焦耀磊，王春生，曲 碩，孫珊珊，朱婷婷，趙 賀，王丕武

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

近幾十年，世界人口數(shù)量大幅增長(zhǎng)，糧食產(chǎn)量供給不足成為當(dāng)代人面臨的一大問(wèn)題[1-2]。影響農(nóng)作物產(chǎn)量的因素除了耕地面積外，還有自然環(huán)境，包括非生物脅迫（干旱、高鹽、低溫、高溫等）和生物脅迫（真菌、細(xì)菌、病害、蟲(chóng)害等），其中病害導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量下降10%～15%[3]。CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISRP-associated nuclease 9）技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的第3代基因組編輯技術(shù)，它是一種能夠研究基因功能并且提高作物產(chǎn)量的手段[4-5]，從在植物上第一次應(yīng)用至今近10 a時(shí)間，研究人員利用該技術(shù)在植物領(lǐng)域進(jìn)行了大量研究工作。目前，基因組編輯技術(shù)共出現(xiàn)了3代。第1代基因組編輯技術(shù)是ZFNs（Zinc finger nucleases）[6-8]，優(yōu)點(diǎn)是可與細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)機(jī)制共同發(fā)揮作用，使研究者自如地編輯基因組，具有高度特異性，因而避免了免疫應(yīng)答；缺點(diǎn)是需要組裝復(fù)雜的蛋白質(zhì)序列，導(dǎo)致構(gòu)建難度較大，并且容易發(fā)生脫靶現(xiàn)象、導(dǎo)致細(xì)胞死亡。第2代基因組編輯技術(shù)是TALENs（Transcription activator like effector nucleases）[9-12]，優(yōu)點(diǎn)是在很大程度上避免了脫靶現(xiàn)象，構(gòu)建復(fù)雜蛋白質(zhì)序列時(shí)較第一代技術(shù)簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是該技術(shù)易受環(huán)境影響。第3代基因組編輯技術(shù)是CRISPR/Cas9，與前2代技術(shù)相比，優(yōu)點(diǎn)是僅需設(shè)計(jì)和構(gòu)建幾十個(gè)堿基的CRISPRRNA序列即可，用時(shí)更少且簡(jiǎn)便、突變效率高；缺點(diǎn)是易發(fā)生脫靶現(xiàn)象，而且靶突變驗(yàn)證難度高，目前該技術(shù)已被應(yīng)用于多種生物的基因組定向編輯[13-16]。綜述了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、分類(lèi)、作用機(jī)制及在作物遺傳改良中的應(yīng)用進(jìn)展，并探討了其存在的問(wèn)題，展望了其應(yīng)用前景。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)介紹

1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展史

20世紀(jì)80年代末，日本科學(xué)家ISHINO發(fā)現(xiàn)大腸桿菌基因組中堿性磷酸酶同工酶基因IAP上游存在一系列間隔的重復(fù)序列[17]。研究人員對(duì)大腸桿菌進(jìn)行基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)許多單拷貝的前導(dǎo)序列和多拷貝的短序列。隨后，有更多的相似位點(diǎn)在細(xì)菌和古細(xì)菌中被測(cè)出[18]。多位科學(xué)家認(rèn)為，該結(jié)構(gòu)能在DNA修復(fù)和基因調(diào)控中起作用[19-20]。2002年，JANSEN等[21]在細(xì)菌與古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了新的重復(fù)序列家族，該重復(fù)序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為25～37 bp的序列片段與非重復(fù)的間隔序列交替出現(xiàn)，因?yàn)楹塑账嵝蛄信c片段大小在同一物種內(nèi)高度保守，種間則無(wú)相似性，JANSEN依照此結(jié)構(gòu)將其命名為成簇的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列，即CRISPR。2005年，BOLOTIN[22]發(fā)現(xiàn)，CRISPR中的這些短序列來(lái)自病毒和質(zhì)粒，對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Cas蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其具有核酸酶和解旋酶活性[23-24]。隨后人們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas系統(tǒng)是存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[25]。2007年，BARRANGOU等[26]通過(guò)對(duì)嗜熱鏈球菌進(jìn)行試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了CRISPR/Cas系統(tǒng)的適應(yīng)性免疫過(guò)程，噬菌體侵染細(xì)菌后，細(xì)菌會(huì)從噬菌體基因組中將一段序列整合進(jìn)自身基因組成為新的間隔序列，形成了特異性抵抗噬菌體的表型。2012年，成熟的crRNA（CRISPR RNA）被鑒定為與Cas蛋白相關(guān)的引導(dǎo)序列，有助于細(xì)菌對(duì)外源DNA的抵抗[27]。2013年，CONG等[28]使用人工設(shè)計(jì)的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功誘導(dǎo)人和小鼠基因組的靶向切割，證實(shí)了RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas9技術(shù)具有廣泛適應(yīng)性。ANDRIY等[29]利用CRISPR/Cas9技術(shù)在雙RNA復(fù)合物的引導(dǎo)下成功對(duì)肺炎雙球菌和大腸桿菌基因組進(jìn)行定點(diǎn)突變，證明了該技術(shù)在細(xì)菌基因組中進(jìn)行編輯的可行性。

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類(lèi)

CRISPR/Cas系統(tǒng)中Cas核酸酶能夠通過(guò)引導(dǎo)RNA（Guide RNA，gRNA）的協(xié)助定點(diǎn)編輯基因組DNA。Cas蛋白作為一種核酸酶能夠在gRNA與外源DNA序列互補(bǔ)后定點(diǎn)切割外源基因序列。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，CRISPR/Cas系統(tǒng)的成熟是通過(guò)產(chǎn)生種類(lèi)不同的Cas蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的[30]。MAKAROVA等[31]根據(jù)Cas蛋白的類(lèi)別將CRISPR/Cas系統(tǒng)劃分為3種類(lèi)型。Ⅰ型系統(tǒng)包括6個(gè)Cas蛋白，其中以Cas3蛋白為標(biāo)志性蛋白質(zhì)。Cas3蛋白包含SF2(Superfamily-2)解旋酶結(jié)構(gòu)域和HD(Histidine-aspartate domain)核酸酶結(jié)構(gòu)域，為主要功能蛋白，能促進(jìn)crRNA的合成，同時(shí)能在系統(tǒng)靶向干擾期間行使功能[32]。相較于其他2個(gè)類(lèi)型，Ⅰ型系統(tǒng)Cas蛋白在數(shù)量和復(fù)雜程度上位居第一。SINKUNAS等[33]以嗜熱鏈球菌為材料，發(fā)現(xiàn)Cas3蛋白能夠憑借其HD結(jié)構(gòu)域優(yōu)先選擇單鏈DNA為作用底物。另外，Cas3蛋白HD結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性是非ATP依賴(lài)性的，在對(duì)外源DNA切割時(shí)具有促進(jìn)作用。Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)以Cas9蛋白為主[34]。Cas9蛋白參與crRNA的合成[35]，含有HNH(Histine-asparagine-histine）核酸酶結(jié)構(gòu)域和RuvC(Crossover junction endodeoxyribonuclease）結(jié)構(gòu)域，能夠有效降解外源DNA和質(zhì)粒。HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域能夠特異性切割外源DNA與間隔序列的互補(bǔ)鏈，RuvC結(jié)構(gòu)域能夠切割另一條鏈[36-37]。Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)主要存在于古細(xì)菌中，大多數(shù)在臨床分離的致病菌中被發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)以Cas10蛋白為標(biāo)志性蛋白質(zhì)，對(duì)crRNA成熟起促進(jìn)作用。3種類(lèi)型系統(tǒng)各有特點(diǎn)，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅需Cas9蛋白即可起到使外源DNA雙鏈斷裂的作用，而且只需要gRNA引導(dǎo)即可發(fā)揮功能，而Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)需要復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)合物和多個(gè)RNA協(xié)助起作用。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被人們改良并應(yīng)用于多種生物基因組編輯[38]。

1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制

細(xì)菌與大多數(shù)古細(xì)菌在漫長(zhǎng)的生物演變過(guò)程中，已經(jīng)進(jìn)化出了由RNA引導(dǎo)的獲得性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要由CRISPR位點(diǎn)和與之相關(guān)的基因編碼，用于抵抗噬菌體侵染和質(zhì)粒轉(zhuǎn)移[39-41]。

一個(gè)典型的CRISPR/Cas系統(tǒng)是由CRISPR基因座和CRISPR相關(guān)基因（Cas）以及反式編碼RNA（Trans-acting CRISPR RNA,tracrRNA）構(gòu)成。當(dāng)噬菌體侵染時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)的免疫機(jī)制分為3個(gè)步驟進(jìn)行。首先，當(dāng)噬菌體首次侵染時(shí)，宿主體內(nèi)的蛋白質(zhì)復(fù)合體會(huì)與外源DNA靶標(biāo)PAM（Protospacer adjacent motif）進(jìn)行序列互補(bǔ)，將一小段外源DNA片段（原間隔序列）剪切并整合至宿主細(xì)胞CRISPR基因座中作為新的間隔序列保存[42]，從而保存了先前感染的遺傳記錄，這一過(guò)程使宿主能夠快速抵抗該入侵者的再次入侵[43]。其次，當(dāng)噬菌體再次侵染時(shí)，新的間隔序列和其他間隔序列共轉(zhuǎn)錄成一個(gè)pre-crRNA（包含重復(fù)序列和間隔序列），tracrRNA也將被單獨(dú)轉(zhuǎn)錄，pre-crRNA在Cas蛋白的催化作用下加工為成熟的crRNA[44]，值得注意的是，不同類(lèi)型系統(tǒng)中Cas蛋白種類(lèi)也不同。最后，成熟的crRNA與Cas蛋白將在tracrRNA指導(dǎo)下組裝成效應(yīng)復(fù)合物，成熟的crRNA中的間隔序列能與靶DNA序列互補(bǔ)，并引發(fā)Cas核酸酶對(duì)靶序列的特異性破壞，使得外源DNA功能缺失而失去對(duì)宿主的攻擊性。CRISPR/Cas系統(tǒng)的一個(gè)顯著特征是能夠識(shí)別外源DNA靶標(biāo)PAM并破壞外源核酸中的互補(bǔ)序列[45-46]。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)在作物遺傳育種中的應(yīng)用進(jìn)展

植物為人們提供食物、動(dòng)物飼料、藥品、化學(xué)品、可再生材料和生物燃料。人們通過(guò)對(duì)植物進(jìn)行培育來(lái)獲得人們需要的優(yōu)良性狀。常規(guī)育種方法依靠現(xiàn)有的自然遺傳變異，需要進(jìn)行長(zhǎng)期選育過(guò)程，才能將選定的性狀滲入到另一個(gè)優(yōu)良的品種中，且選育效果受到自然界中優(yōu)良等位基因的可用性限制。新的等位基因可以通過(guò)隨機(jī)誘變引入，但具有理想特性的突變體需要對(duì)大種群進(jìn)行大規(guī)模的篩選才能確定，而篩選耗時(shí)長(zhǎng)。因此，可以通過(guò)直接引入精確和可預(yù)測(cè)的基因組修飾來(lái)加速植物育種，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)功能完備，且可以同時(shí)對(duì)多個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行修飾。

NHEJ（Non-homologous end joining）介導(dǎo)的基因敲除是最簡(jiǎn)單的定向修飾形式，可用于消除對(duì)作物品質(zhì)有負(fù)面影響的基因。通過(guò)HDR(Homologous directed repair)插入序列，可以在確定的位點(diǎn)引入外源基因，促進(jìn)高水平轉(zhuǎn)錄，且不干擾內(nèi)源基因的功能。

2.1 CRISPR/Cas9技術(shù)在作物品質(zhì)改良育種中的應(yīng)用進(jìn)展

較高的稻米蛋白質(zhì)含量能夠降低其食用口感和蒸煮品質(zhì)[47-48]。稻米蛋白質(zhì)含量是一個(gè)復(fù)雜農(nóng)藝性狀，通過(guò)對(duì)相關(guān)基因的調(diào)控，在一定范圍內(nèi)降低蛋白質(zhì)含量可以改善口感。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)蛋白質(zhì)合成有重要作用[49]。WANG等[50]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因AAP6(Amino acid transporter gene 6)和AAP10進(jìn)行靶向敲除，所獲突變體的蛋白質(zhì)含量顯著降低，并且直鏈淀粉含量降低，為培育食用口感和蒸煮品質(zhì)理想的水稻品種提供了新的策略。醇溶蛋白是大麥中的一種儲(chǔ)存蛋白，與麥芽品質(zhì)負(fù)相關(guān)。LI等[51]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)大麥D醇溶蛋白（D hordein）基因進(jìn)行靶向敲除，共得到2個(gè)突變株系，轉(zhuǎn)錄組分析表明，突變體的D醇溶蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平比野生型低，該研究為培育高品質(zhì)麥芽品種提供依據(jù)。

WANG等[52]為研究CRISPR/Cas9技術(shù)在塊根作物中的應(yīng)用效果，分別選取淀粉型甘薯品種徐薯22和富含胡蘿卜素型的甘薯品種泰中6為研究對(duì)象，以2個(gè)淀粉合成基因GBSSⅠ(Granule-bound starch synthaseⅠ)和SBEⅡ(Starch branching enzymeⅡ)為靶基因進(jìn)行靶向敲除，其中GBSSⅠ基因控制直鏈淀粉的合成，SBEⅡ基因控制支鏈淀粉的合成，基因突變效率在62%～92%，突變體總淀粉含量無(wú)顯著變化，但徐薯22和泰中6的GBSSⅠ基因敲除突變體直鏈淀粉含量均下降，而徐薯22和泰中6的SBEⅡ基因敲除突變體中支鏈淀粉含量均下降。說(shuō)明CRISPR/Cas9技術(shù)是提高甘薯淀粉品質(zhì)和選育多倍體塊根作物的有效工具。植物脂肪酸成分配比對(duì)食用和加工品質(zhì)有重要影響，因此，對(duì)油料作物脂肪酸相關(guān)基因進(jìn)行改造成為育種目標(biāo)之一。油菜中脂肪酸脫飽和酶基因FAD2(Fatty acid desaturase-2)是影響其油酸、亞油酸和亞麻酸含量的關(guān)鍵基因。HUANG等[53]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)異源四倍體油菜中BnaFAD2基因的4個(gè)拷貝均進(jìn)行突變，所獲突變體與野生型相比，油酸含量顯著提升，最高達(dá)到80%，亞油酸與亞麻酸含量下降。

2.2 CRISPR/Cas9技術(shù)在作物產(chǎn)量提升育種中的應(yīng)用進(jìn)展

目前，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)作物產(chǎn)量性狀相關(guān)基因進(jìn)行靶向編輯能夠有效提高作物產(chǎn)量。

水稻GS3（Grain size gene 3）和Gn1a（Grain number gene 1a）基因分別控制水稻的籽粒大小和粒數(shù)。沈蘭等[54]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻GS3和Gn1a基因進(jìn)行靶向編輯，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化4個(gè)優(yōu)質(zhì)水稻品種，分別獲得了GS3和Gn1a的移碼突變體，突變體gs3和gn1a與野生型相比粒長(zhǎng)變長(zhǎng),千粒質(zhì)量增加；gs3突變體與gn1a突變體相比,穗粒數(shù)顯著增加。ZHOU等[55]針對(duì)J809、L237和CNXJ 3個(gè)優(yōu)質(zhì)水稻品種進(jìn)行產(chǎn)量相關(guān)性狀基因的QTL定位，發(fā)現(xiàn)了與籽粒大小相關(guān)的基因GS3、與籽粒長(zhǎng)度和質(zhì)量相關(guān)的基因GW2（Grain width and weight gene 2）、與籽粒數(shù)量相關(guān)的基因Gn1a，利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)3個(gè)基因進(jìn)行靶向編輯，水稻品種J809和L237的三重突變體的單穗產(chǎn)量分別增加了68%和30%，CNXJ的三重突變體僅表現(xiàn)為半矮化表型。水稻株高是與產(chǎn)量相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀，水稻擁有適宜的株高有利于抗倒伏、增加種植密度，進(jìn)而有利于產(chǎn)量的提高。在水稻中，GA20ox2是編碼GA20氧化酶的基因，其功能喪失可降低水稻株高。張笑寒[56]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)GA20ox2基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，所得突變株與野生型相比，株高顯著降低，其他農(nóng)藝性狀未發(fā)生變化，這為培育水稻新品種提供了依據(jù)。在多倍體油菜育種中，抗碎莢性是影響多倍體油菜產(chǎn)量的重要因素之一。ZAMAN等[57]利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)定向敲除影響油菜莢果形狀和大小的JAG（Jagged gene）同源基因JAG.A08，所得突變體與野生型比較，莢果開(kāi)裂區(qū)發(fā)生顯著變化，突變體莢果細(xì)胞變大，果實(shí)凹凸不平、體積變小，抗碎莢性提高2倍。

2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在作物抗逆育種中的應(yīng)用進(jìn)展

通過(guò)CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)作物抗逆基因進(jìn)行定向修飾，增強(qiáng)植株對(duì)環(huán)境的抗性，成為作物抗逆育種的一種有效方式。水稻RR22（B-type response regulator transcription factor 22）基因參與植物細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝過(guò)程，該基因功能缺失可顯著提高植物耐鹽性[58]。ZHANG等[59]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建OsRR22基因敲除載體轉(zhuǎn)入水稻中，所得T2突變株與野生型相比，苗期耐鹽性顯著提高。LIU等[60]從番茄中鑒定出1個(gè)LBDⅡ（Lateral organ boundaries domainⅡ）型基因家族LBD40（Lateral organ boundaries domain gene 40）基因，該基因能在植物根和果實(shí)中高表達(dá)，在PEG和高鹽的誘導(dǎo)下高表達(dá)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除番茄LBD40基因，獲得突變體，干旱脅迫處理后，與野生型比較，突變體的保水能力提高。

白葉枯病是影響水稻生產(chǎn)的嚴(yán)重病害之一，由黃單胞桿菌變種引發(fā)，能使水稻減產(chǎn)50%。郝巍[61]對(duì)水稻轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)1個(gè)易感白葉枯病的基因HW3（Rice bacterial blight susceptible gene），利 用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建HW3基因敲除載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入水稻中，對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行水稻白葉枯病菌株P(guān)XO99A的接菌處理，最終得到4株對(duì)PXO99A表現(xiàn)抗性的植株，說(shuō)明通過(guò)敲除水稻感病基因HW3可提高感病品種對(duì)白葉枯病的抗病性。稻瘟病作為水稻最具破壞性的病害之一，常造成水稻大量減產(chǎn)。水稻ERF922（Ethylene-responsive factor gene 922）基因能夠調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病的抗性。WANG等[62]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)ERF922基因進(jìn)行靶向敲除，所得突變植株表現(xiàn)出抗稻瘟病性，經(jīng)過(guò)純合加代后培育出抗稻瘟病品系。

2.4 CRISPR/Cas9技術(shù)在作物雄性不育性材料選育中的應(yīng)用進(jìn)展

雄性不育突變體和不育基因是作物雜交育種的珍貴資源。發(fā)展雜交制種技術(shù)，必須建立新的雄性不育突變系。CRISPR/Cas9技術(shù)非常適合針對(duì)基因組進(jìn)行靶向修飾，從而產(chǎn)生雄性不育突變體。

LI等[63]利用TaU3(Triticum estivumRNA polymeraseⅢpromoters U3)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)優(yōu)化后的CRISPR/Cas9載體，定點(diǎn)編輯3個(gè)小麥氧化還原酶同源等位基因NP1(No pollen 1)，得到完全雄性不育的突變體。劉玉琛等[64]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)番茄花器官調(diào)控基因AP3(APETALA 3)進(jìn)行突變，對(duì)所得陽(yáng)性突變株進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)PAM序列上游存在核苷酸缺失現(xiàn)象，該現(xiàn)象可能導(dǎo)致AP3基因編碼蛋白質(zhì)出現(xiàn)氨基酸缺失和基因表達(dá)提前終止情況；對(duì)突變株農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變株花瓣器官轉(zhuǎn)變成類(lèi)似萼片的結(jié)構(gòu)，原本雄蕊的位置被類(lèi)似心皮的結(jié)構(gòu)替代。SHEN等[65]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻雄性不育基因PTGMS2-2（Photoperiod-thermo-sensitive genic male sterile gene 2-2）進(jìn)行靶向修飾，得到了光周期/熱敏核不育系。CHEN等[66]構(gòu)建CRISPR/Cas9載體用于靶向敲除玉米MS8（Male sterility gene 8）基因，所得突變株獲得雄性不育表型，且突變基因符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，可穩(wěn)定傳遞到子代。

3 CRISPR/Cas9技術(shù)存在的問(wèn)題及前景

3.1 問(wèn)題

在過(guò)去的幾年里CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但該技術(shù)仍存在一些未完全解決的問(wèn)題，如脫靶現(xiàn)象、外源基因殘留等。

3.1.1 脫靶問(wèn)題 與ZFNs和TALENs基因組編輯技術(shù)相比，依賴(lài)于gRNA的CRISPR/Cas9技術(shù)在特異性識(shí)別方面更具有優(yōu)勢(shì)，但由于其編輯對(duì)象的基因組堿基數(shù)目龐大，相似片段也會(huì)廣泛存在，gRNA可能會(huì)識(shí)別靶點(diǎn)DNA以外的相似片段，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致Cas9核酸酶對(duì)基因組的錯(cuò)誤切割，引發(fā)脫靶現(xiàn)象。這種非特異性的基因組編輯易對(duì)編輯對(duì)象的生物學(xué)反應(yīng)造成不確定性，影響該技術(shù)在研究和實(shí)踐中的可靠性。

3.1.2 外源基因殘留問(wèn)題 從CRISPR/Cas9技術(shù)開(kāi)發(fā)至今，針對(duì)植物基因組編輯的常規(guī)方法是構(gòu)建含有g(shù)RNA和Cas9蛋白基因序列的載體，然后通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)等方法轉(zhuǎn)入受體，獲得基因組編輯突變植株，之后可經(jīng)過(guò)雜交或自交等方法剔除多余的外源基因。但質(zhì)粒在降解過(guò)程中可能會(huì)有未完全降解的小片段留在植物體內(nèi)，導(dǎo)致外源基因殘留。

3.2 前景

目前，研究人員針對(duì)脫靶現(xiàn)象不斷改進(jìn)該技術(shù)，使其降低脫靶率，解決外源基因殘留問(wèn)題。由于CRISPR/Cas9技術(shù)具有簡(jiǎn)單、高效等優(yōu)勢(shì)，所以該技術(shù)依然具有廣泛應(yīng)用于多種生物基因組編輯的前景。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)雖然是一個(gè)非常好的基因組編輯工具，但需要更詳細(xì)地研究脫靶突變的程度，以及不同但完全匹配的靶點(diǎn)之間的切割效率差異。研究人員可同時(shí)生產(chǎn)并測(cè)試多種gRNA，并且大力發(fā)展新一代測(cè)序技術(shù)，這將為比較CRISPR/Cas9技術(shù)在多個(gè)物種和不同細(xì)胞類(lèi)型中的應(yīng)用效果提供充足的依據(jù)。此外，分析Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)及其與gRNA和目標(biāo)DNA的相互作用將促進(jìn)更高效和特異性的新型核酸酶的開(kāi)發(fā)。通過(guò)對(duì)Cas9蛋白的深入研究，研究人員開(kāi)發(fā)出需要更長(zhǎng)PAM的Cas9蛋白（更長(zhǎng)的PAM在基因組中出現(xiàn)率更低），這可能會(huì)進(jìn)一步減少脫靶效應(yīng)。每一個(gè)涉及宿主-病原體相互作用的進(jìn)化過(guò)程都是一場(chǎng)通過(guò)適應(yīng)對(duì)手并產(chǎn)生新的對(duì)抗機(jī)制來(lái)戰(zhàn)勝對(duì)手的軍備競(jìng)賽。因此，一些病毒很可能已經(jīng)進(jìn)化出了能夠抵抗細(xì)菌免疫系統(tǒng)的調(diào)控因子，而這些尚未被發(fā)現(xiàn)的調(diào)控因子可能對(duì)病毒抵抗細(xì)菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)提供幫助。