李毅然，薛佳欣，梁 靚，蘭 茜，秦晉一，郭家琪，孫 浩

（1.西安海關技術中心，陜西 西安 710068；2.長安大學 建工學院，陜西 西安 710061；3.西北大學 城市與環(huán)境學院，陜西 西安 710127）

進境作物攜帶鏈格孢菌，會給國內(nèi)農(nóng)作物帶來嚴重危害，對國家農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全、農(nóng)產(chǎn)品食用安全有嚴重威脅。在口岸檢疫過程中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)進境小麥攜帶病原菌。其中，鏈格孢菌是進口糧食作物經(jīng)常攜帶的病原菌之一。鏈格孢菌屬于真菌的一種，為半知菌暗色絲孢菌，是農(nóng)作物的主要致病菌之一[1]，能使小麥、玉米、土豆、蘋果、柑橘、煙草等在內(nèi)的幾十種農(nóng)作物發(fā)病[2]。除此之外，還會引起如日本梨黑斑病等眾多病變，造成農(nóng)產(chǎn)品霉變，導致瓜果、蔬菜和儲存食品腐敗及變質(zhì)[3]。鏈格孢菌的代謝會產(chǎn)生毒素，加重作物病害及食品腐敗現(xiàn)象[4]，且毒素會不斷地在農(nóng)作物、瓜果、蔬菜和日常食物中富集，對食品安全造成嚴重威脅[5]。鏈格孢菌的孢子還可以通過釋放過敏原，引發(fā)諸如哮喘[6-7]等人體疾病，從而對人體健康產(chǎn)生嚴重威脅。因此，加強有關鏈格孢菌的研究，制定鏈格孢菌的防控策略尤為重要。

通常，病原微生物的鑒定方法分為傳統(tǒng)方法（菌落、細胞形態(tài)和生理生化、細胞組分鑒定）和分子檢測方法（蛋白質(zhì)檢測、基因檢測）[8]。傳統(tǒng)的病原微生物分離鑒定方法需運用各學科手段綜合觀察，涉及步驟繁雜，速度緩慢，但準確性高。而以聚合酶鏈式反應為基礎的分子生物學檢測方法檢測DNA序列靈敏度高[9]，但容易出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果，無法做到眼見為實的確診。對此，可以利用微生物細胞膜的磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid，PLFA)分析[10]來解決這一問題，磷脂脂肪酸含量在自然生理條件下相對穩(wěn)定，具有遺傳穩(wěn)定性，可作為微生物分類的重要標記[11]。PLFA分析兼顧快速性和準確性，有望成為傳統(tǒng)方法和分子檢測方法的有力補充[12]。對于微生物的細胞膜磷脂來說，PLFA是其重要成分。不同類群微生物通過不同的生化途徑，細胞膜會形成不同的磷脂脂肪酸，這種現(xiàn)象造成在同一類群的微生物中，某些PLFA生物標記出現(xiàn)頻率較高。PLFA具有較高的結(jié)構(gòu)多樣性和生物學特異性，可作為區(qū)分活體微生物群落的生物標記，其也是微生物分類的主要依據(jù)[13]。PLFA分析方法早有研究，之前對25種芽孢桿菌進行脂肪酸系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)其能充分體現(xiàn)菌株間的親緣關系，可以按生物學特性進行聚類分群[14]。利用PLFA生物標記對細菌分類鑒定，其分析結(jié)果與傳統(tǒng)檢測方法相一致[15]。甚至對感染魚類病原體的希瓦氏菌，也使用PLFA分析方法確定出了25種特征脂肪酸[16]?；赑LFA分析方法，確定了從鴨圈中分離得到的病原菌Pseudochrobactrum glaciei為一個新物種[17]。使用PLFA分析方法，可以區(qū)分鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis）和假結(jié)核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis），而其他的鑒定技術很難將其區(qū)分開[18]。由此可見，不同微生物具有不同的PLFA組成和含量，可用來標記特定微生物類群和生物量[19]，但有關植物病原鏈格孢菌磷脂脂肪酸的研究尚未見詳細報道。

進境小麥通關時間有限，在短時間內(nèi)對大批量小麥進行篩查需要消耗大量的人力和物力。通常檢驗是通過傳統(tǒng)方法完成的，但對可疑病變作物，最好就地提取生物DNA，防止二次污染，但其步驟煩瑣，儀器要求較高，對海關現(xiàn)場檢驗工作環(huán)境潔凈度要求苛刻。此外，對于一線檢驗站而言，是沒有能力進行DNA測序的，需要送到相關公司進行商品化測序，耗時較長，不利于進口小麥通關過程中檢驗檢疫的快速高效完成。根據(jù)海關檢驗檢疫的實際操作需求，急需尋找一種兼顧快速性、準確性，能大批量檢測小麥真菌病的篩查手段。鑒于此，本研究以哈薩克斯坦進境小麥為對象，采用ITS序列擴增和NCBI數(shù)據(jù)庫比對，確定攜帶的病原菌株。同時，從小麥病變部位上收集微生物樣品，測定其PLFA種類和含量；比較不同生物取樣量的PLFA分布圖譜，確定檢出該菌株的生物取樣量范圍；運用數(shù)理統(tǒng)計明確該菌株的PLFA指紋圖譜、特征脂肪酸的種類和相對豐度；建立多元線性回歸模型，量化生物取樣量與特征脂肪酸之間的相關關系，嘗試通過特征脂肪酸響應值推算出小麥攜帶的病原微生物量，以便為建立簡便有效的快速鑒定方法提供思路，為評估進口小麥攜帶的病菌危害、評價糧食品質(zhì)提供第一手科學數(shù)據(jù)，為建立相關品質(zhì)標準提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑

LB肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限責任公司生產(chǎn)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（含氯霉素），北京路橋技術有限責任公司生產(chǎn)；Taq聚合酶、dNTPs、DNase Free Water，Takara公司生產(chǎn)；10×Buffer（含MgCl2），購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；K2HPO4、KH2PO4、飽和NaCl、甲醇、濃鹽酸、NaOH顆粒、正己烷和甲基叔丁醚，均購自上海國藥集團有限公司。

1.2 菌株培養(yǎng)

對哈薩克斯坦進口小麥進行抽檢，每抽檢批次送樣品1 kg，在西安海關技術中心進行篩選檢驗。采集小麥病變部位微生物樣本，接種于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～4 d，至長出菌落。挑單菌落、劃線、25℃培養(yǎng)。重復3次，分離純化得到單菌株。觀察單菌落的形態(tài)特點，采用基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取DNA，置于-20℃冷凍保藏，備用。

1.3 菌株鏡檢

取50 g感病小麥放入200 mL三角瓶，加入100 mL純水和40μL吐溫20，Parafilm膜封口，200 r/min振蕩5 min。紗布過濾，濾液導入50 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。沉淀物中加適量席爾氏液混勻，取20μL滴到載玻片上，在顯微鏡20倍和40倍下進行觀察。

1.4 菌株DNA鑒定

將病原菌微生物劃線培養(yǎng)3次，采用通用引物ITS1和ITS4，對提取的病原菌DNA樣本進行PCR擴增。擴增體系50μL：DNA模板4μL、dNTPs(10 mmol/L)1μL、ITS1(10μmol/L)2μL、ITS4(10μmol/L)2μL、10×Buffer(含25 mmol/LMgCl2)8μL、Taq聚合酶（5 U/μL）1μL、ddH2O 32μL。PCR反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸50 s，33個循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物用通用型DNA回收試劑盒（天根生化科技有限公司）純化，純化產(chǎn)物送深圳華大基因股份有限公司進行序列測定，在NCBI數(shù)據(jù)庫進行核酸比對，獲取同源比對序列最相似物種。

1.5 菌株細胞膜磷脂脂肪酸鑒定

在小麥病變區(qū)采集生物樣本，取樣量介于0.070～0.190 g，放入10 mL的10 mmol PBS緩沖液渦旋混勻，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，漂洗3遍，稱量沉淀物確定生物取樣量。沉淀物置于8 mL試管中，用1 mL皂化試劑（300 g/L NaOH溶液∶甲醇=1∶1）提取，并置于100℃沸水水浴30 min。用自來水冷卻試管，加入2 mL甲基化試劑（H2O∶甲醇∶HCl=22∶46∶32）?；旌蠝u旋混勻，80℃水浴10 min，待溶液冷卻至室溫后，加1 mL預混溶劑（正己烷∶甲基叔丁基醚=1∶1）萃取。將其置于旋轉(zhuǎn)器中，輕輕倒轉(zhuǎn)10 min，取出并丟棄水相。使用3 mL的5%NaOH溶液作為堿洗樣品，對上層有機相進行GC-MS分析[20]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

通過Canoco 5軟件對生物取樣量與鏈格孢菌細胞膜PLFA響應值進行冗余分析。利用SPSS25.0軟件對生物取樣量與PLFA種類進行相關性分析，并在α=0.01和0.05水平上檢查其顯著性。根據(jù)Matlab R2014a軟件的多元線性回歸方法，建立依靠PLFA特征峰響應值追溯鏈格孢菌生物攜帶量的數(shù)學量化模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病菌株的形態(tài)特征和DNA鑒定

通過相差顯微鏡觀察（圖1），在PDA培養(yǎng)基上菌落呈絮狀，內(nèi)部為淡綠色，邊緣為灰白色，培養(yǎng)基背面為黑褐色。分生孢子梗單生，直立或膝狀彎曲，有分隔。分生孢子鏈生，卵形或倒梨形，表面具橫隔和縱隔，成壁磚狀結(jié)構(gòu)，橫隔較粗。根據(jù)菌物培養(yǎng)性狀、分生孢子的成鏈特征和形態(tài)等，尤其是典型的分生孢子特性[21]，可初步確定所分離的真菌為半知菌類鏈格孢屬鏈格孢菌（Alternaria alternata）。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果，同源性超過99.99%，確定病原菌為鏈格孢屬鏈格孢菌。

圖1 鏈格孢菌的菌落、孢子和孢子絲形態(tài)特征Fig.1 Appearance characteristics of the colonies，spores and spore filaments of Alternaria alternata

2.2 致病菌株的PLFA分布特征

通常，磷脂脂肪酸的命名采用分子通式X:Y wZ(c/t)iso/anteiso。其中，X表示主鏈上的碳原子個數(shù)，Y表示雙鍵的個數(shù)，w表示雙鍵，Z則代表雙鍵的位置，即雙鍵距離分子末端碳原子的個數(shù)，c（cis）、t（trans）則表示分子的順、反式結(jié)構(gòu)，iso和anteiso表示甲基分別在距離分子末端第2、3個碳原子上的位置。

在該菌株的細胞膜中共測出15種磷脂脂肪酸，其中，前4種脂肪酸含量約占總量的80%（圖2）。含量最高的是18:2 w6,9c，占比超過38%。由于18:2 w6c和18:3 w6c是典型的真菌特征脂肪酸[22]，因此，由該類脂肪酸含量較高推斷該菌株屬于真菌。18:1 w9c表征常見的有致病特征的真菌脂肪酸[23]，其占比也達到了16.95%。直鏈飽和脂肪酸16:0、18:0、14:0占比分別達到15.21%、4.56%、2.06%，相較于其在細菌細胞膜中的含量和差異性，飽和脂肪酸在現(xiàn)有報道中，常用于表征細菌菌株[23]。15:0 iso占比8.58%，是最有潛力的特征脂肪酸。剩余脂肪酸的占比都不高于5%，如直鏈飽和脂肪酸17:0 iso、15:0 anteiso、16:0 iso，以及不飽和脂肪酸16:1 w7c，其占比分別為2.36%、1.52%、1.38%、2.30%。本研究計劃從上述磷脂脂肪酸中篩選出適合的特征脂肪酸，構(gòu)建Alternaria alternata的PLFA指紋圖譜。

圖2 致病菌株的PLFA分布Fig.2 PLFA distribution of pathogenic strains

2.3 小麥病變區(qū)檢測出PLFA的生物取樣量

在排除儀器誤差的前提下，人為誤差需要避免?，F(xiàn)場檢驗檢疫中，由于不同檢驗員在取樣量上有差異，人為造成測得的磷脂脂肪酸（PLFA）響應值高低不一，顯著特征峰的出現(xiàn)不穩(wěn)定，阻礙了PLFA技術的廣泛應用。為此，需要量化鏈格孢菌檢驗的生物取樣范圍。根據(jù)上述歸納出的潛在指紋區(qū)范圍，研究不同生物取樣量對檢測出鏈格孢菌磷脂脂肪酸種類和分布的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同生物取樣范圍對磷脂脂肪酸種類和分布的影響Fig.3 Effects of different sampling ranges on the species and distributions of phospholipid fatty acids

當生物取樣量介于0.070～0.190 g時，15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c磷脂脂肪酸之和的平均占比超過50%，按從大到小排序依次為18:2 w6,9c＞15:0 iso＞15:0 anteiso＞16:1 w7c。當生物取樣量介于0.070～0.090 g時，18:2 w6，9c的平均占比達到47.02%左右，15∶0 iso的平均占比穩(wěn)定在2.87%，15:0 anteiso和16∶1 w7c的平均占比在0.83%；而當生物取樣量為0.190 g時，18:2 w6，9c的占比最大，為36.81%，15:0 iso的占比其次，為10.55%，15:0 anteiso和16:1 w7c的占比很少。由此可見，在0.190 g生物取樣量中脂肪酸的種類和分布與其他生物取樣量中的結(jié)果有明顯差異。t檢驗結(jié)果表明，當生物取樣量為0.190 g時，在α=0.01下，其磷脂脂肪酸的分布和種類有極顯著差異。當生物取樣量介于0.070～0.090 g時，其各種磷脂脂肪酸的種類和分布無顯著性差異。因此，小麥上病變部位的生物取樣范圍應確定為0.070～0.090 g。

2.4 致病菌株的特征脂肪酸種類確定

利用不同的生物取樣量與10種脂肪酸的占比變化進行相關性分析，結(jié)果見表1。15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c這4種脂肪酸與生物取樣量的相關系數(shù)高達1.00。同時，P值明顯小于顯著性水平0.05，說明15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c這4種脂肪酸與生物取樣量呈顯著線性相關。選取15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c、18:2 w6，9c 4種磷脂脂肪酸的PLFA響應值和生物取樣量進行冗余分析，如圖4所示。

表1 不同生物取樣量與PLFA種類之間的相關性分析Tab.1 Correlation analysisbetween different biological samples and PLFA species

圖4 生物取樣量與鏈格孢菌細胞膜PLFA響應值之間的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis between biological samples and PLFA response of Alternaria alternata

冗余分析圖中，2個矢量的夾角大小可以反映兩變量之間的相關程度，夾角越小說明相關程度越大，反之，則證明相關程度越小。從圖4可知，15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c這幾種磷脂脂肪酸響應值與生物取樣量之間的夾角都小于45°，均具有較強的相關性。脂肪酸與取樣量之間夾角大小的順序為：16:1 w7c＞18:2 w6，9c＞15:0 anteiso＞15:0 iso。這與相關性分析得出的結(jié)論相一致。由此可以判定，鏈格孢菌的特征脂肪酸為15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c。

2.5 利用PLFA特征峰響應值追溯鏈格孢菌生物攜帶量的模型建立

采用溯源的方法，根據(jù)已知鏈格孢菌的特征脂肪酸種類以及相對應的PLFA響應值，推算小麥上攜帶的鏈格孢菌生物量，建立理論模型。該模型是基于0.070～0.090 g鏈格孢菌取樣量進行的推算。

在相同的鏈格孢菌生物量下，不同磷脂脂肪酸種類的響應值整體上從大到小依次為18:2 w6,，9c＞15:0 iso＞15:0 anteiso，16:1 w7c＞15:0 iso的響應值相較其他脂肪酸明顯。磷脂脂肪酸響應值與生物量的相關性，由強到弱依次為15:0 iso＞15:0 anteiso＞18:2 w6，9c＞16:1 w7c，15:0 iso與鏈格孢菌的生物量相關性最大，綜上，可以嘗試單獨作為鏈格孢菌的判定標準。通過建立Matlab線性回歸模型，發(fā)現(xiàn)15:0 iso單獨與鏈格孢菌生物量呈良好的線性關系，15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c的綜合響應值與鏈格孢菌生物量同樣呈現(xiàn)明顯的相關，可以建立特征脂肪酸響應值與鏈格孢菌的生物攜帶量之間的量化關系雙重模型。

對15:0 anteiso、18:2 w6，9c、16:1 w7c的響應值與生物攜帶量之間進行多元線性回歸分析，得到理論模型（1）∶

公式（1）中，Y1為15∶0 anteiso、18:2 w6，9c、16:1 w7c回歸計算出的生物攜帶量，C15:0anteiso、C16:1w7c、C18:2w6,9c分別為15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6c，9c的響應值。此外，分析15:0 iso的響應值與生物攜帶量之間的線性回歸，整理出模型（2）∶

公式（2）中，Y2為15:0 iso回歸計算出的生物攜帶量，C15:0iso為15:0 iso的響應值。

圖5為利用病變小麥PLFA的響應值，構(gòu)建的小麥攜帶鏈格孢菌量的預測模型。通過Matlab線性回歸模型建立，發(fā)現(xiàn)15:0 iso單獨與生物攜帶量呈良好相關關系，15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c的綜合值與生物攜帶量也呈現(xiàn)明顯相關，因此，特征脂肪酸響應值與生物攜帶量之間的回歸關系需建立雙重模型。由圖5知，當鏈格孢菌生物量為0.075 g時，雙重模型會出現(xiàn)很大的誤差，多元線性回歸模型和單元線性回歸模型相比，單元線性回歸模型的誤差較大。隨著生物攜帶量增大，單元線性回歸模型的變化也較明顯。但是，由單元線性回歸模型推算生物攜帶量只需知道15∶0 iso的響應值，由多元線性回歸模型推算生物攜帶量需知道15:0 anteiso、18:2 w6，9c、16:1 w7c的響應值，相比之下，通過單元線性回歸模型推算生物攜帶量較為簡便。應該注意的是，在應用模型時應同時考慮Y1和Y2，只有當計算出的Y1與Y2的差值在0.001 8 g以內(nèi)，該模型才有實際應用的科學穩(wěn)定性。

圖5 基于PLFA響應值預測鏈格孢菌攜帶量的雙重線性回歸模型Fig.5 Double linear regression model based on PLFA response value to predict the carried amount of Alternaria alternata

3 結(jié)論與討論

隨著人民生活水平的提高，我國對中亞地區(qū)小麥等糧食的進口量日益增大，其中可能攜帶檢疫性致病菌。本研究經(jīng)過形態(tài)學和分子學鑒定，確定從通過中歐班列運輸進口的哈薩克斯坦小麥上分離得到的是半知菌類鏈格孢屬鏈格孢菌（Alternaria alternata）。鏈格孢菌是農(nóng)作物的主要致病菌之一，對農(nóng)作物的危害巨大，如傳入我國，將對我國的經(jīng)濟作物造成不可預估的損失，嚴重影響我國農(nóng)產(chǎn)品的正常生產(chǎn)。鏈格孢菌適應性強，相對較低或較高的溫度只能減緩而不會抑制其生長繁殖，晝夜變溫更有利于孢子形成，其生長繁殖快，對營養(yǎng)要求低，產(chǎn)孢能力強，在一些廉價農(nóng)產(chǎn)品上均可大量產(chǎn)生孢子，連續(xù)黑暗、空氣充足條件下有利于產(chǎn)孢[24]。因此，在中歐班列的長途運輸中，很容易產(chǎn)生大量孢子，影響小麥品質(zhì)。鏈格孢菌細胞壁降解酶和毒素在侵染作物過程中大量累積，給農(nóng)產(chǎn)品食用安全帶來隱患。DNA分子鑒定可將微生物鑒別到種，但提取步驟煩瑣，對儀器要求較高，工作環(huán)境潔凈度要求苛刻，商品化測序耗時較長，不是鑒定進口小麥的便捷方式。

對比之下，采用磷脂脂肪酸分析法對進口小麥中鏈格孢屬真菌進行鑒定，簡單實用。首先，需要對生物取樣量確定其范圍，大于某一閾值后，各種磷脂脂肪酸響應值所占百分比會發(fā)生顯著性變化。研究確定鏈格孢菌的生物取樣量應介于0.070～0.090 g。采用GC-MS對菌株的磷脂脂肪酸進行分析，結(jié)果穩(wěn)定。經(jīng)冗余分析和相關性分析，小麥中鏈格孢屬真菌細胞膜的特征脂肪酸為15:0 iso、15:0 anteiso、16:1 w7c和18:2 w6，9c。

利用特征脂肪酸與鏈格孢菌生物量之間的相關關系，建立雙重回歸理論模型：

Y1為15:0 anteiso、18:2 w6，9c、16:1 w7c回歸計算出的生物量；Y2為15:0 iso回歸計算出的生物量。基于對鏈格孢菌的特征脂肪酸種類、不同生物取樣量以及相對應的PLFA響應值的分析，由模型可以推算小麥攜帶的鏈格孢菌生物量，量化小麥攜帶的致病菌量。為防止進口小麥攜帶檢驗檢疫性真菌病害，減小潛在危害，提供一種既快速又簡便的檢驗鑒定方法。

在實際操作中，從進口小麥上分離、獲取一定量的生物磷脂脂肪酸，測得PLFA響應值，推算出小麥可能攜帶的病菌量。這樣省去病菌純化、DNA提取并測序的煩瑣過程，使檢驗檢疫過程趨于簡化，結(jié)果更加穩(wěn)定。特征脂肪酸的確立，能幫助檢疫工作鑒定小麥攜帶病菌的微生物屬群，但要想建立出入境檢驗檢疫病菌特征脂肪酸文庫，還需要進一步的深入研究。此外，這種方法可以幫助初步判定進口小麥攜帶的病菌量，該檢疫技術不僅能定性，還可定量，為今后的檢疫管理提供了寶貴的科學依據(jù)。