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        基于微流控芯片的茶多酚電化學(xué)檢測方法研究

        2021-09-04 06:08:30謝耀聰俞建峰
        關(guān)鍵詞:微流伏安茶多酚

        謝耀聰,俞建峰*,石 賽

        (1.江南大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122;2.江蘇省食品先進(jìn)制造裝備技術(shù)重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

        茶多酚是茶葉中多酚類化合物的總稱,是一種安全無毒、無副作用的純天然提取物[1]。茶多酚中含有較多羥基,能夠有效抑制氧化酶活性,阻止氧化過程中的鏈?zhǔn)椒磻?yīng),表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力[2],具有清除自由基[3]、抗衰老[4]、抗癌[5]、降血脂[6]等生物活性,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[7-9]。因此,茶多酚的檢測分析對茶多酚制品的品質(zhì)控制具有重要意義。

        目前茶多酚的檢測方法主要有福林酚法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[10],雖然這些方法檢測精度高,但也存在操作復(fù)雜、分析時間長、儀器成本高等缺點。循環(huán)伏安法和安培滴定法等電化學(xué)技術(shù),具有檢測速度快、靈敏度高和儀器成本低等優(yōu)點[11],已成為一種茶多酚檢測的新方法,但現(xiàn)有的茶多酚電化學(xué)檢測過程仍存在自動化程度低,試劑樣品用量大等[12]缺陷。

        微流控是一種在微米尺度的通道中實現(xiàn)微液滴操縱、沉淀反應(yīng)、分離及檢測等功能的技術(shù)[13]。微流控芯片中可集成生物酶、微電極等結(jié)構(gòu),并借助檢測儀器實現(xiàn)物質(zhì)的定量分析,減少了試劑用量,實現(xiàn)樣品預(yù)處理到檢測分析的整體微型化、集成化與便攜化[14-15]。開展微流控和電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的茶多酚檢測方法的研究尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。

        作者提出了一種基于微流控芯片的茶多酚電化學(xué)檢測方法,將茶多酚檢測過程中的進(jìn)料、混合和循環(huán)伏安檢測功能集成在微流控芯片上,采用3D打印技術(shù)制造微流控芯片,以微流控芯片為檢測通道,絲網(wǎng)印刷電極為電化學(xué)傳感器,建立了微流控檢測平臺,通過實驗對檢測過程中的緩沖液種類、緩沖液pH、掃描速度和進(jìn)料流量等4個參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,最后運用該方法測定普洱茶樣品的茶多酚含量,并與標(biāo)準(zhǔn)福林酚法的檢測結(jié)果進(jìn)行對比。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 材料沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品:購于合肥博美生物公司;普洱茶樣品:購于云南普洱茶(集團(tuán))有限公司;福林酚、碳酸鈉、氯化鉀、濃硫酸,配置PBS緩沖液的磷酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀,配置CBS緩沖液的檸檬酸、磷酸氫二鈉、配置B-R緩沖液的硼酸、乙酸、氫氧化鈉:購于國藥集團(tuán)試劑有限公司;其他試劑均為分析純,使用前未進(jìn)行純化;實驗用水均為去離子水。

        1.1.2 儀器CHI660E電化學(xué)工作站:上海辰華儀器公司產(chǎn)品;注射泵:蘇州汶顥微流控技術(shù)有限公司產(chǎn)品;微流控芯片:江南大學(xué)食品加工技術(shù)與裝備研究中心自制;絲網(wǎng)印刷碳電極:市售;精密電子分析天平:奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司產(chǎn)品;722可見分光光度計:上海欣茂儀器有限公司產(chǎn)品;高速離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

        1.2 微流控芯片研制

        為了滿足微流控檢測平臺對茶多酚的檢測需求,設(shè)計了具有自動進(jìn)料、混合和循環(huán)伏安檢測功能的微流控芯片,模型如圖1所示。A為芯片的進(jìn)料通道,通過PTFE導(dǎo)管分別與注射泵的兩個微量進(jìn)樣器連接,實現(xiàn)緩沖液和待測樣品的自動進(jìn)料功能;B為混合通道,將緩沖液和待測樣品進(jìn)行充分混合,為循環(huán)伏安法提供穩(wěn)定的檢測環(huán)境,混合是茶多酚檢測過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),如果混合不均勻?qū)a(chǎn)生較大的檢測誤差,因此將混合通道設(shè)計成內(nèi)肋形微混合結(jié)構(gòu),文獻(xiàn)報道并驗證了此結(jié)構(gòu)混合效率高,混合均勻性好[16]。C為電化學(xué)檢測區(qū),D為廢液出口,E為電極插口??杉缮唐坊z網(wǎng)印刷電極,降低了微電極高昂的制作成本,絲網(wǎng)印刷電極為三電極結(jié)構(gòu),工作電極和輔助電極為碳墨電極,參比電極為Ag/AgCl電極。

        圖1 微流控芯片結(jié)構(gòu)模型Fig.1 Structure model of microfluidic chip

        微流控芯片由Micro Plus Advantage 3D打印機(jī)(EnvieionTEC,德國)采用DLP技術(shù)打印成型,芯片材料為Formlabs耐高溫光敏樹脂。

        1.3 檢測平臺搭建

        圖2為微流控檢測平臺示意圖,主要由注射泵(行程分辨率:0.078μm)、微流控芯片(自制)、絲網(wǎng)印刷電極、電化學(xué)工作站和計算機(jī)組成。微流控芯片的接口處均采用熱熔膠密封,防止溶液泄漏。注射泵通過微量進(jìn)樣器以一定的進(jìn)料流量將緩沖液和待測樣品分別注入微流控芯片的進(jìn)料通道,兩種溶液混合均勻后到達(dá)電化學(xué)檢測區(qū),絲網(wǎng)印刷電極通過適配器與電化學(xué)工作站連接,電化學(xué)工作站采用循環(huán)伏安法測得氧化峰電流與沒食子酸濃度的定量關(guān)系,進(jìn)而應(yīng)用于茶多酚的檢測分析。

        圖2 微流控檢測平臺示意圖Fig.2 Schematic diagram of microfluidic detection platform

        1.4 實驗方法

        1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備沒食子酸母液制備:稱取0.171 g的沒食子酸(gallic acid,GA)標(biāo)準(zhǔn)品加入燒杯中,用去離子水充分溶解后,移至100 mL容量瓶中定容。將母液稀釋成5~1 250μmol/L共13個不同濃度的沒食子酸溶液,4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4.2 樣品制備普洱茶樣品母液制備:將15 mL體積分?jǐn)?shù)10%的甲醇溶液置于70℃水浴鍋中預(yù)熱,普洱茶樣品置于碾磨缽中碾磨,稱取0.2 g碾磨后的樣品于8 mL離心試管中,加入5 mL預(yù)熱后的甲醇溶液,充分?jǐn)嚢?,立即轉(zhuǎn)至70℃水浴鍋中保溫10 min,取出后降到室溫,在3 500 r/min的離心機(jī)中離心10 min,上層清液移至10 mL容量瓶中,殘渣再提取一次,另用濾紙過濾兩次,合并兩次清液加去離子水定容到10 mL,搖勻,4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4.3 電極活化絲網(wǎng)印刷碳電極的活化方法1:將電極插入飽和碳酸鈉溶液中,采用計時電流法,恒電位為1.2 V,掃描5 min;方法2:將電極置于0.5 mol/L稀硫酸溶液中,采用循環(huán)伏安法掃描至穩(wěn)定。電極活化后集成至微流控檢測平臺上,采用循環(huán)伏安法,進(jìn)料流量為40μL/min,以100 mV/s進(jìn)行掃描,電解質(zhì)為B-R緩沖液(pH 3.0)。在此條件下,研究沒食子酸的電化學(xué)行為,選擇最佳的電極活化方法。

        1.4.4 實驗條件優(yōu)化

        1)研究緩沖液種類和pH的影響 制備0.1 mol/L的B-R,PBS,CBS 3種緩沖液(pH 3.0)。注射泵的檢測樣品進(jìn)樣器吸取500μmol/L的沒食子酸溶液2 mL,緩沖液進(jìn)樣器每次吸取與沒食子酸等量的緩沖液,設(shè)定注射泵的進(jìn)料流量為40μL/min,以100 mV/s進(jìn)行掃描,同一條件下連續(xù)檢測5次,取氧化峰電流的平均值。更換緩沖液進(jìn)樣器中的緩沖液,重復(fù)檢測步驟。選定最佳緩沖液后,配置其不同pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0),重復(fù)檢測步驟。

        2)研究掃描速度的影響 注射泵的兩個進(jìn)樣器分別吸取B-R緩沖液(pH 3.0)和500μmol/L的沒食子酸溶液2 mL,設(shè)定其進(jìn)料流量為40μL/min,改變循環(huán)伏安掃描方式,同一條件下連續(xù)檢測5次,取氧化峰電流的平均值。

        3)研究進(jìn)料速度的影響 注射泵的兩個進(jìn)樣器分別吸取B-R緩沖液(pH 3.0)和500μmol/L的沒食子酸溶液2 mL,設(shè)定循環(huán)伏安掃描速度為100 mV/s,改 變 進(jìn) 料 流 量(0,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200μL/min),同一條件下連續(xù)檢測5次,取氧化峰電流的平均值。

        1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定在最優(yōu)實驗條件下,分別測定5~1 250μmol/L共13組不同濃度沒食子酸的氧化峰電流值,同一濃度下連續(xù)檢測5次,取氧化峰電流的平均值,每次檢測所消耗的沒食子酸溶液為10μL。以沒食子酸濃度x為橫坐標(biāo),氧化峰電流值y為縱坐標(biāo),計算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.4.6 普洱茶樣品中的茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定取普洱茶樣品母液0.25 mL加至100 mL容量瓶中,加水定容,取4份5 mL樣品溶液,分別加入一定量的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,得到樣品待測液,在最優(yōu)實驗條件下,分別測定其氧化峰電流,平行檢測3次,計算得到回收率與樣品中茶多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

        1.4.7 統(tǒng)計分析方法采用Excel 2013記錄和整理實驗數(shù)據(jù),運用OriginPro 2017軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析及作圖。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 沒食子酸在微流控檢測平臺上的電化學(xué)行為

        圖3為空白底液和沒食子酸溶液在集成不同活化電極的微流控檢測平臺上的循環(huán)伏安圖(電壓0~0.9 V)。兩種活化電極在空白底液中,未出現(xiàn)電流響應(yīng);在沒食子酸溶液中,電壓在0.41 V(相對于Ag/AgCl)左右均出現(xiàn)一個不可逆的氧化峰,與文獻(xiàn)[17]中報道的一致。對比圖3中(a)和(b)兩條曲線可知,飽和碳酸鈉活化電極的氧化峰電流響應(yīng)更大,峰形明顯,主要原因是經(jīng)過飽和碳酸鈉溶液處理后,電極表面的碳墨變得蓬松多孔,增加了其與沒食子酸的接觸面積;同時,電極表面生成的含氧基團(tuán)有利于減弱羥基鍵能[18]。這些性質(zhì)有效提高了電極表面的電荷遷移速度,使得電極反應(yīng)速度加快,故選擇在微流控檢測平臺上集成飽和碳酸鈉活化電極。

        圖3 飽和碳酸鈉活化電極和稀硫酸活化電極的循環(huán)伏安圖Fig.3 CVs of saturated sodium carbonate solution activated carbon electrodes and dilute sulfuric acid solution activated carbon electrodes

        2.2 緩沖液種類和pH的影響

        沒食子酸的電化學(xué)行為與緩沖液種類和pH等多種因素有關(guān)。在微流控檢測平臺上,采用循環(huán)伏安法對B-R,PBS和CBS 3種緩沖液中沒食子酸的氧化行為進(jìn)行研究。由圖4(a)可知,B-R緩沖液的氧化峰與陽極電流分離較好,峰電流最大,因此選擇B-R緩沖液作為支持電解質(zhì)。

        通過循環(huán)伏安法在pH 2.0~8.0范圍內(nèi)研究BR緩沖液的pH對沒食子酸氧化峰電流的影響。由圖4(b)可知,當(dāng)pH增加時,沒食子酸的氧化峰電位負(fù)向移動,表明質(zhì)子參與電極反應(yīng)[19]。氧化峰電位與理論值[17]接近。由圖4(c)可知,在pH 2.0~8.0范圍內(nèi),沒食子酸的氧化峰電流隨著pH的增加先增后減,在pH約為3.0處獲得最大的峰電流響應(yīng)。因此,作者選擇pH為3.0的B-R緩沖液,進(jìn)行下一步實驗。

        圖4 緩沖液種類和pH對沒食子酸氧化峰電壓和峰電流的影響Fig.4 Effect of buffer types and pH on the oxidation peak potential and peak current of GA

        2.3 掃描速度的影響

        圖5是不同掃描速度對沒食子酸氧化峰電流的影響。由圖5(a)可知,氧化峰電流隨著掃描速度的增大而增大。由圖5(b)可知,氧化峰電流與掃描速度的平方根具有良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為Ipa=3.820 2+0.234 5v1/2,這表明電極反應(yīng)過程受擴(kuò)散控制[20]。掃描速度超過100 mV/s時,循環(huán)伏安曲線逐漸毛糙,對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾和誤差,綜合考慮氧化峰電流大小和循環(huán)伏安曲線的光滑程度,掃描速度選擇100 mV/s為佳。

        圖5 掃描速度對沒食子酸氧化峰電流的影響Fig.5 Effect of scan rates on the oxidation peak current of GA

        2.4 進(jìn)料流量的影響

        圖6為不同進(jìn)料流量對氧化峰電流的影響。進(jìn)料流量分別在0和20μL/min時,連續(xù)5次測得的氧化峰電流相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD大于10%,重復(fù)性較差,分析其原因可能是微流控芯片中的液體流速過慢時,芯片內(nèi)部液體分布不均勻,導(dǎo)致芯片電化學(xué)檢測區(qū)的沒食子酸濃度產(chǎn)生波動,影響了檢測重復(fù)性;進(jìn)料流量在40~200μL/min時,氧化峰電流隨著進(jìn)料速度的增加先減小后增加,最后趨于穩(wěn)定,檢測結(jié)果重復(fù)性較好(RSD小于1.7%),分析其原因可能是隨著進(jìn)料速度的增加,芯片內(nèi)部流場逐漸穩(wěn)定,但部分沒食子酸的氧化產(chǎn)物吸附在工作電極表面,阻礙了電荷轉(zhuǎn)移,降低了電極表面的反應(yīng)速率[21];隨著進(jìn)料流量進(jìn)一步增加,沒食子酸在電極表面的更新速度加快,使得電極反應(yīng)速度增加,當(dāng)沒食子酸的更新速度達(dá)到極限時,氧化峰電流逐漸穩(wěn)定。綜合考慮氧化峰電流、重復(fù)性和試劑用量,選擇流量為40μL/min。

        圖6 氧化峰電流與進(jìn)料流量的關(guān)系Fig.6 Plots of the oxidation peak current for GA as function of inject speeds

        2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

        在最優(yōu)實驗條件下,采用微流控檢測平臺對不同濃度的沒食子酸進(jìn)行循環(huán)伏安檢測。圖7(A)為不同 濃 度(5,10,25,50,75,100,200,300,400,500,750,1 000,1 250μmol/L)沒食子酸的循環(huán)伏安圖,由圖7(a)可知,氧化峰電流隨著沒食子酸濃度的增加而增加。由圖7(b)可知,沒食子酸濃度在5~1 250μmol/L范圍內(nèi)與氧化峰電流有良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為:Ipa=0.174 3+0.011 4c(Ipa,μA;c,μmol/L;R2=0.998 0),最低檢出限為6.9×10-7mol/L(S/N=3),靈敏度為0.011 4μA/(μmol/L)。

        2.6 重現(xiàn)性、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性

        在最優(yōu)實驗條件下,對微流控檢測平臺進(jìn)行了重現(xiàn)性、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性的研究。在微流控檢測平臺上連續(xù)檢測500μmol/L的沒食子酸溶液5次,測得氧化峰電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.739%,說明檢測平臺具有良好的重現(xiàn)性。采用飽和碳酸鈉溶液活化5片新的絲網(wǎng)印刷碳電極,并依次集成到微流控檢測平臺中對500μmol/L的沒食子酸溶液進(jìn)行測定,測得氧化峰電流的RSD為2.231%,說明檢測平臺具有良好的再現(xiàn)性。采用同一微流控檢測平臺連續(xù)一周對500μmol/L的沒食子酸溶液進(jìn)行檢測(測量次數(shù)大于50次),測得氧化峰電流的RSD為2.068%,說明檢測平臺具有良好的穩(wěn)定性。

        圖7 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定Fig.7 Determination of GA standard curve

        2.7 樣品分析

        取4份已制備的普洱茶樣品待測液,在最優(yōu)實驗條件下,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定其氧化峰電流,平行檢測3次取平均值。樣品檢測結(jié)果如表1所示,回收率在97.6%~104.6%之間,與福林酚法的檢測結(jié)果基本一致,表明本方法可滿足茶多酚常規(guī)分析要求。

        3 結(jié)語

        將茶多酚檢測過程中的進(jìn)料、混合和循環(huán)伏安檢測功能集成在微流控芯片上,并設(shè)計了可集成絲網(wǎng)印刷碳電極的插口,降低了微電極的制作成本,采用3D打印技術(shù)制造微流控芯片,建立了微流控檢測平臺。

        通過實驗對緩沖液種類、緩沖液pH、掃描速度和進(jìn)料速度4個參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,并運用該方法測定普洱茶樣品中茶多酚的含量,檢測結(jié)果與福林酚法基本一致,滿足茶多酚的常規(guī)分析要求。

        本方法中進(jìn)樣、混合和循環(huán)伏安檢測過程自動化進(jìn)行,省去了人工操作環(huán)節(jié),檢測時間縮短為40 s,試劑用量為70μL,具有簡便、低成本、準(zhǔn)確的特點,可用于茶多酚含量的快速檢測,并可推廣到其他植物提取物的快速檢測。

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