中的大分子糖蛋白被水解成集中在37 000~150 000的若干條條帶，無(wú)法被進(jìn)一步水解，糖鏈與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合。

圖5 燕窩消化過(guò)程中蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig.5 Protein molecular weight distribution during digestion of bird’s nest

圖6 燕窩消化過(guò)程中聚糖相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig.6 Glycochain molecular weight distribution during digestion of bird’s nest

2.7 消化過(guò)程中難溶性蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象及其穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。燕窩消化過(guò)中存在部分蛋白質(zhì)始終難以溶解，現(xiàn)測(cè)定燕窩原料及消化過(guò)程中難溶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表5所示。

表5 消化過(guò)程中難溶于水的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 Secondary structure content of water insoluble protein during digestion

燕窩原料的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β折疊為51%，α螺旋17%，無(wú)規(guī)則卷曲13%，β轉(zhuǎn)角19%。整個(gè)消化過(guò)程中難溶蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β折疊和α螺旋為主，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要依靠β折疊的鏈間氫鍵和α螺旋的鏈內(nèi)氫鍵等非共價(jià)鍵來(lái)維持。研究發(fā)現(xiàn)無(wú)規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角等無(wú)序結(jié)構(gòu)有利于蛋白酶進(jìn)行水解作用[18]。燕窩中的難溶蛋白質(zhì)的無(wú)序結(jié)構(gòu)含量較低，不利于酶進(jìn)一步水解。

3 結(jié)語(yǔ)

燕窩經(jīng)過(guò)燉煮消化后，蛋白質(zhì)溶解度僅為47%，仍有50%以上的蛋白質(zhì)未溶解，推測(cè)其溶解性與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。蛋白質(zhì)水解度11.5%，未被全部水解成具有高抗氧化活性的低聚肽，相對(duì)分子質(zhì)量50 000~150 000存在大量蛋白條帶，沒(méi)有被完全消化。總糖溶解度39%，糖染結(jié)果顯示消化過(guò)程中水溶性糖蛋白中的糖鏈與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密。唾液酸作為燕窩重要功能活性成分，消化后未溶解態(tài)唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到56%，唾液酸利用率有待提高。游離態(tài)唾液酸含量有利于提高燕窩的美白活性，燕窩消化后游離態(tài)唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為17%，需要進(jìn)一步促進(jìn)燕窩消化后游離態(tài)唾液酸的釋放。聚糖態(tài)唾液酸相比游離態(tài)唾液酸吸收穩(wěn)定性更強(qiáng)，燕窩消化后的聚糖態(tài)唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為12%，需要進(jìn)一步提高。多肽和唾液酸是燕窩的主要功能活性成分，建議通過(guò)高溫?zé)踔蠡蚱渌杆獾确椒▽?duì)燕窩進(jìn)行加工，以進(jìn)一步提高燕窩中蛋白質(zhì)的溶解性以及燕窩消化后多肽、游離態(tài)和聚糖態(tài)唾液酸含量，提高燕窩的生物活性和生物利用度。